琼脂糖凝胶电泳
v琼脂糖凝胶电泳是采用琼脂糖凝胶作为电泳支持物的一种简单、快速分离纯化和鉴定核酸特别是DNA的
。
,琼脂糖主要从海洋植物琼脂中提取出来的,为一种聚合链线性分子。琼脂糖凝胶的孔经较大,主要用于分离较大片段的DNA分子(100bp,60kb)。
一、 电泳基本原理
与蛋白质分子相类似,核酸分子也是两性电解质。
?在pH3.5时,核酸分子带正电荷,在电场中向负 极移动;
?在pH8.0,8.3时,碱基几乎不解离,磷酸全部解离,核酸分子带负电荷,在电场中向正极移动。
? 不同大小和构象的核酸分子电荷密度大致相同,在自由泳动时,各核酸分子的迁移率区别很小,难以分开。但采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物,发挥分子筛的功能,使得分子大小和构象不同的核 酸分子泳动率产生较大的差别,则可达到分离的目的。 ? DNA片段在凝胶上移动的距离在一定范围内是分子质量的函数,分子质量越大,移动越缓慢。因此,利用琼脂糖凝胶电泳相对于
DNA的移动度,可测定DNA片段的相对分子质量。
琼脂糖凝胶浓度与DNA分子的有效分离范围
胶浓度(,) 线性DNA分子大小(kb)
0.3 5,60
0.6 1,20 0.7 0.8,10 0.9 0.5,7 1.2 0.4,6 1.5 0.2,4 2.0 0.1,3 二、仪器设备及材料
1、电泳装置:包括电泳槽(多采用水平方式)、 胶床和梳子三部分组成。 2、稳压电泳仪:电压可变范围0,300,600V,电流可变范围0,250,500mA。 3、紫外线
仪:可产生254、302、366nm 3个波段紫外线,并配备防护眼镜和5mm厚的黑色有机玻璃防护板。
4、照相机:
5、微波炉:
6、其它:三角烧瓶、量筒、胶带纸、一次性手套等。
二、 主要试剂
1、琼脂糖:根据需要用电泳缓冲液配成不同浓度。
本实验配制 2, Agrose:
2g Agrose
100ml 0.5×TBE
EB少许(终浓度0.5μg/ml)
2、电泳缓冲液:
常用的缓冲液有TBE、TAE和TPE三种。
本实验选用TBE,先配制5×TBE 贮存液:
54g Tris碱
27.5g 硼酸
20ml 0.5mol/L EDTA (pH 8.0)
(或4.65g EDTA)
加dd HO至1000ml。用时稀释为0.5×TBE。 2
3、6×上样缓冲液: 4?贮存
0.25% 溴酚蓝
0.25% 二甲苯青FF
30, 甘油水溶液
4、10mg/ml 溴化乙锭(EB):贮存液
在100ml水中加入1g 溴化乙锭,磁力搅拌数小时确保其完全溶解,棕色瓶室温保存。 ,溴化乙锭(EB)染色原理:
溴化乙锭是一种荧光染料,其分子可以嵌入到核酸的碱基对之间,在紫外线的激发下,发出橙色荧光。这是因为:
?在紫外线照射时,核酸吸收波长为254nm的紫外线并将能量传递给溴化乙锭; ?同时嵌入在核酸碱基间的溴化乙锭吸收302nm和366nm波长的紫外线,来自两方面的能量最终激发出波长为590nm的红橙色可见荧光。
, 溴化乙锭用于核酸染色的优点:
?染色操作简单,一般在凝胶中加入终浓度0.5μg/ml的EB即可,在电泳过程中随时可以观察核酸的泳动。也可在电泳结束后,将凝胶浸泡在EB里30分钟即可。 ?EB染色不会引起核酸的断裂,其它染料做不到这一点。
?EB染色灵敏度较高,可以检测出10ng的DNA样品。
,溴化乙锭缺点:
EB是一种强诱变剂,并有中度毒性。
注意:?操作中务必带上防护用手套。
?如不慎皮肤与溶液接触,应立即用清水彻底冲洗。
?含溴化乙锭的溶液使用后应进行净化处理,使其致诱变活性下降为原来的1/200左右,方可丢弃。
四、电泳操作步骤
1、凝胶准备:用0.5×TBE配制2,琼脂糖凝胶。
? 称2g琼脂糖置三角瓶中,加100ml 0.5×TBE;
? 微波炉加热大约1分钟,熔化琼脂糖;
?熔化的琼脂糖自然冷却到60,70?时,加入EB 0.5μg/ml,并轻轻混匀。 2、胶床准备:
?取出洗净并晒干的胶床和梳子,在胶床未封闭的两端贴上胶布或胶带纸,形成约5,8mm的挡墙。
?将梳子垂直插入到胶床的小凹槽内,梳齿底端和床面有1mm的间隙。 ?将胶床放在调整好的水平台上。
3、铺胶:将冷却致60?的凝胶倒入准备好的胶床内,凝胶厚度3,5mm。 4、室温下静置1小时左右,凝胶固化。撕去胶床两端的胶带纸,将带凝胶的胶床置于电泳槽中,并使样品孔位于电场负极。
5、向电泳槽中加入0.5×TBE电泳缓冲液,以越过凝胶
面1,2mm为宜。 6、轻轻拔出固定在凝胶中的梳子。
原梳齿处 (样品孔) 即被缓冲液充满,如发现有气泡,应设法去除。 7、样品准备:向核酸样品中加入约为样品体积1/6的上样缓冲液,用加样器轻轻混匀。 8、上样:用加样器吸取样品,轻轻的加入到凝胶的样品孔中。加样量一般10,30μl。
9、盖上电泳槽,接通电源,开始电泳。
开始电泳前,再次确认凝胶样品孔处于电场的负极。电泳条件:电压1,5v/cm;时间1小时左右。
10、电泳结束后,切断电源,取出凝胶。
11、电泳结果
:
?紫外检测仪直接观察电源条带;
?摄影记录;
?凝胶成像分析系统处理
五、注意事项:
1、凝胶浓度选择根据样品DNA分子大小而定,所以电泳前应对DNA片段大小有粗略的估计。
2、用胶带纸封闭胶床两端时,要确保严密,以免灌胶时有胶液漏出。 3、用微波炉熔化琼脂糖时,应控制好时间,以免突然产生气泡,使琼脂糖溢出来。 4、凝胶冷却至60?左右,立即铺胶,以防凝固。
5、上样前检查样品孔内是否有气泡,并设法排除。
6、上样时,加样器吸头要轻贴样品孔壁,但不要碰坏孔壁,否则电泳条带不整齐。 7、电泳前,确认样品孔位于电场负极。
8、因EB存在,全部操作过程要带防护手套。含EB的溶液应做净化处理。 注意事项:
1. 加热时, 一定要煮沸, 以保证琼脂糖的完全溶解.
2. 待溶液冷却至不烫手, 感觉温暖舒适时加EB. 一定要在通风柜里. 3. 倒胶时, 可用干净的纸巾拭去气泡.
4. 胶凝固后先倒入些电泳缓冲液以方便取梳子.
5. 保证缓冲液淹过胶的边沿, 边沿部分常高出1-2mm.
6. 有时需要大的上样孔, 可用胶带把几个相邻的梳齿粘在一起, 这种情况下, 尽量让胶液冷一些再倒胶.
7. 如果只是为了看一下结果(不需要照相), 同一块胶可重复用1-3次. 有一次我跑了4遍, 条带很弱, 用加了EB的缓冲液(约10ul EB in 50ml 缓冲液)泡半小时后就如正常了. 8. 要保存胶到第二天用, 可以保鲜膜包裹后放入4 度冰箱.
9. TAE 电泳缓冲液也可重复使用, 至少10次没有问题.
10. 为了防止电泳时两极缓冲液槽内pH和离子强度的改变,可在每次电泳后合并两极槽内 的缓冲液,混匀后再用。
溴酚兰的作用
1:结合沉淀核酸
2:标记泳道中核酸所跑的位置
凝胶制备的注意事项 凝胶制备的注意事项
,1、配胶和电泳需要使用同一批次的缓冲液(一些限制酶缓冲液含有高浓度盐,能减慢DNA,1、配胶和电泳需要使用同一批次的缓冲液(一些限制酶缓冲液含有高浓度盐,能减慢DNA的迁移,并可使临近孔泳带变斜) 的迁移,并可使临近孔泳带变斜)
,2、琼脂糖要彻底熔化,时间不宜过长 ,2、琼脂糖要彻底熔化,时间不宜过长
,3、EB含量要适当 ,3、EB含量要适当
,4、凝胶应存放在阴凉处,再次用时加入少量电泳液,再熔化 ,4、凝胶应存放在阴凉处,再次用时加入少量电泳液,再熔化
,5、检查梳子 ,5、检查梳子
,6、拔取梳子时应均匀用力,检查凝胶孔的整齐度 ,6、拔取梳子时应均匀用力,检查凝胶孔的整齐度
,7、凝胶稍厚些,避免样品溢出 ,7、凝胶稍厚些,避免样品溢出
电泳时间 电泳时间
,PCR产物,应该在24h之内电泳 ,PCR产物,应该在24h之内电泳
,电泳时间不易过长,对于长片断影响不大,但对小片断DNA影响明显 ,电泳时间不易过长,对于长片断影响不大,但对小片断DNA影响明显 ,电泳期间,EB向阴极迁移,与DNA迁移方向相反,长时间电泳将导致凝胶中EB含量,电泳期间,EB向阴极迁移,与DNA迁移方向相反,长时间电泳将导致凝胶中EB含量
显著较少,小片断DNA检测发生困难 显著较少,小片断DNA检测发生困难
电泳上样量 电泳上样量
, 中号梳子:8—10ul , 中号梳子:8—10ul
, 小号梳子:6—8ul , 小号梳子:6—8ul
, 上样注意事项: , 上样注意事项:
1、加样时应悬空 1、加样时应悬空
2、加样尽可能快 2、加样尽可能快
3、不必每一个样品用一个吸头 3、不必每一个样品用一个吸头
4、上样量中DNA含量过高,容易产生“弯月亮” 4、上样量中DNA含量过高,容易产生“弯月亮”
凝胶拍照 凝胶拍照
, 曝光时间:6--10s , 曝光时间:6--10s
, 拍照尺寸的选取:选用大的尺寸拍摄可获得清晰的电泳图片 , 拍照尺寸的选取:选用大的尺寸拍摄可获得清晰的电泳图片 , 一般拍摄两次才可以得到清晰的照片 , 一般拍摄两次才可以得到清晰的照片
小结 小结
, 电泳图片的影响因素: , 电泳图片的影响因素:
凝胶,电泳液,EB,上样操作,拍照 凝胶,电泳液,EB,上样操作,拍照
, 好的电泳图片不一定一次就可以获得 , 好的电泳图片不一定一次就可以获得
琼脂糖凝胶中DNA的检测 琼脂糖凝胶中DNA的检测 , ,凝 胶中核酸染色方法: 凝胶中核酸染色方法:
溴化乙锭(EB)染色法和SYBR Gold染色法 溴化乙锭(EB)染色法和SYBR Gold染色法
前者检测灵敏度低10ng,但价格便宜,常用 前者检测灵敏度低10ng,但价格便宜,常用
后者检测灵敏度高20pg,但价格昂贵,不常用 后者检测灵敏度高20pg,但价格昂贵,不常用
, , 染料存在时,线状DNA电泳迁移率降低约15, 染料存在时,线状DNA电泳迁移率降低约15,
, , 在凝胶中没有EB时,DNA条带更为清晰,当需要知道DNA片断的准确大小时,可以在在凝胶中没有EB时,DNA条带更为清晰,当需要知道DNA片断的准确大小时,可以在
无EB情况下电泳,电泳结束后用EB染色 无EB情况下电泳,电泳结束后用EB染色
, ,染 色方法:将凝胶浸入含有EB(0.5ug/ml)的电泳液中,室温下30-45min。染色完毕后通染色方法:将凝胶浸入含有EB(0.5ug/ml)的电泳液中,室温下30-45min。染色完毕后通
常不需要脱色。在检测小量DNA(<10ng)时,需要脱色,具体方法为将染色后的凝胶浸入常不需要脱色。在检测小量DNA(<10ng)时,需要脱色,具体方法为将染色后的凝胶浸入
水中或1mmol/LMgSO4中,室温脱色20min 水中或1mmol/LMgSO4中,室温脱色20min
电压 电压
, 琼脂糖凝胶分离大分子DNA实验条件的研究结果表明,在低浓度、低电压下,分离效果, 琼脂糖凝胶分离大分子DNA实验条件的研究结果表明,在低浓度、低电压下,分离效果
较好。 较好。
, 随着电压的增高,电泳分辨率反而下降,对于大分子DAN片断。电场强度不宜高于, 随着电压的增高,电泳分辨率反而下降,对于大分子DAN片断。电场强度不宜高于5V/cm。 但对于小片断的DNA可以5-20 V/cm电压电泳 5V/cm。 但对于小片断的DNA可以5-20 V/cm电压电泳