【doc】老年大鼠下丘脑和垂体神经细胞核染色质的构象研究
老年大鼠下丘脑和垂体神经细胞核染色质
的构象研究
老年医学杂志2'0OO年12川第l9卷第6期(2hinJGeri…ID2O0O.Vol19N06 j—'基础研究
老年大鼠下丘脑和垂体神经细胞核
染色质的构象研究
』
彭家和F平
_茆象千
——
一———一
,
【摘要】目的观察老年大鼠下丘脑和垂体神经细胞棱染色质的{匈象特征
选用徽球
按酸酶(MCN1和脱氧棱糖核酸酶1(DI)作为染色质结构识别探引.经脂精和聚丙烯酰胺凝胶
电泳(PAGE),示老年太鼠和青年大鼠下丘脑,垂体神经细胞核染色质的结构变化.结果老年
丈鼠下脑,乖体晕色质板小体重复I)N4长度分别为(190?7)和cI71?8,I)p.而青年大鼠分别为
L193?9)bp和(170?5);DNaseI酶解DNAJ物P4GE显小各年龄组染色质DN&均存在lObp问隔
重复结构和相同的电泳带分布特征:DNaseI染色质降解半老年大鼠明显低f青年大鼠结论
(1)老年大鼠和青年大鼠下脑,垂体染色质桩小体重复DNA长垭未发现随龄变化特征,但呈明显组
As'tadyoildlromafineanformatianinh)laofl'talamusandtuitaryIloIlrO1]~nucleiofelderly
ratsPEG
j.Qft;Tlg.AoXia~gqicmDel~2rtment.fBiochemistry,妇KrdMilitorvM?
College,Chongqing
40o038.cina
【Abstract】
ObjectiveTo0eethecharactefisfic~ofchromatinc-orfformationinh)rpOtha]anlusand pituitaryglandofratswSthdifierentagesc16一
l7ksand100-105tA'ppksofage)P+~,hods~ctveoc*a【
nuclease'MCN)anddeox'+fihonucle+'L~eI(DNaseI)WeF,PUSed舶the口
rotodlfieretlliatechwmatin
cmfformatlonandageteteetrophomsisandpebact)lamidegeleleclrophore-'sis(P&GE)1#ereemployedto
imestigalethechangesofchronNJntonittnation】
nratsv,lthdifferentages.ResultsChmnmtinDN,at
hvvghalamusamlpituitaryglandinoldmrse~istedarepeatfe儿(nuckx】s?c.a仃
(1litter0njoff190?
7)bpand(171?8)bp.andinyoungrols(193?9)bpand(170?5)上l口
respeetlvelyPAGEshowedthatDNasel
elem,ednuelece,omeDNAall0bp】ntee,alsandthecleavagepai~emsweretheSalOrle】
nallagesofmls:eotnparls~n
ofDNAfragmentsdigc:stedbyDNaseIinyoungandoldslmwedthat1sfra~gnenlsth1ov~eFhaseDaW~l-e
producedinohlratsCanelu.~ons(1)Noaglng-relatedctumgesobservedwlththerepeatlengthof
chmmatinnuc]e<x-JomeDA】
nhypothalamusandpimhorygland.buttherenasdifferencedependirrgontissues (2)thechmmatinDN&mainlvexistedinBtypeofduplexconformationandcontainedsimilarsuper-heIleal
structureofsolenoidinhype~halamu+(3)FurtherexperimentsshowedthatthechromatinDNAhypolhalamus
andpituitarygla.dfro131elderlyratswasmoleresistenttoDNaseIdigestion
【Keywords】Chr~ttatln;/4ypothalamus;PituJtan一出nd; 真核细胞的全部遗传信息DNA及与其结合的
蛋白质形成念珠状的多聚核小体结构,在细胞分裂 问期多聚核小体进一步组装成多层次复合的超卷 曲染色质构象,进而参与基因表达的调控过
程it-.我们于1996年1月至1998年l2月以微球 菌核酸酶(MCN)和脱氧核糖核酸酶(DNase)I为染 色质结构识别探针,对老年大鼠和青年大鼠的下丘 脑,垂体神经细胞核染色质构象特征进行比较研 摹项目:曰家自然科学基资助(39570353) 作告单位:400038重庄市,第三军医大学牛物化学与分子生物 学教研室
衙舨
究,以助于进一步认识脑组织老化的分子机制.
与方法
一
,实验动物和试剂
实验动物为健康Wistar系大鼠,由第三军医大
学实验动物中心提供,按鼠龄分两组:青年组23
只,l6,l7周;老年组l8只.1l?O一105周.MCN (172U/ragPint)和DNaseI(925Kunitzunits/mgPint)
为美国Sigma公司产品,琼脂糖为瑞典Pharmacia公 司产品.苯甲基磺酰氟(PMSF)为德国Boehringer Mannheim公司产品,高分子量和低分子量DNA标 ?
一
一
中华老年医学杂志2O0O年t2月第】9卷第6期ChinJGeria?,D2O0O.19.o6
准品分别为华美公司和上海复华公司产品,常用其 他化学试剂均为国产分析纯
二,方法
1.脑神经细胞核的分离及MCN和DNaseI消
化:参照文献[3:,断头处死大鼠,迅速取下丘脑和 垂体,经冰冷分离介质(0.32mol/L蔗糖,5mmol/L MgCl2,150nmaol/LKCI,10mmol/LTris?HC1,pH7.0)
冲洗后称重,按每克组织加15m1分离介质制成匀 浆,并用200目尼龙布过滤,滤液用TGL-16台式离 心机5000r/rain离心5min,弃上清,沉淀用消化介 质(150mmol/LKC1,5%甘油,0.5nwaol/LPMSF,10
mmol/LTris.HC1,pH8.2)洗1次,再配制成1nw/,r~ DNA悬液.
取核悬液于30?预温5min,按150U/ngDNA 分别加入MCN和DNaseI,开始MCN消化和DNase I消化,在指定时间取200加到200l*l终止液(20 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA),1%十二烷基硫酸 钠(sDs),pl{8.0]中.终止反应按文献[4]的方法
测定酸溶性DNA百分率
向各管加等体积饱和酚,轻轻上下翻转抽提5 min,8000r/mhl离心5min,取上清液于另一离心 管中,再用酚一氯仿,氯仿重复各抽提1次,取上清 液加2倍体积无水乙醇沉淀DNA,一20~C过夜. 12000r/嘶n离心5min,沉淀用冰冷70%乙醇洗 1次,弃上清,加TE(1maol/LEDTA,10mmol/L
Trls.HCI,pH80)使其溶解
2.DNA凝胶电泳:MCN酶懈双链DNA产物经 1.2%琼脂糖凝胶电泳,4.c,60V,4h,溴化乙锭
(EB)染色,在TR-A型紫外线检测仪上观察,照像. 由DNA
确定碱基对数(bp),用于核小体单位 DNA长度分析.DNaseI酶解产物单链DNA制备 参照Mazfiatis等的方法,经12%聚丙烯酰胺凝胶 .
7mol/L尿素垂直平板电泳(1.5ran1x150irlnl×180 ran1),缓冲系统为TBE缓冲液(90mmol/LTris,90
不?l10l/L硼酸,2.5mmol/LEDTA-Na2,pH8.3),200V
恒压,室温电泳约9h凝胶电泳后经O.0025% srains.all(50%甲酰胺配制)染色,置暗处约8h,水 中脱色3h,照像,
结果
一
,下丘脑,垂体神经细胞核MCN酶解产物电 泳分析及核小体单位DNA长度的测定
图1为两组大鼠下丘脑和垂体神经细胞核染 色质经MCN消化9min,酶解产物DNA的电泳分 析图谱:下丘脑和垂体染色质DNA均被分解为单 体及其寡聚体形式,在图谱上均表现出规律性重复 排列的核小体结构.
】,2:DNA分子量标准;3:青年大鼠下丘脑;4:老年大鼠下丘 脑;5:青年大鼠垂体;6:老年大鼠垂傩
图1"~ICN酶解DNA产物的琼脂糖凝胶电泳图谱 相对迁移率
图2标准DNA分子量电相对迁移率
青年大鼠,老年大鼠的下丘脑和垂体染色质 DNA的MCN酶解图谱均无明显差别,提示老年大 鼠未发生核小体结构的变化,尤其是核小体间连接 DNA长度的改变.依据DNA标准迁移率(图2)测
得青年大鼠和老年大鼠下丘脑及垂体细胞核核小 体及其寡聚体DNA碱基对(表1).分别计算出下丘 脑和垂体细胞核染色质的核小体单位DNA长度分 别稳定在190,193bp和170,171bp的水半上
MCN和DNaseI是近年来研究染色质构象应用 得最多的核酸内切酶.一般认为MCN能优先酶切 核小体问连接DNA.产生棱小体及其寡聚体:而 DNaseI对染色贡枸象特征的识驯作用为在30"m 染色质纤维构象中识别螺线管亚单位二核小体 (dinucleosome);在核小体DNA内部剪切下10的 片段及其多聚体,识别DNA双股螺旋的卷曲特衙; 优先酶解活性染色质本研究结果显示,MCN酶 解下丘脑及垂体神经细胞桉染色质,核小体单位 DNA长度分别保持在190bp和170bp水平上,存在 明显的组织差异,未发现有年龄相关性变化.由于 各年龄组大鼠下丘脑,垂体核小体核心颗粒DNA 均为140bp,说明核小体间连接DNA长度与脑老化 神经功能状态无明显联系,其原因可能与脑老化中 染色质组蛋白组成的高度保守性有关J. DNaseI酶解青年大鼠和老年大鼠下丘脑,垂 体神经细胞核染色质DNA,其产物电泳图谱区带分 子量均表现为以10倍值递增的B型双螺旋构象特 征.但进一步的实验结果表明.老年大鼠较青年大 鼠对DNaseI消化敏感性降低,表明衰老导致染色 质构象发生了不利于DNase1分子接近的变化,掩
盖r郭分活性染色质区域,这将有可能影响A
聚合酶转录染色厦模板,进而抑制基冈表达这
一
结果在染色质构象上为探讨生物细胞衰老的分
子机制提供了线索.
参考文献
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9Chatnm'~liMM.Kant.,MS"An~'aisc0rm?1】【mandfunctimof theehmmatinof【fbrainofymngold埘sMoIBio【Rep,l985.
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f收稿Lt期:[999【2.30)
全国肿瘤耐药与肿瘤化疗药物临床应用学术会议征文通知
肖息?
为促进和总结我国肿瘤耐药研究及肿瘤化疗药物临床合理应用,提高肿瘤化疗效果,由中华医学会中华医学杂志编
辑委员会主办的全国肿瘤耐药肿瘤化疗药物临床应用学术会议定于3_001年第季度在海LII订开(具体时间,地点另
行通知)会议脒编辑出版《肿瘤耐药与肿瘤化疗I临床研究进展》外,会后中华医学杂志将组织一期"肿瘤耐药肿瘤化疗
临床应用重点号发表现将征文内容通知如下:
1征丈内容:l1肿瘤耐药及多药耐药的临麻与基础研究,如肿瘤耐药机制,肿瘤的生物学特性化疗药物的敏感惟,肿
瘤耐药及多药耐药相芙蛋白的表达与化疗的敏感性等;《中瘤耐药与各类肿瘤临床化疗方案及化疗药物的合理选择;_3I肿
瘤耐药的预防,肿瘤耐药的逆转与逆转剂的临床应用;f4洛类抗癌药物的临床应用效果评价;?新型抗癌药物的开发研制
与临床应用效果;?肿瘤生物制剂的临床应用l硬临床抗癌效果,中医药抗癌研究及其进展;(J肿瘤耐药监测,化疗药物敏感
性检测方法;I8)其他有关肿瘤耐药及肿瘤化疗的临床应用研究和基础研究等 2征文要求:(11}仑着,综述,研究进展,临床经验总结等均可;f2争文及摘要各1份,摘要不少于10()D字,并尽量提供打
印稿和软盘,欢迎Eumi]投稿;I3截稿13期:2001年5月3013;4稿件寄:-lgg~东田西大街42号中华医学会中华医学杂志
编辑委员会袁桂清收,请在信封注明肿僖化疗会议"字样.邮政编码:100710,电话:010—65285255,传真:010—65273362,
Ema[1::arqir咖@蛳.net.
中华医学会
中华医学杂志编辑委员套