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琼脂糖凝胶电泳

2017-09-25 4页 doc 15KB 41阅读

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琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 实验三 琼脂糖凝胶电泳 一、实验原理 琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化DNA 片段的常用技术。把DNA样品加入到一块包含电解质的多孔支持介质(琼脂糖凝胶)的样品孔中,并置于静电场上。由于DNA分子的双螺旋骨架两侧带有含负电荷的磷酸根残基,因此在电场中向正极移动。在一定的电场强度下,DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样,因而可依据DNA分子的大 A, 也可以分离相对分小来使其分离。凝胶电泳不仅可分离不同分子质量的DN 子质量相同,而构型不同的DNA分子。在电泳过程...
琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳 实验三 琼脂糖凝胶电泳 一、实验原理 琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化DNA 片段的常用技术。把DNA样品加入到一块包含电解质的多孔支持介质(琼脂糖凝胶)的样品孔中,并置于静电场上。由于DNA分子的双螺旋骨架两侧带有含负电荷的磷酸根残基,因此在电场中向正极移动。在一定的电场强度下,DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样,因而可依据DNA分子的大 A, 也可以分离相对分小来使其分离。凝胶电泳不仅可分离不同分子质量的DN 子质量相同,而构型不同的DNA分子。在电泳过程中可以通过示踪染料或相对分子质量参照物和样品一起进行电泳而得到检测。相对分子质量标准参照物相对可以提供一个用于确定DNA片段大小的标准。在凝胶中加入少量溴化乙锭(ethidium bromide, EB),其分子可插入DNA的碱基之间,形成一种络合物,在254,365nm波长紫外光照射下,呈桔红色荧光,因此也可对分离的DNA进行检测。 一般琼脂糖凝胶电泳适用于大小在0.2kb,50kb范围内的DNA片段。本实验介绍琼脂糖凝胶的制备以及琼脂糖凝胶电泳在DNA片段分离中的应用方法。 二、仪器及试剂 1.仪器及耗材: 水平电泳槽、电泳仪、凝胶成像分析系统、微波炉、微量移液器、透明胶带、点样板或parafilm、100 ml或250 ml锥形瓶、量筒、吸头等。 2.试剂及配制: 50×TAE缓冲液的配制:2 mol/L Tris-乙酸,0.05 mol/L EDTA(pH 8.0) 配制1000 ml Tris 242 g 冰乙酸 57.1 ml 0.5 mol/L EDTA 100 ml 加入600 ml去离子水后搅拌溶解,将溶液定容至1 L后。高温高压灭菌,室温保存。 1×TAE缓冲液的配制: 称量20 ml的50×TAE缓冲液,再加入980 ml的去离子水。 溴化乙啶贮存液:10 mg/ml 溴化乙啶 配制:100 ml 称取1 g溴化乙啶,置于100 ml烧杯中,加入80 ml去离子水后搅拌溶解。将溶液定容至100 ml后,转移到棕色瓶中。室温保存。 6×上样缓冲液:0.25%溴酚蓝,0.25%二甲苯青FF,30%甘油。 配制:10 ml 溴酚蓝 25 mg 二甲苯青FF 25 mg 甘油 3 ml 用6×TAE缓冲液定溶至10 ml,分装成1 ml/管。-20?保存。 其它试剂:DNA样品、DNA Ladder 、琼脂糖、 琼脂糖凝胶电泳的操作步骤如下: 1. 制备1%琼脂糖凝胶(大胶用70ml,小胶用50ml):称取0.7 g(0.5 g)琼脂糖置于锥形瓶中,加入70 ml(50ml)1×TAE,瓶口 倒扣小烧杯.微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化,摇匀,即成1.0%琼脂糖凝胶液. 2. 胶板制备:取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净,晾干,放入制胶玻璃板.取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好,形成模子.将内槽置于水平位置,并在固定位置放好梳子.将冷却到65?左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上,使胶液缓慢展开,直到整个玻璃板面形成均匀胶层.室温下静置直至凝胶完全凝固,垂直轻拔梳子,取下胶带,将凝胶及内槽放入电泳槽中.添加 1×TAE电泳缓冲液至没过胶板为止. 3. 加样:在点样板或parafilm上混合DNA样品和上样缓冲液,上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1X.用10 ul微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内,每加完一个样品,应更换一个加样头,以防污染,加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面.(注意:加样前要先记下加样的顺序). 4. 电泳:加样后的凝胶板立即通电进行电泳,电压60-100V,样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动.电压升高,琼脂糖凝胶的有效分离范围降低.当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时,停止电泳. (5)电泳完毕后,取出凝胶,用含有0.5 ug/ml的溴化乙锭1×TAE溶液染色约20 min,再用清水漂洗10 min. (6)观察照相:在紫外灯下观察,DNA存在则显示出红色荧光条带,采用凝胶成像系统拍照保存. 凝胶电泳操作注意事项 作者:未知 来源:本站原创 时间:2005-11-29 实验仪器大全 实验试剂大全 1. 缓冲系统:在没有离子存在时,电导率最小,DNA不迁移,或迁 移极慢,在高离子强度的缓冲液中,电导很高并产热,可能导致DNA变 性,因此应注意缓冲液的使用是否正确。长时间高压电泳时,常更新缓冲液或在两槽间进行缓冲液的循环是可取的。 2. 琼脂糖:不同厂家、不同批号的琼脂糖,其杂质含量不同,影响 DNA的迁移及荧光背景的强度,应有选择地使用。 3. 凝胶的制备:凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致,溶解的凝胶应及时倒入板中,避免倒入前凝固结块。倒入板中的凝胶应避免出现气泡,影响电泳结果。 4. 样品加入量:一般情况下,0.5cm宽的梳子可加0.5ug的DNA量,加样量的多少依据加样孔的大小及DNA中片段的数量和大小而定,过多的量会造成加样孔超载,从而导致拖尾和弥散,对于较大的DNA此现象更明显。 5. 电泳系统的变化会影响DNA的迁移,加入DNA标准参照物进行判定是必要的。 6. DNA样品中盐浓度会影响DNA的迁移率,平行对照样品应使用同样的缓冲条件以消除这种影响。 7. DNA迁移率取决于琼脂糖凝胶的浓度,迁移分子的形状及大小。采用不同浓度的凝胶有可能分辨范围广泛的DNA分子,制备琼脂糖凝胶可根据DNA分子的范围来决定凝胶的浓度。小片段的DNA电泳应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳以提高分辨率。
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