门静脉分支结扎后肝的组织化学变化

门静脉分支结扎后肝的组织化学变化 中 国 组 织 化 学 与 细 胞 化 学 杂 志Vol171No . 3 第 7 卷第 3 期CHINESE JO URNAL OF HISTOCHEMISTRY AND CY TOCHEMISTRY Sep . 1998 1998 年 9 月 门静脉分支结扎后肝的组织化学变化 33 熊希凯 陈艳贤 高焱明梅方雄 ( 湛江中心人民医院肝胆外科 , 湛江 5240373)同济医科大学解剖学教研室 , 武汉 430030 摘要 为了进一步探讨门静脉血流阻断对肝的影响 , 作如下实验 。24 只健康成年家兔分为() () 1对照组 : 假手术 ; 2实验组 : 门静脉右外支结扎术 。术后第 1 , 3 , 7 天分别处死动物 。取 ( ) ( 结扎叶肝组织行组织化学观察 。结果 , 实验组肝琥珀酸脱氢酶 SD H, 葡萄糖262磷酸酶 G262 2 + ( ( ) ) ) Pase, 镁激活三磷酸腺苷酶 Mg2A TPase, 胆碱酯酶 Ch E等酶活性和糖原 PAS 反应明显 () ( ) ( ) 降低 ; 乳酸脱氢酶 L D H, 酸性磷酸酶 ACP和碱性磷酸酶 AL P活性明显升高 。术后第1 , 3 , 7 天各动物肝的组织化学变化无显著性差异 。结果表明 : 门静脉缺血将引起肝的代谢和功 能损害 , 门静脉在肝血供中起着很重要的作用 。 关键词 门静脉分支结扎 肝 组织化学 兔 1 门静脉血流阻断可导致肝的损害, 为进一步探讨门静脉血流阻断对肝的影响 , 本文 观察了兔门静脉分支结扎后 , 结扎叶肝的组织化学改变 。 材 料和方 法 ( ) ( ) 健康成年家兔 24 只 , 雌雄均有 , 体重 210310 kg , 分为 1对照组 6 只 。 2实验组 () 18 只 。术前禁食 12 小时 , 3 %戊巴比妥钠 3040 mg/ kg静脉麻醉 , 无菌条件下行上腹正中 切口 , 入腹后暴露肝右外叶肝门 , 分离门静脉右外支 , 对照组不予结扎 , 实验组予丝线结 扎 , 关腹 。术后 1 , 3 , 7 天经耳缘静脉注射空气栓塞致死 , 取结扎叶肝按组织化学技术要求 ( ) () 制作标本 。其中 , 琥珀酸脱氢酶 SD H用 Nachlas 法 , 乳酸脱氢酶 L D H用 Presto n 法 , 2 + ( ( ) ) 葡萄糖262磷酸酶 G262Pase和镁激活三磷酸腺苷酶 Mg2A TPase用 Wachstein2Meisel ( ) ( ) 法 , 胆碱酯酶 Ch E用 Kar novsky 法 , 酸性磷酸酶 ACP用 Go mo ri 法 , 碱性磷酸酶 () AL P用 Go mo ri 钙钴法 , 糖原 PA S 反应用 Chayen 法 。上述组织化学反应切片 , 在光镜下 进行各组间定性比较 , 并取各组动物的 SD H 、PA S 切片用 L eitz2M PV2 型显微分光光度计进 2 - 3 行定量测定 , 结果用统计学处理。 结果 1 . 组织化学观察 1 . 1 定性观察 2 + 实验组较对照组 SD H 、G262Pase 、Mg2A TPase 、Ch E 酶活性明显低 , 糖原 PA S 反应 ()明显弱 , 而 L D H 、AL P 和 ACP 酶活性明显高 。实验组术后 1 , 3 , 7 天无差异 见表 1 表 1 组织化学定性观察结果 () 对照组 假手术() 实验组 门静脉结扎术 组化 ( ) ( ) ( ) ( ) 1 天 63 天 67 天 6 6 SD H ???6 L D H 6 6 6 + G262Pase 7 + + + 2 + ? ? ? 7 Mg2A TPase ? 7 7 7 ACP 6 + + + Ch E ? + + + AL P ? ? ? 7 PAS ) ( ) ( ) ( ) ( 6 中等阳性 7 强阳性 注 : ?弱阳性+ 阳性 1 . 2 SD H 、PA S 的定量观察 用显微分光光度计测定 SD H 、PA S 相对含量 , 统计学处理结果显示 ,实验组比对照组 ( ) SD H 、PA S 定量值高 , 差异有极显著性 P < 0101 , 而实验组术后 1 , 3 , 7 天各组动物 ( () ) SD H 、PA S 定量值无显著性差异 P > 0105, 定量结果与定性结果相符 。见表 2 ( ) 表 2 SD H 、PA S 显微分光光度计测定结果 X ?SD () 实验组 门静脉结扎术 () 组化对照组 假手术 1 天3 天7 天 320198 ?22144 187 ?13158 154 ?26166 137 ?14138 809091SD H 260131 ?23180 95116 ?11159 97155 ?23161 106126 ?12174 PAS 说明 : ?实验组与对照组 SD H 、PAS 测定值均数比较的 F 检验 P < 0101 。 ?实验组术后 1 , 3 , 7 天各动物 SD H 、PAS 测定值均数两两比较的 q 检验 P > 0105 讨论 SD H 定位于胞浆线粒体内膜 , 为三羧酸循环过程中的限速酶 , 酶活性强弱反映有氧氧化的活跃程度 。L D H 定位胞浆基质 , 是进行无氧酵解重要的酶 , 酶活性增高 , 表示糖酵解 6 增强 。糖原 PA S 反应反映肝细胞糖原合成及储备功能 。Mg 2A TPase 定位于毛细胆管周围 线粒体内膜 , 此酶分解 A TP 生成 AD P 和 Pi 并释放能量 , 与泌胆功能相关 。G262Pase 定位于滑面内质网 , 能把糖原在基质中的降解产物 G262P 分解为葡萄糖和磷酸 , 胆红素等物质经 此酶磷酸化 , 该酶活性反映滑面内质网功能 。ACP 定位于溶酶体内 , 是溶酶体的标志酶 , 溶酶体的重要特性是生活细胞内的稳定性 , 溶酶体包封在膜内 , 以潜伏状态存在 , 当细胞受 损时 , 膜的通透性增高 , 甚至破裂 , 酶大量释放致细胞溶解 。AL P 定位肝细胞窦状隙缘 , 可能参与细胞膜对底物主动运输 , 以利机体对钙磷化合物的利用 , 肝功能受损时 , 该酶活性 增高 。Ch E 是微粒体酶系 , 参与肝生物转化功能 , 肝细胞功能受损时 , 此酶合成减少 , 可 2 - 4 反映肝合成蛋白质和贮备功能。 本实验观察到门静脉分支结扎后 , 与假手术对照组相比组织化学改变有明显的差异 , 结 扎叶肝 SD H 活性下降 , L D H 活性上升 , 反映肝细胞缺氧 , 线粒体的三羧酸循环氧化代谢过 程障碍 , PA S 反应降低 , 反映糖原合成减少 、消耗增多 。提示门静脉阻断后 , 引起细胞氧 中国组织化学与细胞化学杂志 第 7 卷288 6 供及葡萄糖等营养物质不足 , 能量缺乏 。G262Pase , Mg 2A TPase 和 Ch E 酶活性下降 , ACP 和 AL P 酶活性升高 , 提示门静脉阻断后 , 肝细胞受损 , 肝功能障碍 。 门静脉分支阻断的 1 , 3 , 7 天各动物的组织化学改变无显著性差异 , 表明门静脉阻断后 结扎叶肝由肝动脉供血 , 但门静脉结扎后 7 天肝动脉不能代偿门静脉血流使肝的组织化学变 化得到恢复 。文献报导 , 门静脉结扎后结扎叶第 2 天肝小叶中央和中间带出现大量的凝固性 肝细胞坏死 , 并出现大量与坏死区相连的萎缩性凋亡细胞 , 第 2 天萎缩凋亡细胞最多 , 此后 下降 , 第 7 天坏死细胞几乎完全溶解消失 ; 第 4 天出现与坏死区不相连的萎缩性凋亡细胞 , 5 第 7 天达高峰 , 14 天恢复正常重建结构时消失。本实验结果与此基本相符 。 上述结果表明 : 门静脉缺血将引起肝细胞的代谢和功能严重损害 , 门静脉在肝血供中起 着很重要作用 。 收稿 1997210 修回 1998203 ()本文图 1 - 8 见文后彩图 参考文献 () Schweizer2W ; Duda2P ; Tanner2S et al . Experimental at rop hy/ hypert rop hy co mplex A HCof t he liver : por2 1 tal vein , but not bile duct obsrt uctio n , is t he main driving force for t he develop ment of A HC in t he rat . J2Hepa2 tol . 1995 ; 23 : 71 2 陈啸梅 , 周文郁 , 彭俊云等 1 组织化学手册 1 第 1 版 , 北京 人民卫生出版社 , 1982 陈艳贤 , 熊希凯 , 朱惠明等 1 维生素 E 对大鼠急性肝损害保作用的实验研究 1 解剖学报 ; 20 卷组织化 3 学与细胞化学专辑 : 67 4 张昌颖主编 1 生物化学 1 第 2 版 , 北京 人民卫生出版社 , 1985 Ikeda2K ; Kinoshita2H ; Hiro hash2K et al . The ult rast ruct ure , kinetics and int ralobular dist ributio n of apop totic 5 hepatocytes af ter portal branch ligatio n wit h special reference to t heir relatio nship to necrotic hepatocytes. Arch2 Histol2Cytol . 1995 ; 58 : 171 THE HISTOC HEM ICAL OBSERVATIO N AFTER BRA NC H L IGATIO N OF PO RTAL VEIN IN RABBIT 3 3 Mei Fangxio ng , Xio ng Xikai , Chen Yanxian , Gau Yanming ( Zha n j i a n g Cen t ral Hos pi t al , Zha n j i a n g 524037 ) 3 Dep a rt m en t of A n atom y , Ton gj i M edical U ni ve rsi t y , W u ha n 430030 Chi n a To demo nst rate t he influence of interrup ting po rtal vein to liver , 24 healt hy adult rabbit s were divided into t wo gro up s : t he no r mal co nt rol gro up , sham operatio n ; and t he experimental gro up , ligating t he right lateral branch of po rtal vein . On t he 1st , 3rd and 7t h day af ter opera2 tio n , t he rabbit s were respectively killed and t he ligated lo be were dissected fo r histochemical ex2 6 aminatio n. The result s showed t hat t he enzymic activities of SD H , G262Pase , Mg 2A TPase , Ch E and PA S reactio n in t he experimental gro up were significantly lower . The enzymic activities of L D H , ACP and AL P were significantly higher . The changes showed no remar kable difference bet ween t wo gro up s o n t he 1st , 3rd and 7t h day af ter operatio n . This st udy suggest s t hat t he is2 chemia of po rtal vein may induce damages of t he metabolism and f unctio n of liver cell . The bloo d supply of po rtal vein plays t he mo st impo rtant in t he bloo d supply of liver . Key Word Po rtal branch ligatio n ; Liver ; Histochemist ry ; Rabbit 图版说明 )( ) ( 对照组肝 SD H 6 ? 图 1×75图 5对照组肝 ACP×300 ) ( ) ( 图 2 实验组肝 SD H ?×75图 6 实验组肝 ACP 7 ×300 ( ) ( ) ×75×300图 3 对照组肝 PAS 7 图 7 对照组肝 AL P ? ( )×75( )×300图 4 实验组肝 PAS ? 图 8 实验组肝 AL P + EXPL ANTIO N OF FIGURES ( )t he normal co nt rol group liver SD H 6 Fig 1 ×75 ( ) t he experimental group liver SD H ?×75Fig 2 ( ) t he normal co nt rol group liver PAS 7 Fig 3 ×75 ( ) t he experimental group liver PAS ?Fig 4 ×75 ( ) t he normal co nt rol group liver ACP ?×300Fig 5 ( )t he experimental group liver ACP 7 Fig 6 ×300 ( ) Fig 7 t he normal co nt rol group liver AL P ?×300 ( ) Fig 8 t he experimental group liver AL P + ×300 中国组织化学与细胞化学杂志 1998 年第 7 卷第 3 期 介绍一种 L FB 显示线粒体组织化学新方法 田玉旺 丁华野 邓永江 黄晓南 () 北京军区总医院病理科 , 100700 在病理诊断和研究工作中 , 线粒体染色是一种常规的染色技术 。目前常用的染色方法多存在着染色步 ( 骤复杂 , 染色时间过长及分化难以掌握等缺点 。针对上述缺点 , 我们根据线粒体中含有大量的类脂质 蛋 ) () 白质 - 磷脂这一组织结构特点 , 采用劳克坚牢蓝 L uxol fast blue , L FB组织化学方法显示线粒体 , 收到 了满意的效果 。现将此法介绍如下 : ( 1 . 材料及组织处理方法 选用新鲜的小白鼠的小肠 、肾 、肝及人的肌肉等组织标本 。组织标本 1 - ) () 2mm 厚固定于重铬酸钾 - 福尔马林液 3 %重铬酸钾水溶液 4 份 , 福尔马林 1 份中 , 37 ?温箱内处理 μ 1224 小时 , 自来水冲洗 12 小时 , 常规酒精脱水 , 二甲苯透明 , 石蜡包埋 , 切片厚 24m 。 () (() 1切片常规脱蜡至蒸馏水 ; 2用劳克坚牢蓝染液 劳克坚牢蓝 011g , 95 %酒精 100ml , 2 . 步骤 ) () 10 %冰醋酸 015ml染色 12 小时 , 在室温或 5560 ?温箱内进行 ; 395 %酒精浸洗 30 秒,1 分钟后用蒸馏 () () 水洗 ; 4用 0105 %碳酸锂水溶液分色约 1 分钟 , 再以 70 %酒精最后分色至背景无色 ; 5用蒸馏水洗终 () 止分化 ; 6常规酒精脱水 、二甲苯透明 、中性树胶封固 。结果 : 线粒体呈蓝色 。 () 3 . 讨论1线粒体代表多种胞浆内之细丝状或细颗粒状物质 。这些物质易受温度和自溶的影响 , 细胞坏死后 , 此种物质速起变化 , 从最初的结构中消失 , 不能被显示 , 故取材必须新鲜 , 迅速加以固定 。() 2固定是此法染色成败的关键 。其中固定剂的选择至关重要 , 选择优良的固定剂才能获得满意的染色效果 。因为重铬酸钾是强氧化剂 , 它能使线粒体的蛋白质成为不可溶的 , 但不能沉淀它 。因此 , 能保存细胞 质和生活着的线粒体一样 。同时 , 重铬酸钾对线粒体的类脂质也有强大的固定作用 , 使其不溶解于脂溶剂 ; 并且具有较好的媒染作用 , 从而利于着色 。但固定后的组织要充分流水冲洗 , 洗去细胞内的铬酸盐 , 否则 组织切片不易着色 。另外 , 不能使用酒精及酸类固定剂 , 因为这些固定剂容易使线粒体解体 , 其原因为酒 ( ) 精和酸类使组织线粒体的蛋白质和磷脂结合的化学键断裂之故 , 致使线粒体不能显示出来 。3该法染色 原理可能是因为劳克坚牢蓝为一种金属盐染料 , 与线粒体中的类脂质结合 , 形成一种络合物 , 而被显色 。() ( ) 4染色过程中 , 切片分化要适当 , 要随时镜下观察 , 直至线粒体显示清晰为好 。 5组织切片尽量薄 。 组织块必须小 , 不可固定过多或过厚之大组织块于一瓶中 。配制固定液等试剂 , 必须纯净 , 玻璃器皿需清 洁 。 经应用证实 , 此法显示线粒体操作简便 , 形态清晰 , 色泽鲜艳 , 不易腿色 。 收稿 1997203 修回 1998205