【doc】软骨保护剂对Hartley豚鼠软骨组织和血清蛋白多糖的影响

【doc】软骨保护剂对Hartley豚鼠软骨组织和血清蛋白多糖的影响 软骨保护剂对Hartley豚鼠软骨组织和血清 蛋白多糖的影响 第37卷第2期 2008年3月 卫生研究 JOURNALOFHYGIENERESEARCH V01.37No.2 Mar.2oo8171 文章编号:1000—8020(2008)02—0171—04 软骨保护剂对Hartley豚鼠软骨组织 和血清蛋白多糖的影响 肖萍董妙珠洪新宇'王宁孙宇立仲伟鉴周志俊 复旦大学公共卫生学院教育部公共卫生安全重点实验室,上海200032 ? 论着? 摘要:目的观察软骨保护剂氨基葡萄糖(GS)和硫酸软骨素(CS)对原发性骨关节炎(OA)模型雌性 Hartley豚鼠膝关节软骨组织结构,组织成分以及血清中蛋白多糖含量的影响.120只2月龄雌性 Hartley豚鼠,随机分为三个试验组和一个空白对照组.三个试验组分别为:1g/kgbwGS组,0.5g/kgbwCS组, GS1g,kgbw+CS0.5g/kgbw联合使用组和蒸馏水对照组.自由饮水给予受试物,连续5个月.分别于给药 前,给药1个月,2个月,3个月,4个月和5个月后,每组各取5只动物膝关节进行组织病理学(HE染色)和组 织化学(PAS,AlcianBlue,和Mallory染色)检查以及血清蛋白多糖含量的检测.结果病理及组化检查:对照 组在实验开始1个月后软骨组织病理积分即不断增高;GS组在给药三个月后才开 始上升;CS组在给药的5 个月中病理积分增高缓慢,仅第4个月上升较明显;联合使用组在给药的5个月中 病理积分一直没有增高, 并且给药5个月后的病理积分显着低于同组给药前期的积分.血清蛋白多糖含量: 给药4个月后,Gs组,CS 组和联合使用组血清中蛋白多糖含量下降减少,与各自同期对照组相比差异均有 显着性(P<0.05).结论 氨基葡萄糖和硫酸软骨素对豚鼠原发性软骨组织退化的发生,发展,以及血清蛋白 多糖含量的下降均有延缓 及抑制作用.并且以两者的联合作用最强,显现出一定的修复作用. 关键词:氨基葡萄糖硫酸软骨素 中图分类号:R681Q53 Hartley豚鼠软骨组织蛋白多糖 文献标识码:A Effectofcartilageprotectiveagentsonhistopathological, histochemicalfeaturesofarticularcartilageandserum levelofaggrecaninHartleyguineapigs XIAOPing,DONGMiaozhu,HONGXinyu,WANGNing,eta1. SchoolofPublicHealth,FudanUniversity,KeyLab.ofPublicHealthSafety,MinistryofEduc ation,Shanghai200032,China Abstract:ObjectiveToobservetheeffectofglucosamine(GS)andchondmitinsulfate(CS)on histopathological, histochemicalfeaturesofarticularcartilageandontheaggrecansei1/mlevelinHartleyguine apigs:akindofprimaryOA animalmode1.Methods120femaleHartleyguineapigsaged2monthswererandomlydivide dinto3testgroupsanda 7APPLEYARDSJ,ANGELONIJ,WATKINSR.Arsenic—rich groundwaterinanurbanareaexperiencingdroughtandincreasing populationdensity,Perth,Australia[J].AppliedGeochem,2006,21 (1):83.97. 8李晓波,吴水波,顾平.铁盐和铝盐混凝微滤工艺除As(V)的比较 研究[J].环境科学,2007,28(10):2198.2202. 9USEPA.Method1311SW-846testmethodsforevaluatingsolidwaste: physical/chemicalmethodslMJ.WashingtonDC:GovernmentalPrinting 0ffice.1986. 10冯吉利,屈撑囤,麻妙锋.水泥基材固化含油污泥的析出性能[J]. 作者简介:肖萍,女,博士研究生, 安全性及生物效应评价,现工作单位: 室,E-mail:pxiao@scdc.sh.cn 1上海市疾病预防控制中心 2通讯作者 副主任医师,研究方向:化学物 上海市疾病预防控制中心毒理 能源环境保护,2005,19(1):40.42. 11ZHUCS,BAIGL,LIUXL,eta1.Screeninghigh—fluorideandhish- arsenicdrinkingwatersandsurveyingendemicfluomsisandarsenismin ShanxiprovinceinwestemChina[J].WaterRes,2006,4o(16):3015. 3022. 12金银龙,梁超轲,何公理等.中国地方性砷中毒分布调查(总报 告)[J].卫生研究,2003,32(6):519-540. 13张德利,王正辉,张向东.山西省砷中毒重点病区饮水含砷量及病 情调查[J].中国地方病学杂志,2006,25(1):67.69. 14李磊,朱伟,林城.骨架构建法进行污泥固化处理的试验研究[J]. 中国给水排水,2005,21(6):41-43. 15赵乐军,戴树桂,辜显华.污泥填埋技术应用进展[J].中国给水排 水,2004,20(4):27-30. 收稿日期:2007.06.20 172卫生研究第37卷 controlgroup,30animalsforeachgroup,ThethreetestgroupsrefertoGSgroup,CSgroupandcombinedgroup.GSgroup hasbeenadministratedwith1g/kgbwGS,CSgroupadministratedwith0.5g/kgbwCS,combinedgroupwith1g/kgbwGS +0.5g/kgbwCSandacontrolgroupadministratedwithdistilledwater.Theabovefoursubstancesweretreatedviaad limbitumforaperiodof5months.Beforedosingandaftereachmonthlytreatmentduringthefivemonths,kneejoints Cartilagespecimensfrom5guineapigseachgroupwereexaminedthroughhistopathologicalmethod(H.Estain)and histopathologicalmethod(AlcainBlue,PASandMallorystain),andtheSel'llmlevelsofaggrecanweredetected synchronously.ResultsDuringtheentire5monthsperiod,distinctpathologicallesionsappearedjustafterthefirstmonth incontrolgroup.Andthedistinctpathologicallesionsdidn'tappearuntilthethirdmonthendedinGSgroup.InCSgroup, moderatepathologicallesionswereobservedinthefourthmonth,whiletherewerealmostnoobviouslypathologicalchanges incombinedgroupduringthewholetestperiod.TheSel'llmlevelsofaggrecaninallthreetestgroupswerealldecreased slowerafter4monthstreatmentthanthoseinthecontrolgroup,withasignificantdifference(P<0.05).ConclusionGS andCScanpostponeandinhibitthepathologicalchangesofarticularcartilage,aswellasserumaggrecanlevelsdecreasein Hartleyguineapigs.TheeffectofGSandCSusedincombinationwasstrongerthanindividualGSandCS,showingarepair property. Keywords:glucosamine,chondroitinsulfate,Hartleyguineapig,articularcartilage,proteoglycan 骨关节炎(osteoarthritis,OA)也称为退行性骨关节病,主要 现为关节的疼痛和活动度的下降.它的发生主要与覆盖在 骨关节顶端的关节软骨受到了损伤有关.而蛋白多糖 (proteoglycan,PG)和胶原原纤维(collagen)又是组成关节软骨 的主要成份.当关节软骨因老龄,磨擦,负重,挤压等引起损 伤时,关节软骨的结构及其组份将发生改变.这些改变与关 节软骨的重要组份PG合成聚集的能力下降,丢失增加以及 胶原原纤维的生成减少密切相关'. PG由蛋白核心和连接在核心上的多条线性氨基葡聚糖 (glycosaminoglycan,GAG)链构成.GAG有多种侧链,而聚集素 (Aggrecan)是GAG侧链最多的PG,属软骨组织的主要PG.在 骨关节炎的病变早期,形态学还没有发生改变之前,软骨细胞 和机体中的生化代谢水平即PG的含量就会发生变化,因此 PG是反映软骨组织发生病变的早期指标. 氨基葡萄糖(glueosamine,GS)和硫酸软骨素(ehondroitin Sulfate,CS)是天然的化合物,存在于人和动物的软骨,肌腱和 韧带等组织中,都属于氨基多糖类.由于食物中不含GS和 cs,因此必须依靠生物体内合成.但随着年龄的增长,人体的 合成能力越来越低].有报道认为这类物质属于关节软骨的 保护剂,能延缓和抑制退行性骨关节炎J,因此越来越受到 人们的关注.但也有一些研究结果显示:目前认为Gs或cs 能有效预防和治疗退行性骨关节炎的依据尚不充分,机制尚 不清楚-8_.主要的原因为现有的研究多以临床研究为主,设 计存有缺陷.如一些早期的试验样本量较小,缺少安慰 剂和双盲随机原则以及时间跟踪短,观察指标以主诉症状为 主等不足之处].此外,采用动物模型和体外试验进行的作 用机制研究较少也是无法确切评价GS和cs的原因之一. Hartley豚鼠是一种原发性骨关节炎的动物模型.随着月 龄的增加,关节软骨组织将产生退行性的病理改变.2月龄 的雌性豚鼠处于临界状态,5月龄后即发展成典型的退行性 骨关节炎.其降解过程和发病机制与人类OA的发生发展十 分相似川.为此,本文利用原发性骨关节炎模型Hartley豚 鼠,就GS,CS以及两者联合作用对豚鼠膝关节软骨组织的结 构,组份以及体内PG含量的影响进行研究,为探讨GS和cs 对软骨组织的保护作用提供客观的动物实验依据. 1材料与方法 1.1试剂与仪器 试剂:氨基葡萄糖盐酸钠和硫酸软骨素,由海南养生堂药 业有限公司提供,纯度90%;蛋白多糖试剂盒(BIOSOURCEPG EASIAkit)(比利时BioSourceEuropeS.A生产).仪器:酶标仪 ELX800(美国Bio—Tek公司生产);水平摇床ZD9556型(太仓市 科教器材厂生产). 1.2实验动物及实验分组 2月龄雌性Hartley豚鼠120只,购于上海生旺实验动物 养殖有限公司,随机分为三个试验组和一个空白对照组.试 验组分别为:Gs组:GSlg/kgbw,CS组:CS0.5g/kgbw,联合使 用组:Gs1g,bw+CS0.5g/kgbw.空白对照组给予蒸馏水. 1.3实验步骤 预试验每日观察记录,获得豚鼠的饮水量在20Oml/kgbw 左右.GS和cs用蒸馏水溶解,根据每日饮水量分别配制成 不同的供试液:GS组:0.5%GSCS组:0.25%CS;联合使用组: 0.5%GS+0.25%CS.采用自由饮水法给予豚鼠,连续给药5 个月,每天记录饮水量.分别于给药前,给药1个月,2个月, 3个月,4个月和5个月后,每组各取5只动物进行病理,组织 化学的检查以及生化指标检测. 1.4病理及组织化学检查'" 1?4?1取材采用戊巴比妥纳(30mg/kg)静脉注射处死所有 动物,切取豚鼠左侧股骨与胫腓骨之间的膝关节软骨.用 10%的福尔马林溶液固定后,再用5%硝酸脱钙. 1?4?2包埋,切片脱钙后将组织进行纵切,常规石蜡制片 方法包埋,制成2,3m的切片. 1?4?3染色及镜检分别进行以下染色及显微镜读片. 1?4?3?1Harris氏苏木素和伊红(H.E)染色显示骨关节组 织的四层基本结构. 1?4?3?2过碘酸一雪夫氏(PAS)染色主要反映软骨组织和 基质中中性蛋白粘多糖的含量. 1?4?3?3奥辛兰(AleianBlue)色主要反映软骨组织和软 骨细胞基质中酸性粘多糖(硫酸软骨素)的含量. 1?4?3?4马尔氏(Mal1ory)染色主要反映软骨组细胞基质中 胶原原纤维的数量和纤维化程度. 第2期肖萍,等.软骨保护剂对Hartley豚鼠软骨组织和血清蛋白多糖的影响l73 1.5病理检查结果的积分评分 1.6生化指标检测 PGELISA法(固体酶促敏感免疫法),在490nm处测 定豚鼠血清中蛋白多糖的主要成分聚集素的含量. 1.7数据分析 病理评分结果进行秩和变换后,和血清聚集素含量均采 用SPSS13.0统计分析软件中的方差分析F检验和两两比较 的检验方法对数据进行统计学分析. 2结果 2.1病理及组织化学检查 分别对每只豚鼠软骨组织的每一种染色结果进行评分. 每组的病理检查结果的积分即组中每个级别的每一种染色的 检查积分之和. ,对照组在实验开始1个月后软骨组织病理 从表l可知 积分即不断增高;cs组在给药后3个月病理积分开始上升, 与同组的给药前期相比差异显着(P<0.001).cS组在给药 后2个月病理积分开始上升(P<0.001),但给药5个月后又 开始下降,与同组的给药前期相比没有差异.联合使用组在 给药的5个月中病理积分一直没有增高,而且给药5个月后 的病理积分显着低于同组给药前期的积分(P<0.001).同 时,各试验组与同期对照组相比差异均有显着性(P<0.001), 仅GS组第4个月时的病理积分与同期对照组相比差异无显 着性(P>0.05). 2.2生化检测 表1不同给药时间豚鼠膝关节软骨组织病理及组化检查结果(":动物数5x染色标本数4) Table1Resultofhistopathologicalandhistochemicalexaminationofarticularcartilageamo ngdifferentadministratedtime 注:(1)试验组与各自同期的对照组进行比较,(2)不同给药时期与同组的给药前期进行比较 表2不同给药时间豚鼠血清聚集素含量测定结果 Table2Serumlevels(ng/ml."=5)ofAggrecaninguineapigsamongdifferentadministratedti mes(n=5)ng/ml 注:(1)与对照组进行比较,P<0.05,(2)不同给药时期与同组的给药前期进行比较P<0.05 从表2可见,各组随着豚鼠月龄的增大,血清中聚集素的 含量在下降.给药的前3个月,与同期的对照组相比,各试验 组血清中聚集素含量差异均无显着性(P>0,05)(除GS组给 药2个月后),但各试验组的下降呈现缓慢的趋势.同时在给 药3个月后,各组的聚集素含量出现了反弹;给药4个月后, 各试验组血清中蛋白多糖含量下降减少,与各自同期对照组 相比显着性差异均有(P<0,05). 3.讨论 本实验选择雌性动物2月龄至7月龄的生长期作为干预 期,可连续观察GS和cS对OA整个形成过程的影响.从病 理检查结果可见随着豚鼠月龄的增大,软骨组织在发生进行 性的病理改变.关节软骨的退化始于2月龄,3至5月龄仍处 于可逆阶段,6,7月龄破坏丢失程度严重,修复困难.说明雌 性Hartley豚鼠是研究骨关节保护剂和治疗骨关节炎药物的 一 种理想的动物模型. 本实验选择了PAS染色,AlcainBlue染色来检查组织基 质中PG的水平.同时测定了血清中聚集素的含量,可以间 接地反映软骨组织中PG的水平.从实验结果可见,病变早 期血清中PG含量的下降水平较软骨组织中的大.这是因为 当软骨组织中的PG储量下降时,血清中的PG可以向骨组织 中转移,以维持其正常水平.病变中期血清中的PG发生了 代偿性的升高,而病变后期无论是软骨基质中,还是血清中都 无法避免PG的大量丢失.提示血清中的PG较软骨中的PG 波动大. 关节软骨的退化过程可表现为组织四层结构的改变,软 骨细胞变形,死亡;基质中胶原原纤维逐渐减少外露,蛋白粘 多糖发生不同程度的丢失等.本实验为了能直观地比较 174卫生研究第37卷 和评价Gs和cs对软骨组织的影响及其作用程度,将病理和 组化的检查结果按照传统的病理分级方法进行了相应的分 级,并将分级资料进行秩变换后进行了统计分析,同时可以获 得定性和定量的结果. 国外早将Gs和cs用于OA的治疗.大多数l临床试验显 示对于OA患者,口服GS能有效地缓解疼痛,提高关节的活 动度;口服cs除了能提高关节活动度,还能减小关节间隙的 宽度.通常Gs和cs是联合使用的,对于仍处于可逆状态的 中等程度的膝关节炎患者,联合使用可以改善症状,提高关节 功能.因此两者单独使用或是联合使用都能缓解膝关节 炎的病症.但是,还有一些研究报道了阴性的结果".美国 NIH曾经开展了一个大型的临床研究,采用多中心,双盲,随 机,平行安慰剂对照的方法,对1583名骨关节炎患者服用GS 和CS24周后的效果进行了评价.结果显示与安慰剂组相比, 无论是单独服用还是联合使用都没有明显的缓解疼痛的作 用.这说明l临床研究仍存有不确定因素.本研究为动物 实验,实验结果显示GS组在给药1个月时作用较强,2个月 后逐渐减弱,4个月后豚鼠软骨组织产生了退行性变;CS组在 给样的5个月中作用都比较均衡,仅第4个月的作用稍有减 弱;而联合组在给药的5个月中一直是作用最强的一组.并 且在给药5个月后软骨组织的结构状况及化学组份的含量优 于2月龄的状态,提示受试物对软骨组织的退化具有修复的 作用.此外,在实验后期各试验组均能维持豚鼠血清中聚集 素的含量,并且以联合组的作用较为明显.实验结果说明无 论是GS或cs的单独使用,还是联合使用,都能延缓和抑制原 发性骨关节炎动物模型雌性Hartley豚鼠膝关节软骨组织主 要组份的丢失和降解,维持软骨组织的正常结构;延缓和抑制 血清聚集素的下降.特别是联合使用的作用最强,具有一定 的修复功能,cs的作用强度其次,GS则相对较弱,这与临床 试验的结果报道相符合'.这可能与外源性的GS和cs 能刺激软骨组织合成PG和胶原蛋白,抑制一系列破坏软骨 组织酶的活性,如胶原酶和PG降解酶以及超氧自由基的产 生,调节对软骨有明显调节作用的细胞因子的水平(ILl, TGf1e,BMP等)作用机制密切相关川. 参考文献 1APPLETONCT,MCERLAIN,DD,PITELKAV,eta1.Forced mobilizationacceleratespathogenesis:characterizationofapreelinieal sur~cMmodelofosteoarthritis[J].ArthritisResTher,2007,9(1):R13. 2SONGRH.,mR,mRELLAMD,MALFAITAM,eta1.Aggrecan degradationinhumanarticulareartiIageexplantsismediatedbyboth ADAMTS-4andADAMTS.5[J].ArthritisRheum,2007,56(2):575. 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