微孔浊度法测定牛黄上清片抗菌效价的片、双黄连片的质量标准研究（可编辑）

微孔浊度法测定牛黄上清片抗菌效价的片、双黄连片的质量研究（可编辑） 微孔浊度法测定牛黄上清片抗菌效价的片、双黄连片的 质量标准研究 陕西中医学院 硕士学位论文 微孔浊度法测定牛黄上清片抗菌效价的片、双黄连片的质量标 准的研究 姓名:王光建 申请学位级别:硕士 专业:中药学 指导教师:张恩户 2011-04 摘 要 目的:设计不同的方法分别对牛黄上清片、芩连片和双黄连片进行提取，考 察所得到的提取物对六种不同标准菌株的药物敏感性，筛选出合适的实验药物和 敏感菌株。采用微孔浊度法研究得出牛黄上清片的适用剂量范围，建立量效标准 曲线，并且根据量效标准曲线测定牛黄上清片的效价、不同厂家和不同剂型牛黄 上清的效价，从而制定牛黄上清片的质量标准草案。 方法:采用正交实验设计得到三种药物的不同提取物，通过菌敏实验考察三 种药物不同提取物对六种标准菌株(大肠杆菌 ATCC 25922 、金黄色葡萄球菌 ATCC 25923 、铜绿假单胞菌ATCC 27853 、枯草芽胞杆菌 CMCC B 63501 、短 小芽孢杆菌 CMCC B 63202 、白色念珠菌 CMCC F 98001 )的敏感程度。根据 不同药物提取物的抑菌结果，选出三种药物中最适合应用生物检定法控制质量的 一个和敏感菌株。参照并运用中国药典(2010 版)二部抗生素效价测定的方法 和血清药理学，建立量效标准曲线，进行稳定性、重复性、回收率等方法学考察。 据量效标准曲线测定牛黄上清片的效价、不同厂家和不同剂型的牛黄上清根 的效 价。 结果:牛黄上清片、芩连片和双黄连片的不同提取物对六种标准菌株均显现 出了抑菌效果，但是以牛黄上清片加 10 倍量的水煎煮 1.5h，加 50%乙醇沉淀后 的提取液对金黄色葡萄球菌的抑杀最为明显，选它为供试品、金黄色葡萄球菌为 实验菌株。当黄芩苷和栀子苷以 5:2 混合后，浓度在 0.016,0.080g/mL 范 围内 时,两种成分混合的浓度对数剂量和效应呈线性关系，且相关性良好(r 0.9893 ); 根据混合物的量效曲线测定三个不同厂家的牛黄上清片的效价按从大到小顺序 分别:丙厂 lgR 1448.28U/g、甲厂 lgR 1431.03U/g、乙厂 lgR 1396.55U/g ;牛黄 上清片不同剂型的效价按从大到小顺序分别:丸剂 lgR 1633.33U/g 、胶囊剂 lgR 1416.67U/g、片剂 lgR 1383.33U/g 。 结论:微孔浊度法建立的牛黄上清片质量标准，结果可靠。在线性范围内， 采用一剂量法，以中成药中所含主要成分的适当配比制成的混合物做为对照品， 对此中成药进行生物检定，方法可行。 关键词:牛黄上清片 芩连片 双黄连片 微生物检定法 微孔浊度法 2 Niuhuangshangqing Tablet of bezoar supernatant turbidity microporous film of antibacterial potency ABSTRACT Objective: Designed to extract Niuhuangshangqing Tablet,Qinlian Tablet, Shuanghuanglian Tablet,study extracts role in six different bacteriostasis of the sensitivity ,selected appropriate experimental drugs and susceptible strains.With porous bacteriostasis obtained by turbidimetry of the dose range of application of test methods to establish the standard dose-response curve, and the determination of Niuhuangshangqing Tablet based on dose-response curves, Niuhuangshangqing Tablet made by different manufacturers and from different formulations of Potency , to develop quality standards of Niuhuangshangqing Tablet. Method:Three Drugs of different extracts by bacteria sensitive experimental study of three drugs of different extracts on the six bacteriostasis Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Bacillus subtilis CMCC B 63501, Bacillus pumilus CMCC B 63202, Candida albicans CMCC F 98001 antimicrobial activity.Selected the best experimental drugs and experimental bacteriostasis by the results.To establish dose-effect curves according to the bioassay method of antibiotic effect extent as described in Pharmacopoeia of the Peole’s Republic of China 2010 and plasma pharmacology,to check the stability, repeatability, recovery and other tests. According to the standard curve measured of Niuhuangshangqing Tablet different manufacturers and different dosage forms. Results:Niuhuangshangqing Tablet with 10 times the amount of water boiling 1.5h, plus 50% ethanol extract after precipitation as the test drug, Staphylococcus aureus as the test bacteriostasis, When baicalin and geniposide to 5:2 mixture concentration 0.016~ 0.080g/mL range, the concentration of two ingredients mixed effect on the number of dose and 3 response is linear, and a good correlation R 0.9893 ; based on a mixture of three different dose-response curve measured Niuhuangshangqing by descending order of potency were: Bingchang lgR 1448.28U/ g, Jiachang lgR 1431.03U/g , Yichang lgR 1396.55U/g; bezoar supernatant potency of different preparations of films by descending order were: pills lgR 1633.33U/g, capsules lgR 1416.67U/g, tablet lgR 1383.33U/g. Conclusion:Microbiological test method based on established quality standard of Niuhuangshangqing Tablet, results are reliabl. In a certain concentration range, to medicine in the major component made of a mixture of the appropriate ratio as standard, this proprietary biological testing, the method is feasible. ; Key Words Niuhuangshangqing Tablet Qinlian Tablet;Shuanghuanglian Tablet;Microbiological test;Microporous turbidimetry Author:Wang guangjian Tutor:Zhang enhu 4 陕西中医学院学位论文独创性声明及使用授权声明 学位论文独创性声明 本人郑重声明: 所呈交的学位论文，是个人在导师的指导下，独立进行研 无抄袭及编造行为。除文中已经特别加以注明引用的究工作所取得的成果， 内容 外，本论文不含任何其他个人或集体已经发或撰写过的作品成果。对本文的研 究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明并致谢。本人完全意 识到本声明的法律结果并由本人所承担的法律责任。 学位论文作者签名,,,,, 日 期: 年 月 日 关于学位论文使用授权的声明 陕西中医学院有权保留使用本人学位论文，同意学院按规定向国家有关部门 机构送交论文的复印件和电子版，允许被查阅和借阅。本人授权陕西中医学院可 以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩 印或其他复印手段保存和汇编本学位论文。可以公布(包括刊登)论文的全部或 部分内容。 (保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名,,,,,日 期: 年 月 日 论文导师签名,,,,,日 期: 年 月 日 1 微孔浊度法测定牛黄上清片抗菌效价的研究 引 言 一、研究背景和选题依据 中药多来源于自然界中植物的各个生长部位、动物器官及特殊产物和矿物，它们 都有着所含有效成分多而复杂的特点，要想弄清楚哪些成分在起药效作用是十分困难 的。所以如何能够更好的对中药的质量进行全面的控制，一直是中医药研究和生产的 热点和难点问题，这一问题也一直制约着中药向现代化和国际化发展。中药本身的有 效成分复杂且大多数结构不清楚，因而与化学合成药物由单一成分或几个特定成分组 成相比有显著的区别。加之中药的品种、采收时间、产地、贮藏、加工方法 等诸多因 素都会在一定程度上影响中药成分，造成作用成分有很大可变性，这样在中药的质量 控制上，仅仅像控制化学合成药物一样测定少数几种有效成分或指标成分，不足以确 况且在服用中药和制剂的过程中，在体内酶或者酸碱条保中药或制剂质量。 件下也可 能发生很多代谢反应，这样就导致其成分有很大的改变。因此，建立中药质量控制新 [1] 标准具有非常重要的意义 。 随着科技的进步，我们通过更多的检测手段和工具来控制中药质量，例如中药指 纹图谱技术，生物芯片技术等，但是这些技术有其先进性，也有不足的方面。他们多 是通过测定一个或几个中药成分来控制中药质量，即多是从一个局部去反应 整体。但 是往往一种药材含有的某一单独成分不可能完全代表它的功能和主治，且这一成分含 量的多少也不能和它的药效产生直接联系，如测定小檗碱不能区分是黄连还是黄柏， 以绿原酸作为忍冬单独依靠它们含量的多少也不能准确地反映质量的优劣; 藤、金银 花及菊花质量评价的指标不能充分体现三者的临床功效特点[2] 。因此，通过测定 1-2 个指标成分的方法较难全面科学地评价药材或其制剂的质量[3] 。 目前，在进行中药质量控制时，被广泛应用的中药指纹图谱技术存在一定的局限 [4] 性 。主要反映在以下几个方面:(1)已建立的中药定性鉴别方法有些难以找到特征 成分或标准对照药材，使得很多鉴别缺乏专属性和统一性。(2 )所选择的 指标性成分 是否与中药整体的药效相关,所选的成分能否真正代表中药的药效,如冬虫夏草测 定腺苷的含量，板蓝根检测告依春的存在，而腺苷和告依春既不是其有效成分，也不 实际意义[5、是专属性成分，检测它们来对中药质量进行控制有没有 6] ，这些问题都值 1 陕西中医学院2011届硕士学位论文 得商榷。(3 )中药指纹图谱的重现性、耐受性、专属性、量效关系以及谱效关系等方 面的内容还需更深层次的研究。某些中药即使检测的是有效成分，但往往量效关系不 明确，也难以实现对其质量的有效控制和评价。如人参的主要有效成分为人参总皂苷， 人参 主根 一般为 2% ，人参须约含 5%，人参叶竟高达 10%，但这样并不 能人参 叶和人参须的药效优于人参 主根 [7]，同时也说明通过这种方法检测的成分含量多少， 不能与药效成正比关系。一味中药可能含有几种或十几种化学成分，有些以至于含有 它们能否代表中药的功效，这还需要验证。况且，中药制几十种化学成分， 剂在服用 过程中可能产生其他新的成分，这样用这种细分法无疑南辕北辙，难以体现中医药的 整体观念，难以客观的评价中药质量和药效。因此，中药指纹图谱技术在一定程度上 忽略了中药成分与药效的关系。 中药的应用在我国有着悠久的历史，早在夏、商时期，人们就开始通过吃草药来 中药能够延续至今仍在使用，也说明它有很高的治疗疾病的治疗一些疾病。 价值。我 们长期使用中药治病的过程，其实就是一个临床试验的过程，虽然目前我们还不能完 全弄清楚每味中药治疗疾病的具体成分或物质基础，但是他却清楚的表现出来了临床 疗效。近年我们一直在努力实现中药的现代化，让中药清晰化，得到国际认可，但是 结果并不理想。中药之所以称作“ 中药”可能就是因为中药是中医传统理论和经验信息 的载体，如果剥除了它承载的中医传统的信息，将和其他任何国家的草药没有区别， [8] 只能沦为筛选单体活性成分的资源，传统的功能和主治必丧失殆尽 。因此，对于中 药的研究还是要从整体上入手，而不是将它分解成几个小的部分。 我国中医药工作者把大部分工作放在中药化学成分的研究中，致使化学成分与生 物活性研究的脱节，但至今大部分中药的有效成分仍未得以很好阐明。据统计，《中 国药典》2005 年版(一部)共收载中药材(含饮片和提取物)572 种，其中只有 60% 有过化学成分研究报道，约 20%进行过较系统的化学成分研究，至于已阐明其有效成 分的品种更是不到 5% 。即使明确了有效成分的中药，也存在量效关系不明确，或者 本身就没什么量效关系等问题。 基于现行中药质量控制的不足，我们初步提出了用生物检定法来对中药质量进行 控制和评价。当今社会所用的药物大体可以划分为三大类，即中药、化学合成药和生 目前，我国的中药基本上是“套用” 的化学合成药的质量控制模物制剂。 式，就是象化 学合成药一样，研究单一或几个成分。但从中药与生物制剂和化学合成药的物质内涵、 生产工艺与质量控制特点等方面，中药应“接轨”于生物制剂的主要以活性检测为 2 微孔浊度法测定牛黄上清片抗菌效价的研究 主的质量控制模式，而不应“迎合”化学合成药的以有效成分定量为主的质量控制模式 [9] 。三类药物在各方面的比较主要表现在以下三个方面:(1)中药特别是有效部位制 剂与众多的生物制剂有很大的相似性，即二者一般不是由单一化合物组成，而是由一 种甚至多种化合物组成，而化学合成药几乎都是由单一成分或几个特定成分组成。(2 ) 化学合成药的物质内涵和质量标准是唯一的，与制备工艺流程和条件无关;而生物制 剂和中药制剂的物质内涵和质量标准与制备工艺流程和条件关联密切，制备 工艺流程 或条件不同，生物制剂和中药制剂的物质内涵就不同。(3 )化学合成药主要采取化学 成分测定的方式，成分量与药效有直接关系;生物制剂主要采取生物效价检测的方式， 但其量的测定只作为纯度考察的参考指标，对生也有测定蛋白或氨基酸量， 物制剂的 质量控制不具有决定性意义;中药制剂采取的是化学定性鉴别和指标成分定量的方 式，一般没有生物活性或生物效价检测项[10] 。对于中药产品，从某种意义上讲，生物 活性或生物效价测定与化学成分测定相比，具有更大的实用价值和优势，不仅可以鉴 而且可以评价药效，甚至观察不良反应，适合于中药质量控定品种和质量， 制与评价 [11、12] 。中药是天然物质，化学成分复杂，与上述的生物制剂有许多相似之处，甚至 在某种程度上中药可视为天然环境条件中产生的生物制品。因此采用生物检定法控制 中药质量从理论上是可行的[13 ] 。 二、国内外研究现状和发展动态 结合现在多数国家用生物检定法控制抗生素和成分复杂的生物制剂的质量，大部 分中药来源于动植物，成分有很多不确定性，中药效价的生物检定法符合中医的整体 观，动物模型和体外试验方法又为此法奠定了基础，这些都为应用生物检定法控制中 药质量提供了参考。它的优势主要表现在以下几个方面:(1)直接考察中药的有效性 和安全性。(2 )有确切的量效关系，可为临床用药剂量提供参考。(3 )不用顾虑中药 具体的物质组成，不受物质基础研究进程的限制，符合中药物质基础研究现状及中医 理论。(4 )生物检定法不仅可量化中药的效价值，生物效应谱还可为中药品种、品质 定性鉴别提供重要依据[14、15 ] 。我国学者楼之岑早在 1950 年就利用小鼠服植物性泻剂 后排出湿便这一原理，建立了植物性泻剂的生物检定方法[16] 。这也为说明我们用生物 定法来控制中药质量有一定可行性。 检 生物检定法(Bioassay )是指包括整体动物、离体组织、器官、细胞和微生物等 3 陕西中医学院2011届硕士学位论文 评估药物生物活性的一种方法。它以药物的药理作用为基础，以生物统计为工具，运 用特定的实验设计在一定条件下比较供试品和相当的标准品或对照品所产生的特定 反应。通过等反应剂量比的运算或限值剂量引起的生物反应程度，从而测定供试品的 效价、生物活性或杂质引起的毒性。它属于定量药理学范畴 [17] ， 主要用于药物效价 的测定、建立检验方法、比较药物作用强度、微量生理活性物质的测定、残留农药的 测定等[18]，另外，特别适用于成分复杂、具有多种功能相似的已知和未知活性成分药 品的定量或半定量测定。但是，中药的生物检定法又不等同于一般的药理学实验方法， 须具备定量药理学和药检分析的双重属性和要求[19] 。因为大部分中药有效成分不明， 或者有效成分多而复杂;药材和制剂的含量测定限量缺乏有效剂量的概念;按传统医 学的观点分析，绝大多数的中药的性味、归经是清楚的，功效是具体明确的。这无疑 为生物检定法作为中药的质控指标加大了筹码。 生物检定法一直是测量抗生素的抗菌效价经典成熟的方法，而且成本不高，有相 当一部分抗生素药品采用此法测定含量。目前国际上通用的测定方法有管碟法和浊度 法。各国药典均有采用，我国药典亦收载了管碟法和浊度法。 管碟法是利用药物在培养基内的扩散作用，比较标准品和供试品两者对接种的试 验菌产生抑菌圈的大小，以测量供试品效价的一种方法。它的特点为结果较稳定，基 本操作和设计适用比较广泛，并适用于多批样品的测定。但它也存在一些问题，首先， 由于其原理是以扩散为基础，所以只要是能影响扩散的因素，就能影响测定结果的准 确性。由于抑菌圈的大小受扩散系数、扩散时间、药物的总量、培养基的厚度及最低 抑菌浓度等因素的影响，所以这些因素的不稳定性都会影响到实验结果的可 靠性。其 次，该测定方法又是以药物浓度与抑菌圈直径呈直线关系的平行线原理而设计的，因 此对影响直线的斜率、截距及直线平行的诸因素，也必须加以控制，方可保证检验结 最后，它要求样品和对照品基本相同，并且试验过程长 第 2 果的准确可靠。 天才能 得到结果 ，且是手工操作，可能产生的误差会更大[20] 。所以要想得到精确的实验结 果必须很好的控制这些可能影响到实验结果的因素。 比浊法是利用药物在液体培养基中对试验菌生长的抑制作用，通过测定培养后细 菌浊度值的大小，比较标准品与供试品对试验菌生长抑制的程度，以测定供试品效价。 比浊法与管碟法相比具有快速、准确、灵敏、精确度高的优点，在国际上这两种方法 是并存的，但在国内，基于测量仪器的限制，比浊法应用较少。《中国药典》2000 年 版收载有 24 个品种采用管碟法，从 2005 年版药典开始收载采用比浊法。且随着比 4 微孔浊度法测定牛黄上清片抗菌效价的研究 浊法测定的自动仪器的研制，采用在线测定吸光度的方法，进一步简化了本法的操作 过程，减小试验误差，有利于比浊法的推广和普及，其替代管碟法成为必然的发展趋 势[21] 。 基于本实验前已经对黄连、金银花、连翘、苦参、穿心莲、丹皮、板兰根、鱼腥 后来还研究了黄连上清草等常见的清热解毒药用生物检定法做了质量评价， 丸复方， 实验结果表明黄连、连翘、穿心莲等可以采用生物检定法进行质量控制[22-28] 。但是上 述实验均用的管碟法测定的药物效价，经过前期的研究，发现管碟法测定中药的效价 有标准曲线斜率太小，灵敏度不够的缺点，我们旨在用类似于比浊法的微孔浊度法做 进一步的实验。我们选取以下三种复方作为目标复方进行筛选。 牛黄上清片的组成包括人工牛黄 2g 、薄荷 30g 、菊花 40g 、荆芥穗 16g、白芷 16g、川芎 16g、栀子 50g 、黄连 16g、黄柏 10g、黄芩 50g 、大黄 80g、连翘 50g 、 赤芍 16g、当归 50g 、地黄 64g 、桔梗 16g、甘草 10g、石膏 80g、冰片 10g。主 要功效为清热泻火，散风止痛。用于热毒内盛、风火上攻所致的头痛眩晕、目 赤耳鸣、咽喉肿痛、口舌生疮、牙龈肿痛、大便燥结[29 ] 。 芩连片的组成包括黄芩 213g 、连翘213g 、黄连 85g、黄柏 340g、赤芍213g 、甘 草 85g。主要用于清热解毒，消肿止痛。用于脏腑蕴热，头痛目赤，口鼻生疮，热痢 [30] 腹痛，湿热带下，疮疖肿痛 。 双黄连片的组成包括金银花 1875g、黄芩 1875g、连翘 3750g 。主要用于疏风解 表，清热解毒。用于外感风热所致的感冒，症见发热、咳嗽、咽痛[31] 以上三个复方均收录于《中国药典》2010 版一部，其中牛黄上清片和双黄连片 还收录于 2009 年国家基本药品目录，所以它们的疗效相对来说都比较确切。三个复 方的药味分别是十九种、六种、三种，一定程度上代表了大、中、小三种复方。他们 都含有具有抗菌作用的药材黄芩、连翘等，所以选用这三个复方做为最初的 供试药。 通过微孔浊度法考察药物质量并试图建立相应的质量标准。 三、研究历史 其实生物检定是一门较老的学科，是药理学的一个分支，被认为属于定量药理学 的范畴，它在控制生物制品和抗生素质量上被广泛应用。早在很久以前，药理学家为 了弄清楚某些药物的作用强度，就设法用药物对生物体所产生的反应强度来表示，从 5 陕西中医学院2011届硕士学位论文 而引入了效价的概念。他们利用洋地黄能使青蛙死于心室停跳于收缩期，建立了早期 的洋地黄蛙生物检定法，并将青蛙每克体重所需的洋地黄致死用量称为洋地黄 1 个蛙 单位。早期的胰岛素兔生物检定法，是将能使家兔每 100ml 血液中血糖下降至 45mg 所需胰岛素的最低用量确定为胰岛素 1 个兔单位。这些活性单位都是“动物单位”，是 一种绝对效价的表示方法。1897 年 Ehrlich 提出将供试品与标准品对比的效价表示法， 即在相同的实验条件下，测得标准品与供试品产生相同生物反应时的剂量比值，作为 供试品相当于标准品的效价倍数，并于 1914 年制出白喉抗毒素的对照标准品，将供 试品与标准品在同一实验条件下比较其产生相同反应的剂量，从而计算出供试品相当 于标准品的效价。这种方法明显减小了由于生物差异性所产生的误差，它不同于“动 物单位”，而是以对照品与标准品对比的相对效价。这样，同一药物在不同实验室检 验时，即使实验条件和其他因素对生物反应产生影响，但对标准品与供试品 起着同样 的作用，在对比检定时可使各种影响因素彼此抵消，大大提高了生物检定的可靠性和 重现性，奠定了现代生物检定的基础。从此，人们彻底改变了用“动物单位”来表示效 ，而以对比检定和标准品的概念奠定了现代生物检定的基础。《中价的概念 华人民共 和国药典》(2005 版)规定洋地黄制剂的质量标准:洋地黄叶要保证同样洋地黄制剂 [32] 的各种商品的效价一致，而并不是为了使不同的精制强心苷效价相等 。 四、应用前景 目前，生物检定法广泛应用于药品 主要是生化药物 、生物制品的质量控制。各 国药典都有用生物检定法作为其质量控制的品种，如《美国药典》和《欧洲药典》中 将各种激素、细菌类疫苗、病毒类疫苗、免疫血清及毒素、人免疫球蛋白及凝血因子、 细胞因子、抗生素(美国药典 28 版收载 45 个抗生素品种采用微生物检定的方法测定 效价)洋地黄制剂等规定为用生物检定法作为其质量控制的品种 [33 ] 。这些品种都具 有药效成分不明确、药效成分太多或制剂含有非药效杂质较多的特点。从生物检定法 的定义及其应用范围来看，它是非常适合应用于中药的质量控制和评价。《中国药典》 2010 年版编制大纲业已指出:“ 中药质量标准要逐步由单一指标性成分定性定量测定 向活性有效成分及生物测定的综合检测过渡”[34 ]，并在《中国药典》一部附录部分新 加了中药生物活性测定指导原则，其实质就是用生物检定法控制中药质量。 因此，在 以后应用生物检定法控制中药质量可能会变的很普遍。 6 微孔浊度法测定牛黄上清片抗菌效价的研究 实验研究 牛黄上清片质量标准草案 牛黄上清片 Niuhuang Shangqing Pian 【处方】 人工牛黄 2g 薄荷 30g 菊花40g 荆芥穗16g 白芷16g 川芎16g 栀子50g 黄连16g 黄柏10g 黄芩50g 大黄80g 连翘50g 赤芍16g 当归50g 地黄64g 桔梗 16g 甘草10g 石膏80g 冰片10g 【制法】以上十九味，人工牛黄、冰片研细;黄连、大黄粉碎成细粉，过筛;连翘、 荆芥穗、薄荷提取挥发油，提取后的水溶液备用，药渣煎煮一次，滤过;黄芩、栀子、 桔梗、赤芍、当归、地黄、石膏、甘草加水煎煮二次，每次2小时，滤过，滤液合并; 黄柏、川芎、白芷用70%乙醇作溶剂进行渗漉，收集渗漉液，回收乙醇。菊花热浸二 次，每次2小时，滤过，滤液合并，并与上述提取液合并，减压浓缩至稠膏，加入黄 连、大黄细粉及辅料适量，混匀，制粒。低温干燥，再加入人工牛黄、冰片细粉，喷 入上述挥发油，混匀，制成1000片，包糖衣或薄膜衣，即得。 【性状】本品为糖衣片或薄膜衣片，除去包衣后显棕褐色至黑褐色;气微香，味凉、 苦。 【检查】应符合片剂项下有关的各项规定(中国药典2010年版一部附录I D)。 【含量测定】标准品的制备 精密称取黄芩苷和栀子苷适量，按5:2混合均匀，加水 溶解，用灭菌PBS液定量制成每1ml中约含1000单位的溶液，即得。 供试品的制备 精密称取本品适量，加水(1g加水10ml)煎煮1.5h，50%乙醇沉 淀，过滤，用灭菌PBS液定量制成每1g/mL的溶液，即得。 测定法 配制PH值7.0抗生素?号培养基和选取金黄色葡萄球菌标准菌株按照微 孔浊度法测定抗菌效价，可信限率不得大于12%。本品每1g的效价不得少于900黄 芩苷和栀子苷5:2混合物单位。 【功能与主治】清热泻火，散风止痛。用于热毒内盛、风火上攻所致的头痛眩晕、目 赤耳鸣、咽喉肿痛、口舌生疮、牙龈肿痛、大便燥结。 【用法与用量】口服。一次4片，一日2次。 【禁忌】孕妇慎用。 【规格】薄膜衣片 每片重0.265g 7 陕西中医学院2011届硕士学位论文 【贮藏】密封。 质量标准起草说明 【名称】牛黄上清片 Niuhuang Shangqing Pian 【处方】见标准正文 【制法】见标准正文 【含量测定】见下文 一、实验材料 1(1 药物与试剂 牛黄上清片 甲厂，批号:090415 ; 乙厂，批号:1003011;丙厂，批号: 20090102); 牛黄上清丸，北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂，批号:7621045 ;牛黄上清胶 囊，浙江康恩贝制药有限公司，批号:20100512 ;双黄连片, 陕西白鹿制药股份有限 公司，批号:100437;芩连片，北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂，9128022 ; 黄芩苷，含量 95% 以上，西安奥泽生物科技有限公司，批号:101006;栀子苷，含量 95% 以上，西安奥泽生物科技有限公司，批号:100921;大肠杆菌ATCC 25922 、金 黄色葡萄球菌 ATCC 25923 、铜绿假单胞菌 ATCC 27853 、枯草芽胞杆菌 CMCC B 63 501 、短小芽孢杆菌 CMCC B 63202 、白色念珠菌 CMCC F 98001 均购自中国药品 生物制品检定所;营养琼脂，北京奥博星生物技术有限责任公司，批号:20100720 ; 抗生素检定?号培养基，青岛高科园海博生物技术有限公司，批号:20100312 ;MH 肉汤，中国检验检疫科学研究院北京陆桥技术有限责任公司，批号:090409 。 1(2 主要仪器设备 ELx808 酶标仪，美国伯腾仪器有限公司公生产;超低温冰箱，美国热电公司生 产;分析天平，德国赛多利斯科学仪器(北京)有限公司;GNP-9162 隔水式电热恒 温培养箱，上海跃进医用光学器械厂;XD-101 投影摄影生物显微镜，江南器械厂; YX-280B 型手提式压力蒸汽消毒器，江阴滨江医疗设备厂;LG 家用冰箱，泰州乐金 电子冷机有限公司;SW-CJ-2FD 型双人单面净化工作台，苏州净化设备有限公司; KQ3200DB 型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司;SHB-?循环水多用真 空泵，郑州长城科工贸有限公司;电热恒温水浴锅，北京科伟;电子调温电热套，北 京科伟;XB-K-25 血小板计数板，上海求精;接种棒，姜堰市新康医疗器械有限公司; 孔细胞培养板，美国 Costar ;培养皿，扬州是创新医疗器械厂。 96 8 微孔浊度法测定牛黄上清片抗菌效价的研究 二、提取方法、实验药物和标准菌株的筛选 2.1 供试品的制备 分别取牛黄上清片(用刀片小心刮去糖衣)，芩连片，双黄连片适量，用乳钵碾 成细粉，备用。 2.1.1 采用水提醇沉法提取三种中成药 (1)称取牛黄上清片细粉5g，按表 1 的正交设计进行水提醇沉的提取，过滤， 滤液浓缩，最后定容为 10ml。最后制得9 份供试品分别编号:牛黄上清片 1.1、1.2、 1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9。置于4 ?下保存，备用。 (2 )按照上述方法，同样制得芩连片、双黄连片各九个供试品，置于 4 ?下保 存，备用。 表 1 三种中成药采用水提醇沉法提取的正交实验设计 因 A B C D 水 素 平 加水量 倍 乙醇量(倍) 乙醇浓度(% ) 煎煮时间(h ) 1 8 8 50 1 2 10 10 70 1.5 3 12 12 90 2 采用醇提水沉法提取三种中成药 2.1.2 (1)称取牛黄上清片细粉5g，按表2 的正交设计进行醇提水沉的提 取，过滤， 滤液浓缩，最后定容至 10ml。制得9 份供试品分别编号:牛黄上清片 2.1 、 2.2 、2.3 、 2.4 、2.5 、2.6 、2.7 、2.8 、2.9 。置于4 ?下保存，备用。 (2 )按照上述方法，同样制得芩连片、双黄连片各九个供试品，置 于 4 ?下保 存，备用。 表 2 三种中成药采用醇提水沉法提取的正交实验设计 因 A B C D 水 素 平 乙醇量 倍 乙醇浓度(% ) 加水量 ) (倍) 煎煮时间(h 1 8 50 8 1 2 10 70 10 1.5 3 12 90 12 2 9 陕西中医学院2011届硕士学位论文 2.2 三种中成药复方所得供试品的菌敏实验 分别用接种环小心挑取六种标准菌株适量，接种于 5ml 营养肉汤中，37?培养 12h，激活细菌。12h 后，用接种环沾取适量细菌液接种在营养琼脂斜面上，每种标 准菌株接种 10 个琼脂斜面，4 ?下保存，备用。 取六种标准菌株各一个斜面，用灭菌 PBS 缓冲液洗脱，制成细菌原液，移取 1ml 细菌原液至无菌试管中进行等倍稀释，同时用血细胞计数板对不同浓度的细菌液计 6 数，最后调整细菌浓度为 10 CFU/ml ，记录稀释倍数。根据PBS 缓冲液所稀释细菌 原液的倍数，用已灭菌抗生素?号培养基稀释成同样倍数的细菌悬液，当天配制当天 使用。 2.2.1 六种标准菌株生长曲线的测定 取无菌 96 孔培养板，第一列各培养孔分别加入 100μl 抗生素?号培养基(空白 6 对照)，从第二列依次加入 100μl 用抗生素?号培养基配制的细菌浓度均 为 10 CFU/ml 大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽胞杆菌、短小芽孢杆菌和白色念 珠菌的菌悬液，迅速放置于酶标仪中在 450nm 波长处测定各培养孔吸光度，并记录 各孔吸光度。然后置 37?培养箱(使用前进行校正)孵育，每隔 1h 测定 1 次，共 10 次。测定各孔的吸光度前，用移液器小心吹打各培养孔使其均匀，并记录各管吸光度。 各菌经培养后的吸光度为: 各时间段细菌生长吸光度 培养后吸光度(各加菌培养孔-空白对照孔) -培养前 吸光度(各加菌培养孔-空白对照孔) 得到六种标准菌株恒温培养 10h 后的生长曲线。见图 1-6。 图 1 大肠杆菌经培养 10h 的生长曲线 10 微孔浊度法测定牛黄上清片抗菌效价的研 究 图2 金黄色葡萄球菌经培养 10h 的生长曲线 图 3 铜绿假单胞菌经培养 10h 的生长曲线 图4 枯草杆菌经培养 10h 的生长曲线 11 陕西中医学院2011届硕士学位论文 图 5 短小杆菌经培养 10h 的生长曲线 图 6 白色念珠菌经培养 10h 的生长曲线 结果表明，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、短小芽 孢杆菌和白色念珠菌的对数生长期分别在 6-8h、5-9h、4-6h 、5-6h、5-8h 和 5-7h，所 以六种标准菌株在培养 6h 后均能进入生长对数期，在此时间点测定药物对细菌的作 用可以得到更好的反映。因此，确定细菌的培养时间为 6h 。 2.2.2 三种中成药复方不同提取物对六种标准菌株的敏感性研究 6 CFU/ml ， 采用二倍微孔等倍稀释法。细菌悬液的配制同 2.2 ，调整细菌浓度为 10 接种于 96 孔无菌培养板内。其中，除第 1 列为 100μl 抗生素?号培养基(空白对照)， 第 2 列每孔 100μl 细菌悬液(阳性对照)外，第 3 列第 1 行开始每孔 均加入 180μl 细 菌悬液，第 2-8 行每孔 100μl，共 11 列。各供试药加入培养孔之前，均用 0.22μm 微 12 微孔浊度法测定牛黄上清片抗菌效价的研究 20μl，加入第 3-11 列第 1 行孔滤膜过滤，再分别用已灭菌的移液器移取 已有细菌悬 液的培养孔内，用移液器小心吹打均匀，则此行各供试药的终浓度均为 500μg/mL 。 除第 1、2 列外，其余各列从第 1 行各孔中小心吸取 100μl 加入下行相应各培养孔， 混匀，依次进行等倍稀释，每次稀释务必混匀，最后，从第 8 行培养孔中吸取 100μl 弃去。迅速放置于酶标仪中，在 450nm 波长处测定各培养孔吸光度，并记录各孔吸 光度的值。然后置 37?培养箱培养 6h 后取出，用移液器小心吹打各培养孔以混匀， 再次测定各培养孔的吸光度，并记录各管吸光度值。各供试药抑菌的吸光度为: 各供试药抑菌的吸光度 培养后吸光度(各供试药培养孔-空白对照孔)-培养前吸 光度(各供试药培养孔-空白对照孔) 各供试药对细菌的抑杀作用由培养 6h 后含有供试药的培养孔与空白对照培养孔 的吸光度比较和涂布一定琼脂板得出。含供试药培养孔的吸光度差值低于或等于空白 对照培养孔的吸光度，此培养孔的药物浓度为最低抑菌浓度 minimal inhibition 50μl 含供试药细菌液涂布于营养琼脂培养concentration, MIC ;吸取 板上，置于 37? 恒温培养箱中培养 24 小时后，计菌落数，平板上菌落数低于 5 个的，此培养孔的药 物浓度即最低杀菌浓度 minimal bactericidal concentration, MBC 。各 供试药对六种标 准菌株菌敏实验结果。见表 3-8 。 表 3 牛黄上清片水提醇沉提取物抑菌实验结果(单位:mg/mL ) 抑 所用 菌 牛黄上清片水提醇沉提取物 菌种 性 1 2 3 4 5 6 7 8 9 大肠 MIC 0.0625 0.25 0.125 0.125 0.5 0.125 0.5 0.25 0.5 杆菌 MBC - 0.5 0.5 0.5 - 0.25 - - - 金葡 MIC 0.0625 0.25 0.125 0.03125 0.0625 0.03125 0.0625 0.0625 0.03125 菌 MBC 0.125 0.5 0.5 0.0625 0.125 0.0625 0.125 0.25 0.125 铜绿 MIC 0.5 0.25 0.5 0.5 0.5 0.25 0.25 0.25 0.5 菌 MBC - - - - - 0.5 - 0.5 - 枯草 MIC 0.5 0.25 0.5 0.5 0.5 0.125 0.5 0.25 0.5 杆菌 MBC - - - - - 0.25 - - - 短小 MIC 0.5 0.5 0.25 0.5 0.5 0.25 0.25 0.5 0.5 杆菌 MBC - - - - - 0.5 - - - 白念 MIC 0.5 0.25 0.5 0.25 0.5 0.0625 0.125 0.125 0.125 菌 MBC - - - - - 0.25 0.5 0.5 0.25 13 陕西中医学院2011届硕士学位论文 表 4 牛黄上清片醇提水沉提取物抑菌实验结果(单位: mg/mL ) 所用菌 抑菌 牛黄上清片醇提水沉提取物 种 性 1 2 3 4 5 6 7 8 9 大肠杆 MIC 0.125 0.5 0.5 0.5 - 0.125 0.5 0.5 0.125 菌 MBC 0.25 - - - - 0.25 - - 0.5 MIC 0.125 0.25 0.125 0.0625 0.0625 0.0625 0.125 0.125 0.25 金葡菌 MBC 0.25 - - 0.25 0.25 0.125 - 0.5 - MIC - - - - - - 0.5 - - 铜绿菌 MBC - - - - - - - - - 枯草杆 MIC 0.0625 0.25 0.5 0.25 0.25 0.0625 0.25 0.25 0.25 菌 MBC 0.25 - - - 0.5 0.25 - - - 短小杆 MIC 0.5 0.5 0.5 0.25 0.25 0.25 0.25 0.5 0.125 菌 MBC - - - - - - 0.5 - 0.25 MIC 0.5 0.25 0.5 0.125 0.5 0.25 0.125 0.25 0.125 白念菌 MBC - 0.5 - 0.25 - - 0.25 - 0.5 表 5 芩连片水提醇沉提取物抑菌实验结果(单位:mg/mL ) 所用菌 抑菌 芩连片水提醇沉提取物 种 性 1 2 3 4 5 6 7 8 9 大肠杆 MIC 0.5 0.25 0.25 0.5 0.5 0.25 0.5 0.5 0.5 菌 MBC - - - - - - - - - MIC 0.5 0.5 0.25 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.25 金葡菌 MBC - - 0.5 - - - - - - MIC 0.5 0.5 0.25 0.5 0.5 - 0.5 0.25 0.5 铜绿菌 MBC - - 0.5 - - - - - - 枯草杆 MIC 0.5 0.5 0.25 0.25 0.5 0.25 0.5 0.5 0.5 菌 MBC - - - - - - - - - 短小杆 MIC 0.5 0.5 0.5 0.25 0.25 0.5 0.25 0.5 - 菌 MBC - - - - - - - - - MIC 0.25 0.5 0.25 0.5 0.03125 0.25 0.0625 0.25 0.5 白念菌 MBC - - - - 0.125 - 0.25 - - 14 微孔浊度法测定牛黄上清片抗菌效价的 研究 表 6 芩连片醇提水沉提取物抑菌实验结果(单位:mg/mL ) 所用菌 抑菌 芩连片醇提水沉提取物 种 性 1 2 3 4 5 6 7 8 9 大肠杆 MIC 0.5 0.25 0.5 0.125 0.25 0.5 0.5 0.5 0.5 菌 MBC - - - 0.5 - - - - - MIC 0.5 0.25 0.25 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.25 金葡菌 MBC - - - - - - - - - MIC 0.5 0.25 0.25 0.5 0.5 0.5 0.5 0.25 0.5 铜绿菌 MBC - - 0.5 - - - - - - 枯草杆 MIC 0.5 0.25 0.125 0.125 0.5 0.25 0.5 0.5 0.25 菌 MBC - - 0.25 0.5 - - - - - 短小杆 MIC 0.5 0.5 0.5 0.25 0.25 0.25 0.125 0.5 0.5 菌 MBC - - - 0.5 - - 0.25 - - MIC 0.25 0.5 0.5 0.125 0.5 0.25 0.5 0.25 0.5 白念菌 MBC - - - 0.5 - - - - - 表 7 双黄连片水提醇沉提取物抑菌实验结果(单位:mg/mL ) 所用菌 抑菌 双黄连片水提醇沉提取物 种 性 1 2 3 4 5 6 7 8 9 大肠杆 MIC 0.5 0.5 0.125 0.5 0.25 0.5 0.5 0.125 0.25 菌 MBC - - 0.25 - - - - 0.5 - MIC 0.25 0.5 0.5 0.25 0.5 0.25 0.25 0.5 0.25 金葡菌 MBC - - - - - 0.5 - - - MIC 0.5 0.5 0.5 0.25 0.5 0.5 0.25 0.25 0.5 铜绿菌 MBC - - - - - - 0.5 - - 枯草杆 MIC - - - - - - - - - 菌 MBC - - - - - - - - - 短小杆 MIC 0.25 0.5 0.25 0.5 0.25 0.5 0.25 0.5 0.25 菌 MBC - - - - 0.5 - - - - MIC 0.25 0.5 0.5 0.25 0.5 0.25 0.25 0.5 0.5 白念菌 MBC - - - 0.5 - - - - - 15 陕西中医学院2011届硕士学位论文 表 8 双黄连醇提水沉提取物抑菌实验结果(单位:mg/mL ) 所用菌 抑菌 双黄连片醇提水沉提取物 种 性 1 2 3 4 5 6 7 8 9 大肠杆 MIC - 0.5 0.5 0.25 0.5 0.5 0.125 0.25 0.125 菌 MBC - - - 0.5 - - 0.125 - - MIC 0.5 0.25 0.25 0.5 0.25 0.5 0.25 0.5 0.25 金葡菌 MBC - - - - 0.5 - - - - MIC 0.5 0.25 0.5 0.5 0.25 0.5 0.5 0.5 0.25 铜绿菌 MBC - 0.5 - - 0.5 - - - - 枯草杆 MIC 0.5 0.25 0.5 0.25 0.5 0.5 0.5 0.25 0.25 菌 MBC - - - - - - - 0.5 0.5 MIC 0.5 0.5 0.5 0.125 0.5 0.25 0.5 短小杆 0.25 0.25 菌 MBC - - - 0.25 - - - - 0.5 MIC 0.5 0.5 0.5 0.25 - - 0.5 0.5 - 白念菌 MBC - - - - - - - - - 结果表明，牛黄上清片对六种标准菌株的药物敏感性与芩连片、双黄 连片比较更 加敏感，特别是它的水提醇沉 1.6 号供试品抑菌效果最明显，并且对金黄 色葡萄球菌 的敏感性优于其他五种细菌。因此，本实验仅选择牛黄上清片水提醇沉 1.6 号做为进 一步的微孔浊度法研究的供试品，即加 10 倍量的水煎煮 1.5h，加 50% 乙醇沉淀后的 提取液为供试品，金黄色葡萄球菌为实验用菌株。牛黄上清片水提醇沉 1.6 号供试品 的抑菌结果见表 9 。 表 9 牛黄上清片水提醇沉 1.6 号供试品对六种标准菌株的敏感性(单 位:mg/mL ) 大肠杆菌 金葡菌 铜绿菌 枯草 杆菌 短小杆菌 白念菌 MIC 0.125 0.03125 0.25 0.125 0.25 0.0625 MBC 0.25 0.0625 0.5 0.25 0.5 0.25 三、牛黄上清片生物检定法的建立 对牛黄上清片生物检定法建立因素的考察及方法结果: 16 微孔浊度法测定牛黄上清片抗菌效价 的研究 3.1 考察可能影响牛黄上清片菌敏实验结果的因素 3.1.1 培养基 pH 值对实验结果的影响 用已灭菌的 PBS 缓冲液分别配制 PH 值为 6.8、7.0、7.2 三种抗生素?号培养基， 同时，分别制备同样pH 值的金黄色葡萄球菌细菌悬液和供试品提取液。在同样培养 条件下，测定 2 列培养孔中的细菌在不同 pH 值下生长情况。结果见 。 表 10 3.1.2 供试品中色素对实验结果的影响 除色素处理:称取 5g 牛黄上清片细粉在用水煎煮提取前，放入适量的活性炭对 色素进行吸附，醇沉后过滤、浓缩，定容至 10ml。在同样的条件下比较含有色素与 去除色素的供试品对抑菌实验结果的影响，具体操作同 2.2.2 。结果见表 10。 3.1.3 鞣质对实验结果的影响 除鞣质处理:称取 5g 牛黄上清片细粉用水提取，提取完全后，加 4% 明胶水溶液， 搅拌至沉淀完全，过滤，滤液减压浓缩到小体积，加 3-5 倍的无水乙醇，使过量明胶 沉淀，然后滤去沉淀。如果过量明胶未除尽，可将滤液浓缩后再作 1 次乙醇沉淀，过 滤，浓缩，定容至 10ml。在同样的条件下比较含有鞣质与去除鞣质的供试品对抑菌 试验结果的影响，具体操作同 2.2.2 。结果见表 10。 3.1.4 考察不同板位培养孔对试验结果的影响 在同一 96 孔培养板的四角和中间分别进行药物抑菌试验，具体操作同 2.2.2 ，测 定 6h 后的吸光度。结果各板位的吸光度没有显著性差异。 x ? s ) 表 10 培养基 pH 值、色素和鞣质对试验结果的影响 ( 因 pH6.8 pH7.0 pH7.2 含色素 除色素 含鞣质 去鞣质 素 PH 0.082?0.020 0.086?0.028 0.089?0.027 值 色 0.136?0.183 0.125?0.219 素 鞣 ** -0.042?0.029 0.100?0.067 质 注:同一因素进行组间比较 *p 0.05 **p 0.01 17 陕西中医学院2011届硕士学位论文 结果表明，培养基 pH 值、供试品中的色素和加入供试品板位各组间没有显著性 差异，含鞣质组的抑菌能力强于不含鞣质组。所以测定条件定为培养基 pH7.0 ，不再