第二军医大学

第二军医大学 第 二 军 医 大 学 细胞生物学 教 案 第 15 次课 授 课 时 间: 2010.5.21 教案完成时间: 2010.5.20 医学细胞生物学 课程名称 军医09 专业层次 本科 专业技术授课方式 何志颖 教 员 讲师 大班 职 务 (大、小班) 第十章 发育过程中的细胞类型;第四篇 细胞与生物工程 授课题目(章、节) 医学细胞生物学。胡以平。高等教育出版社，2009。 基本教材和 Essential cell biology. Alberts B et al. Garland Science.2003. 主要参考书 教学目的: 1、掌握干细胞的概念、分类和生物学特征;2、掌握胚胎干细胞的基本特征; 3、掌握细胞工程、细胞培养的概念;4、了解成体干细胞和肿瘤干细胞的基本知识;5、了解动物细胞工程所涉及的主要技术领域。 主要内容与时间安排: 从干细胞的研究历史引出干细胞的概念，重点讲解干细胞的分类、生物学特征以及胚胎干细胞的基本特征。简单讲解成体干细胞和肿瘤干细胞的基本知识，最后简要讲解有关动物细胞工程所涉及的主要技术领域，重点是细胞工程、细胞培养、细胞系和细胞株的概念。 教研室审阅意见: 教学组长(主讲教员)签名: 教研室主任签名: 1 教具及时内 容 间分配 幻灯1 干细胞和细胞工程 各种脊椎动物的发育过程十分相似，都要经历受精卵的形成、卵裂、胚板书 层出现、组织器官形成及胚后发育这样一个连续的过程。这一过程的发展和 完成主要是通过细胞的分裂和分化来实现的。细胞的分裂可以扩大细胞的数 量，即发生量的变化;而细胞的分化可形成各种不同类型的细胞，即发生质 的变化。因此，个体发育的过程实际上是细胞的不断分裂增殖和有序分化的幻灯2 结果。从细胞水平来看，个体的发育可简单的认为是从全能细胞?多能细胞 ?专能细胞?成熟细胞发展的过程，由此，一个受精卵就可发育成一个多细 胞个体，而且个体中的多种细胞可精确的出现于特定的位置，执行其特殊功 能。然而，该过程中若出现细胞增殖和/或分化异常，机体的正常发育或正常 胜利功能的维持就有可能受到影响。 本章将介绍个体发育中出现的一些正常细胞(如各种干细胞以及成体中 的4种基本组织细胞)的基本特征及其与医学的关系。而且，也将介绍个体 发育中出现的异常细胞——肿瘤细胞和肿瘤干细胞的基本特征。 幻灯3 第一节 干 细 胞 干细胞(stem cell)是指细胞分化过程中出现的具有分裂增殖能力，并 能分化产生一种以上“专业”细胞的原始细胞。根据其分化潜能及产生“专 业”细胞的不同，又可分为全能干细胞(totipotent stem cell)、多能干细 胞(pluripotent stem cell)和专能干细胞(multipotent stem cell 或幻灯4 committed stem cell)。全能干细胞指那些具有发育全能性的早期胚胎细胞，板书 如处于8细胞期之前的每一个胚胎细胞(包括受精卵)，这种状态的任何一个 细胞植入子宫后，都可以发育为一个完整的个体;多能干细胞指那些分化潜 能很“宽”，可分化为多种专能干细胞的原始细胞如胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESC);专能干细胞指那些存在于成熟个体各种组织器官中的干细 胞，具有自我更新能力，但通常只具有分化为参与相应(或相邻)组织器官 组成的“专业”细胞，如各种成体干细胞(adult stem cell 或somatic stem cells)。 一、干细胞的基本特征 2 (一)干细胞的形态和生化特征 幻灯5 形态特征 干细胞通常呈圆形或椭圆形，体积较小，核质比例较大。根 据其形态学特征和存在位置可以辨认不同的干细胞，但是，也有很多干细胞幻灯6 的存在部位仍未确定，且没有与分化细胞截然不同的形态学特征。 生化特征 干细胞都具有较高的端粒酶活性，这与其增殖能力密切相关。 不同的干细胞可能具有各异的生化标志，如角蛋白15是确定毛囊中表皮干细 胞的标志分子，nestin为神经干细胞的标志分子，干细胞的生化标志对于确 定干细胞位置，寻找和分离干细胞都具有重要意义。 (二)干细胞的增殖特征 缓慢性 干细胞的增殖速度通常很慢。但当机体需要时，它可以进入分 化过程，以适应组织器官的生长、发育或修复的需要。干细胞一旦进入分化 过程，其增殖速度便可逐渐加快。干细胞增殖时，首先要经过一个短暂的增板书 殖期，产生过渡放大细胞(transit amplifying cell)。过渡放大细胞是界于 干细胞和分化细胞之间的过渡细胞，它可经若干次分裂后产生分化细胞。过 渡放大细胞的生物学意义在于可以通过较少次数的干细胞分裂，产生较多的幻灯7 分化细胞。干细胞的分裂比过渡放大细胞慢，如小肠干细胞较其过渡放大细 胞的分裂速度大约慢1倍。干细胞缓慢增殖有两方面的作用:一方面有利于 干细胞对特定的外界信号作出反应，以决定进行增殖还是进入特定的分化程 序;另一方面可以减少基因发生突变的危险，使干细胞有更多的时间发现和 校正复制错误，具有防止体细胞自发突变的作用。 自稳性 自稳性 (self-maintenance) 是指干细胞可以在生物个体生命 区间中自我更新(self-renewing)，并维持其自身数目恒定，这是干细胞的基 本特征之一。当干细胞分裂时，如2个子代细胞都是干细胞或都是分化细胞， 称为对称分裂(symmetry division)。产生一个子代干细胞和一个子代分化细 胞则称为不对称分裂(asymmetry division)。无脊椎动物的干细胞常以不对 称分裂来维持自身数目的恒定。哺乳动物的干细胞分裂所产生的2个子代细 胞既可能是2个干细胞，也可能是2个特定分化细胞。当组织处于稳定状态 时，对于整个细胞群体来讲，每1个干细胞通常产生1个子代干细胞和1个 特定分化细胞，这种分裂现象称为种群不对称分裂(populational asymmetry division)。种群不对称分裂可使机体对干细胞的调控更具灵活性，以适应机幻灯8 体各种生理变化的需要。干细胞的自稳定性是其区别于肿瘤细胞的本质特征。 3 (三)干细胞的分化特征 多能性 干细胞具有多方向的分化潜能，但不同的干细胞具有的分化潜 能不同，如胚胎干细胞可以分化为任何一种组织类型的细胞;而成体干细胞 通常只能分化成其相应或邻近组织的细胞，如肠干细胞可分化产生肠的吸收 细胞，杯细胞，潘氏细胞，肠内分泌细胞。神经干细胞只能向神经系统细胞 (神经元、神经胶质细胞)分化，而不能分化成其他细胞类型。但近年来的 一些发现对这一观点提出了挑战，越来越多的证据表明，分离自成体的干细 胞具有一定的可塑性，在适当的条件下可以表现出更广泛的分化能力，甚至 实现跨胚层的分化。这从根本上打破了传统的胚层限制的观点。 当然，胚胎干细胞分化为成体干细胞是一个连续的过程，在此过程中的 各种细胞都是处于不同分化等级的干细胞，这些干细胞随着其分化(即个体 发育)的进行，其分化方向趋于增多，分化潜能也趋于变“窄”。正是由于 它们的存在，构成了个体发育在空间上的正确性和时间上的有序性。 可塑性 干细胞分化的可塑性(plasticity)，是指干细胞在适当的条件 下，可以发生转分化(transdifferentiation)和去分化(dedifferentiation) 的现象。一种组织类型的干细胞在适当条件下可以分化为另一种组织类型的 细胞，称为干细胞的转分化。1997年Eglitis等首次证明成年动物的造血干细幻灯9 胞可分化成为脑的星形胶质细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞。以后又发现 成体造血干细胞分化形成肌细胞、肝细胞;神经干细胞分化为造血细胞等， 表明干细胞的转分化具有普遍性。一种干细胞向其前体细胞的逆向转化被称 为干细胞的去分化。然而，关于干细胞去分化的证据目前还比较少。 (四)干细胞增殖与分化的微环境 在高等脊椎动物中，干细胞生存的微环境对维护干细胞的自我更新及其 分化命运方面至关重要。干细胞在机体组织中的居所称为干细胞巢(stem cell niche)。一般认为，干细胞巢是由干细胞及其外围细胞，以及其增殖分化调 控相关因子所组成的，具有动态平衡特性。在干细胞巢中，所有控制干细胞 增殖与分化的外部信号构成了干细胞生存的微环境。干细胞的微环境主要包 括以下3个方面。 分泌因子 分泌因子(secreted factors)可以是干细胞自身分泌的，幻灯10 也可以来自外围细胞或者其他组织细胞。为数众多分泌因子对干细胞的生存、 增殖和分化具有重要的调控作用。在不同的干细胞微环境中，以及其不同的 4 生理或发育状态下，分泌因子的种类以及其水平可有很大差异，但它们总是 与发育或生理状态的需求相适应。 细胞间相互作用 细胞与细胞之间的相互作用对干细胞命运的调控具重 要意义。 整合素和胞外基质 整合素和胞外基质对维持干细胞的增殖分化至关重 要。整合素有将干细胞置于组织中正确位置的作用，否则干细胞会脱离生存 环境而分化或凋亡。胞外基质有调节干细胞微环境中局部分泌因子浓度的作 用。 二、胚胎干细胞 胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESC)是指存在于早期胚胎中，具有 多能性分化潜能性，可以分化为胚胎或成体的各种细胞类型的细胞，同时又 可保持不分化状态持续生长的一类克隆细胞系。在适当条件下，ESC可被诱幻灯11 导分化为多种细胞或组织，也可以与受体胚胎嵌合，形成嵌合体，可嵌合进 入包括生殖腺在内的各种组织，因此，ESC是研究哺乳动物早期胚胎发生、 细胞分化、基因表达调控等生物学问题的理想模型和有效工具。从ESC的来 源可将其分为3类:着床前的内细胞团(inner cell mass，ICM)来源的胚 胎干细胞(embryonic stem cell，ES细胞)、原始生殖细胞(primordial germ cell, PGC)来源的胚胎生殖细胞(embryonic germ cell，EG细胞)以及畸 胎瘤来源的胚胎癌细胞(embryonic carcinoma cell，EC细胞)。ES细胞和 EG细胞均保持正常的核型，而EC细胞则有染色体异常等肿瘤特征。1981年 Evens和Kaufman首次分离得到小鼠的胚胎干细胞，随后人们获得了猪、牛、 绵羊、仓鼠、鸡、斑马鱼、恒河猴等脊椎动物的胚胎干细胞。1998年， Thomson 和Gearhart分别获得了人胚胎干细胞(human embryonic stem cell，hES 细胞)，它既具有其他哺乳动物胚胎干细胞的特征，又具有其本身的特殊性。 现就胚胎干细胞的一些特征做进一步描述: (一)生物学特征 形态特征 人胚胎干细胞为圆形细胞，细胞较小，直径约150,200nm，幻灯12 核大，核质比例高，有一个或多个核仁。细胞中多为常染色质，细胞质结构 简单，散布着大量核糖体和线粒体，核型正常，保持稳定的整倍体核型。体 外抑制分化培养时可见人ES细胞呈集落样(克隆样)生长，细胞间紧密堆积， 无明显的细胞界限，形似鸟巢。 5 生长特征 hES细胞增殖迅速，每18-24h就分裂增殖一次，在特殊的培 养条件下，如有滋养层细胞或白血病抑制因子(Leukemia inhibitory factor， LIF)存在时，hES细胞可保持未分化状态和连续无限传代的能力;无特殊培 养条件时，hES细胞则自动分化为多种细胞。 生化特征 人胚胎干细胞源于早期胚胎细胞，它表达早期胚胎细胞、畸 胎瘤细胞的表面抗原——胚胎阶段特异性抗原(staye-specific embryonic cntigen，SSEA)等，但不同种属、不同时期的胚胎干细胞所表达的SSEA有 差异，如小鼠ES细胞表达SSEA-1，而不表达SSEA-3，SSEA-4; hES细胞则 表达SSEA-3，SSEA-4等表面抗原。SSEA常作为ES细胞鉴定的一个标志。另 外， hES细胞中还有碱性磷酸酶(AKP)和端粒酶的表达。AKP常作为鉴定ES幻灯13 细胞分化与否的标志之一，端粒酶的表达则表明其复制的寿命长于体细胞复 制的寿命，因为端粒酶与人细胞的永生化高度相关。 (二)分化潜能 hES细胞是多能性干细胞，可分化为内、中、外三个胚层的细胞。目前公 认的评价ES细胞多潜能性的实验有: 类胚体试验 若将ES细胞在无饲养层细胞，添加LIF或者悬滴培养时， ES细胞会自发分化并聚集形成类胚体(embryoid body, EB)。类胚体与畸胎 瘤相似，包含内、中、外三个胚层发育形成的所有或部分类型的分化细胞， 这在体外证明ES细胞具有分化形成外，中、内三个胚层的潜能。 畸胎瘤实验 若将ES细胞给同源动物或重症联合免疫缺陷的小鼠皮下注 射会形成复杂的混合组织瘤(畸胎瘤)。瘤组织包括胃上皮(内胚层)、骨和 软骨组织、平滑肌和横纹肌(中胚层)、神经表皮、神经节和复层鳞状上皮(外幻灯14 胚层)等，这在体内证明ES细胞具有分化形成外，中、内三个胚层的潜能。 嵌合体试验 若将小鼠等哺乳动物的ES细胞注射到胚胎的囊胚腔，ES 细胞则与正常胚胎嵌合形成嵌合体(chimera)并可参与形成包括生殖系在内 的各个组织器官，且能产生嵌合的功能性配子。该方法是证明ES细胞具有多 潜能分化能力的金，但由于伦理道德和其他原因，hES不可能进行嵌合体 实验。 (三)ES细胞与医学 ES 细胞的应用 ES细胞对在体外研究正常胚胎发生、非正常发育(通 过目的基因修饰和染色体工程生产特定细胞系)、发现合成药物和胚胎瘤检测幻灯15 6 及作为组织移植、器官置换和基因治疗等都有重要作用，尤其在临床医学治 疗上具有诱人的前景。其主要应用方面有:?ES细胞已成为基因功能研究的 有效手段，利用ES细胞产生基因剔除小鼠，可破译人体中重要基因的功能; ?ES细胞系建立后，可从最根本上揭示人及动物发育过程中的决定基因，从 而可分离鉴定新的前体细胞和有重要医学价值的基因;?ES细胞可作为评价 新药及化学产品毒性及效能的检测系统;?ES细胞最引人注目之处在于它有 重要的临床意义，体外诱导胚胎干细胞分化，并通过一定的筛选手段得到功 能性目的细胞(例如胰腺细胞、心肌细胞、神经细胞)，可用于疾病的治疗和 组织工程产品的研制，即ES细胞有可能成为今后细胞替代疗法和组织器官移 植的最佳来源。 hES细胞研究的伦理学挑战 尽管人胚胎干细胞有着巨大的医学应用潜 力，但是，由于人胚胎干细胞主要来源于流产的胎儿和体外受精制造的胚胎，幻灯16 围绕该研究的伦理道德问题也随之出现，这些问题主要包括人胚胎干细胞的 来源是否合乎法律与道德、其应用是否会引起伦理及法律问题。人类只有正 确解决这些问题，才能使胚胎干细胞的研究造福全人类。 三、成体干细胞 在成体组织或器官中，许多细胞仍具有自我更新及分化产生不同组织细 胞的能力，如血液细胞和皮肤细胞，所以人们一直推测，在成体中存在一些 能起新旧更替作用的成体干细胞。近年来，由于细胞生物学和分子生物学的 发展，科学家已成功分离或鉴定了多种成体组织的干细胞，如造血干细胞、 神经干细胞、间充质干细胞、皮肤干细胞、肠干细胞、肝干细胞、生殖干细 胞等。目前普遍认为成体干细胞是在成体组织内具有自我更新能力及能分化 产生一种或一种以上子代组织细胞的未成熟细胞。 (一) 造血干细胞 幻灯17 造血是一个动态过程，即不断地产生髓系，红系和淋巴细胞系的细胞。 1961年Till和McCulloch首次通过小鼠脾结节形成实验证实了造血干细胞在 成体内的存在，并证实它具备分化为多个血液细胞系的能力，这一发现使得 人们对于造血和血液学的认识和研究发生了革命性的变化，至此人们认为造 血系统的所有细胞均来自于位于骨髓的造血干细胞(hematopoiesis stem cell,HSC)。所谓造血干细胞，是指在一定程度上具备自我更新能力和生成所 有血液细胞系的原始细胞。 7 造血干细胞的生物学特征 造血干细胞的形态至今仍无定论，一般认为 类似于小淋巴细胞。其生物学特征主要有:? 具有自我更新和多向分化的能 力;? 绝大多数干细胞处于静止期(G期);? 高度表达CD34和CDw90抗 0 原;? 缺乏CD3和CD71等相关抗原;? 具有人类白细胞抗原CD45RA高分 子质量形式;? 低表达或不表达HLA,DR。? 若丹明(rhodamine)低吸收幻灯18 率(Rho)。 造血干细胞的增殖和分化特征 人体中大部分的造血干细胞 (约 75%) 处于静止期(G)，仅5%的造血干细胞处于S/G/M期，另外20%处于G期。尽 021管如此，所有造血干细胞会有规律地进入细胞分裂周期，因为平均每57天， 99%的造血干细胞会分裂一次，也就是说，造血干细胞群总是不断地进/出细 胞周期。 现有两种模型来解释造血干细胞的增殖和分化:克隆演替假说(或银行 帐户假说)和不对称分裂假说。克隆演替假说解释了干细胞是如何协调细胞幻灯19 周期事件以满足造血需求的。这个模型推想，动物生命中有大量的造血干细 胞补充，然而仅有极少数量的造血干细胞克隆发育成成熟的血细胞，其余的 造血干细胞则停留在静止期，不参于造血。另外一种假说是不对称分裂模型。 已证明保存于中枢神经和胚胎细胞系统的干细胞发生不对称分裂。由于小鼠 造血干细胞库的大小是恒定的，一般情况下其大小不会增加，分裂期的造血 干细胞肯定会产生同样数量的造血干细胞和多系前体细胞。然而，造血干细 胞不对称分裂的证据尚无太多报道。 造血干细胞的应用 造血干细胞在基础研究和临床应用领域都有广泛的 应用，随着人们对造血干细胞研究的深入，其应用领域将不断扩大，这主要 是因为:? 造血细胞是细胞增殖分化的最佳模型，在“时间”上有造血干细 胞、祖细胞、前体细胞、功能血细胞等不同的分化成熟阶段;在“空间”上 有粒细胞、红细胞、巨核细胞,血小板 、NK细胞、T,B淋巴细胞、树突状 细胞等不同分化类型和功能的细胞。? 造血干,祖细胞及各系血细胞的表面幻灯20 标志较清楚，可用于揭示重要的调控机制和发掘调控基因。? 血细胞具有运 氧，修复内皮、控制感染、参与机体免疫等多种复杂的功能，因此是细胞治 疗的主要细胞来源。? 由于造血干细胞具有自我更新、多向分化、重建长期 造血、采集和体外处理容易等特点，因此是基因治疗最理想的靶细胞之一。 (二) 神经干细胞 8 传统观点认为，哺乳动物和人神经系统的神经元在出生后不久就丧失其 再生能力，然而近来的一些研究证明，神经系统中存在部分原始细胞仍具有 自我更新和增殖能力，而且在特定因素影响或诱导下，可向神经元和神经胶 质细胞分化，这些细胞被称为神经干细胞(neural stem cell, NSC)。1992 年Rynolds 和Weiss首先在成体小鼠的脑旁侧室膜下的神经组织中分离出神幻灯21 经干细胞，Svendsen等则从人的胚胎中分离出神经干细胞。 神经干细胞主要分布于脑室外下区、嗅球、海马、脊髓等处，其主要特 征包括自我更新能力、增殖能力和多向分化能力。特殊标志物包括Nestin及 波形蛋白等。神经干细胞的分裂方式既有不对称分裂，也有对称分裂。 由于神经干细胞有潜在的分化能力，因而，当成体神经组织受损后，亦 可考虑利用特定的环境因素诱导神经干细胞向相应的神经组织或细胞分化， 进而用其替代损伤组织或细胞。另外，因神经干细胞具有较强的增殖能力， 故植入成体神经组织后也易于存活。应该说神经干细胞在损伤神经组织、细 胞的修复应用方面会有良好的前景。 (三)间充质干细胞 间充质干细胞(mesenchymal stem cell, MSC)形成于发育中的骨髓腔。 个体出生后，间充质干细胞附于骨髓窦的内腔面，形成一种包埋于窦状网络 中的三维细胞网络。间充质干细胞在尚未建立造血功能的骨髓中，分裂旺盛， 类似前成骨细胞(preosteoblast)。在具造血功能的骨髓中，间充质干细胞是 静止的，但是仍然高水平表达成骨细胞的特征性标记碱性磷酸酯酶。 幻灯22 人的间充质干细胞属于专能性干细胞，可以像未分化细胞那样进行体外 扩增，也可以分化为间充质类细胞。其特异性表面抗原较多，如SH2、SH3、 CD29 等。间充质干细胞可分化为多种间充质组织，如骨、关节、脂肪、肌腱、肌 肉、骨髓基质等。从人骨髓中获得的间充质干细胞体外可专一性的诱导分化 为脂肪细胞，软骨细胞和成骨细胞。 由于间充质干细胞可以在体外相对容易的诱导为成骨细胞、软骨细胞， 因此间充质干细胞在骨损伤和先天骨组织畸形的治疗方面将有广泛的应用。 (四)表皮干细胞 近年来的研究表明，表皮和毛囊中存在一些具有高度自我更新能力并可 分化为表皮和毛囊角质细胞的原始细胞，称表皮干细胞(epidermal stem cell)。无毛囊处表皮的干细胞存在于表皮基底层，而毛囊干细胞则位于毛囊 9 的膨胀部位。表皮干细胞的生化标志有KS、K14，整合素及一些黏附蛋白，但 至今人们对表皮干细胞的特征仍缺乏描述。 (五)肠干细胞 小肠内表面有许多围绕隐窝(crypt)并根植于肠壁的绒毛，绒毛的基部 与隐窝相续，每一隐窝大约含有250个细胞。实验证明这些细胞中有起再生 作用的干细胞存在，因为把隐窝细胞注射到受照射的小鼠体内后，在受体鼠 的肠部位可发现其中有些移植细胞能分化发育成肠绒毛或绒毛细胞。进一步 的实验发现这些细胞位于隐窝基部或近基部。这些增殖缓慢的肠干细胞幻灯23 (intestinal stem cells)可转变为过渡放大细胞，移向隐窝中部，并分化为 吸收细胞、杯状细胞和肠内分泌细胞，它们还可以向肠腺基部分化产生潘氏 细胞。尽管肠干细胞的位置已很明确，但是肠干细胞的体外培养至今未获成 功。 (六)肝干细胞 自1937年Kinosita首次提出肝脏中存在可分化为肝细胞的干细胞样细 胞后，肝干细胞(hepatic stem cell)的存在就一直处于人们的关注和争论之 中。近年来由于对啮齿类动物及人类肝病发病机制研究的进展，才肯定了肝 干细胞的存在。我国第二军医大学细胞生物学教研室胡以平等的研究发现， 小鼠胎肝和成年鼠肝脏中均存在肝干细胞。在成体肝脏中，肝干细胞可能存 在于Hering管位置，即终末胆管向细胞间胆管过渡的区域，也有人认为组成 Hering管的胆管细胞可能就是肝干细胞。 关于肝干细胞的形态与特征，目前还知之甚少。但已发现的两种细胞被 认为与肝干细胞有着密切的关系:一种是从小鼠肝中分离得到的“卵圆细 胞”(oval cells)，它因形态小，细胞质少、细胞核呈卵圆形而得名，有人 提出这是一种休眠的肝干细胞;另一种是从大鼠肝中分离到的“小肝细 胞”(small hepatocytes)。它们本身就是肝干细胞还是肝干细胞的子代，目 前仍不能确定。 (七)生殖干细胞 在众多生物中，生殖干细胞(germline stem cell，GSC)是配子发生 的中枢。。早在一个多世纪以前，有人就提出了生殖系中存在干细胞的推测。幻灯24 近几十年来的研究发现生殖系中存在着多种形式的干细胞，但雌性脊椎动物 (尤其是哺乳动物)的卵巢中，尚未得到生殖干细胞存在的证据。 10 根据自更新的方式，生殖干细胞可以分为两种类型。第一种类型称为定 型生殖干细胞。它们严格地通过不对称分裂进行自我更新，每次分裂的结果 是产生1个子代生殖干细胞和一个分化了的子代细胞。第二种类型称为群体 生殖干细胞，它们行对称分裂，由此产生的2个子细胞进行分裂和分化的概 率相同。因为这样，它们能够在群体水平上保持自身数目的恒定，而它们的 集体行为则成为生殖细胞的稳定来源。 幻灯25 目前发现的哺乳动物生殖干细胞主要是精原细胞(spermatogonium)，它 紧贴曲细精管基膜，圆形或椭圆形，直径12μm，核大，除核糖体外，其它细幻灯26 胞器不发达。精原细胞分A、B两型， A型精原细胞的核常染色质丰富，缺少 异染色质，核仁常靠近核膜，根据其在曲细精管基膜上的局部排列特征，A 型精原细胞又可分为A (A)、A (A) 及A (A) 三型。正常情况 singlespairedpralignedal 下，大约一半的A型精原干细胞分裂形成A型精原细胞，而另一半精原干细 spr 胞则以自我增殖的方式保持干细胞数量，A型精原细胞进一步分裂形成A pral型精原细胞，A型精原细胞再分裂形成A型精原细胞，A型精原细胞经过六 al11 次连续分裂，形成A，A，A及中间型精原细胞，最终分化为B型精原细胞。幻灯27 234 B型精原细胞核中富含异染色质，核仁位于中央，经数次分裂后，体积增大， 分化为初级精母细胞。 四、肿瘤干细胞 早在上世纪六、七十年代，人们在研究骨髓瘤、肺肿瘤、卵巢肿瘤、神 经母细胞瘤等多种肿瘤时发现，肿瘤组织中仅有极少数的肿瘤细胞具有肿瘤 形成能力，并提出肿瘤组织中存在肿瘤干细胞(tumor stem cell, TSC)的 假说，该假说认为:肿瘤组织与正常组织一样，由处于各种分化等级的细胞 组成。其中有一个在数量上占少数的细胞群体，它们具有无限增殖的能力和 分化多潜能性，能够通过分裂自我增殖并产生大量增殖能力有限的其它肿瘤 细胞，是肿瘤形成的起始细胞。但是由于实验方法及条件的限制，对肿瘤干 细胞的存在与否一直没有定论。近几年，一些实验证据表明，在白血病及一 些实体肿瘤中存在具有无限增殖能力和肿瘤形成能力的细胞群，这才使肿瘤 干细胞的存在得以证实。目前认为，肿瘤干细胞是存在于肿瘤组织中的一小幻灯28 部分具有干细胞性质的细胞群体，具有自我更新能力、肿瘤形成能力和分化 为不同分化程度肿瘤细胞的能力，对肿瘤的发生、转移、恶化和复发起决定 性作用。一些文献也将其称为癌干细胞(cancer stem cell, CSC)或肿瘤起 11 始细胞(tumor-initiating cell, T-IC)。 (一)肿瘤干细胞的提出 1958年，Hewitt等在研究骨髓瘤时发现，仅有1%或更少的白血病细胞在 体外培养时能够形成克隆;在体内仅有百万分之一的白血病细胞具有维持这 种疾病的能力。随后，Humburger等又发现，体外在软琼脂培养基上培养的肺 肿瘤、卵巢肿瘤和神经母细胞瘤细胞中，也只有0.02%至0.1%的细胞有克隆幻灯29 集落形成的能力。这些研究均证实，肿瘤组织中仅有极少数的肿瘤细胞具有 形成肿瘤的能力。由此，人们提出了“肿瘤干细胞假说”， 认为肿瘤组织中 只有小部分肿瘤干细胞才有成瘤性及维持恶性表型的作用，但由于条件的限 制，当时人们并没有真正证实并分离得到肿瘤干细胞。 为了解释肿瘤组织中仅有极少数的肿瘤细胞具有肿瘤形成能力的现象， 人们提出了两种学说:Stochastic与Hierarchy学说。Stochastic学说(又 称随机理论)认为:肿瘤细胞是一个功能均质的群体，所有的肿瘤细胞都处 于相同的分化阶段，具有相同的分裂增殖能力，只是其进人细胞周期发生增 殖分裂是由一些低概率的随机事件控制的，所以，表现出来的现象就是只有 很少的细胞能够形成克隆;Hierarchy学说(又称类别理论或等级理论)认为: 肿瘤细胞是一个异质的群体，是由处于各种分化等级的细胞组成的，只有少 量的原始细胞(即肿瘤干细胞)才具有分裂增殖能力，这类细胞高频地引发 肿瘤，表现为体外培养时能够形成克隆，体内具有维持疾病的能力。 (二)肿瘤干细胞的证实 近几年，随着非肥胖性糖尿病/重症联合免疫缺陷小鼠(nonobese diabetic/severe combined immunodeficient mice, NOD/SCID mice)、流式 细胞仪分选技术和其它相关技术的出现，才使人们得到了肿瘤干细胞存在的幻灯30 直接证据，目前已相继发现了急性髓系白血病干细胞(acute leukemia-initiating cells, LIC)、乳腺癌干细胞(breast cancer-initiating cell, BrCa-IC ) 和脑瘤干细胞(brain tumor stem cells, BTSC)等多种肿瘤干细胞。研究表明，这类细胞与正常干细胞相似， 具有自我更新和多分化潜能，特别之处是它们具有很强的致瘤性，分化后能 形成与原发肿瘤类型完全相同的肿瘤组织。 肿瘤干细胞的特征 肿瘤干细胞在很多方面与正常组织中的干细胞相 似，例如:?数量极少;?具有自我更新和多分化潜能;?对组织的形成起 12 决定性作用;?表达多种抗药性蛋白，对许多化疗药物具有抗性;?使用相 同的信号传导通路;?表面分子标志非常相似。但是肿瘤干细胞与正常组织 中的干细胞也存在很多不同之处，例如:?肿瘤干细胞的自我更新和分化是 不受控制的，所以，肿瘤细胞的数量，随着时间的推移会越来越多，肿瘤组 织呈现无限增长趋势;?肿瘤干细胞分化产生的是不正常的子代细胞;?肿 瘤干细胞可以转移，在新的环境下，形成与原发肿瘤类型完全相同的肿瘤组 织。 肿瘤干细胞的来源 肿瘤干细胞的起源目前尚不清楚，由于肿瘤干细胞 在很多方面与正常的成体干细胞非常相似，所以很多人认为肿瘤干细胞是由 正常的成体干细胞发生突变，使得自我更新以及分化失去控制后形成的。但 是也有人认为:肿瘤干细胞是由祖细胞或成熟细胞发生基因突变，重新获得 自我更新能力和分化潜能后形成。 幻灯31 (三)几种肿瘤干细胞 1. 急性髓系白血病干细胞 急性髓系白血病干细胞是第一个被发现的肿瘤干细胞，其细胞表面标志 +--为CD34CD38Thy。它们在肿瘤细胞中占的比例很小(仅为0.2%)，体外培养 时可形成集落，移植到NOD/SCID小鼠后能形成类似于人类急性髓性白血病。 在表型上，它们与正常的造血干细胞非常的相似，提示白血病干细胞很可能 是由造血干细胞或处于分化上游的祖细胞发生突变形成的。 2. 乳腺癌干细胞 乳腺癌干细胞是第一个被发现的实体瘤干细胞，其细胞表面标志为 -++-/LOWLinESACD44CD24。它们仅占肿瘤细胞总量的2%，与早期多能上皮祖细胞 有着相似的表型，具有很强的肿瘤形成能力，其在NOD/SCID小鼠中的成瘤能幻灯32 力至少是其他肿瘤细胞的50倍，即使少于100个细胞也能在小鼠体内成瘤， 成瘤后的肿瘤组织中既含有乳腺癌干细胞又具有其他肿瘤细胞，表明乳腺癌 干细胞具有自我更新能力和不断分化能力，即可通过自我更新维持自身细胞 的数量，又可分化产生多种具有有限增殖能力的其它类型乳腺癌细胞。 3. 脑瘤干细胞的发现 脑瘤干细胞主要是通过体外实验的方法鉴定的，其重要的细胞表面标志 +为CD133，另外还有巢蛋白(nestin)等。它们在体外克隆培养时能形成神 经干细胞球样的结构，具有自我更新和增殖能力，分化时能形成与原发肿瘤 13 相同的肿瘤类型。 (三) 肿瘤干细胞的启示 肿瘤干细胞概念的提出，标志着人们对肿瘤认识的进一步深化，它将对幻灯33 于肿瘤发生机制、预防和治疗肿瘤产生深远的影响。 首先，对肿瘤干细胞的认识可能改变肿瘤治疗的传统思路。目前常规的 肿瘤治疗方法是不加区分的杀灭增殖细胞，肿瘤干细胞对这类方法并不一定 敏感，因为肿瘤干细胞可能并不是肿瘤组织中增殖最旺盛的细胞。肿瘤干细 胞的提出将会使研究人员转向寻找对肿瘤干细胞有特异性杀伤作用的分子，幻灯34 这些分子有望成为更加有效的肿瘤治疗药物。其次，肿瘤干细胞的提出也会 影响人们对肿瘤耐药性的认识。已经发现正常干细胞表面存在许多与耐药性 相关的转运通道，这些通道可以将药物泵出细胞，类似的通道也存在于肿瘤 干细胞，这提示，肿瘤干细胞正是导致肿瘤耐药的细胞。 第二节 细胞工程 幻灯35 一、概述 从70年代开始，由于细胞融合技术的迅速发展，在生物工程中兴起了一幻灯36 个新的领域，即细胞工程。细胞工程就是应用细胞生物学和分子生物学的方 法，在细胞水平进行的遗传操作。这是一个涉及改变细胞遗传物质的技术领板书 域。细胞工程又是一门渗透工程学的生物学，因而是一门综合的科学技术。 它的最终目的是为了生产特定的生物产品，快速繁殖的培育新的优良品种。 幻灯37 有人根据设计要求，按研究对象中需要改造的遗传物质不同，将细胞工 程分为基因工程(gene engineering)、染色体工程(chromosome engineering)、染色体组工程(genome engineering)、细胞质工程(cytoplasm engineering)和细胞融合等五个方面。这个范围相当广泛，几乎包括了所有 的细胞操作和遗传操作。 细胞工程按其对象不同，也可分为微生物细胞工程、植物细胞工程和动幻灯38 物细胞工程。本章将主要介绍动物细胞工程。 动物细胞工程所涉及的主要技术有:组织培养、细胞融合、细胞拆合、 染色体或染色体组转移，以及基因转移、核移植、组织工程等方面，是从细 胞结构的不同层次对细胞进行遗传操作的，即细胞整体层次(细胞融合)、细 胞器层次(核移植、改变染色体倍性或组成)和分子层次(外源基因导入)。 14 其应用领域除基础理论方面的研究以外，还包括生产单克隆抗体和细胞因子、 生产特殊动物、生物特殊蛋白质和多肽药物、生产特殊器官和组织的保修方 面，在生物医药工业中占有越来越重要的地位。 二、动物细胞工程所涉及的主要技术领域 (一)组织培养 组织培养一般用来泛指在适合培养条件下，一切可以使生物组织和细胞 离体地生长和增殖，并保持其结构和分化状态的技术。严格说来，上述概念 是不准确的，因为把细胞培养、组织培养(tissue culture)和器官培养(organ culture)这三个不同层次的概念混为一谈了。根据有关规定，细胞培养指的 是细胞在体外条件下的生长，在细胞培养过程中，细胞不再形成组织。组织 培养指的是组织在体外条件下的保存或生长，此时可能有组织的分化，并保 持组织的结构或功能。而器官培养则是指器官的胚芽(organ rudiments)、幻灯39 整个器官或器官的一部分在体外条件下的保存或生长，此时也能有器官的分 化，并保持器官的立体结构或功能。 (二)细胞融合 细胞融合(cell fusion)又称细胞杂交(cell hybridization)。它是 指细胞彼此接触时，两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的过程。在自 然情况下，体内或体外培养的细胞发生融合的现象，称为自然融合。而在体 外用人工方法(使用融合诱导因子)促使相同或不同的细胞间发生融合，称 为人工诱导融合。它是60年代发展起来的一项新技术。 常用的诱导因子有:生物的(如灭活的仙台病毒)、化学的,如聚乙二醇 (PEG)]和物理的(如 80年代发明的电融合)因子。细胞融合的结果，可形 成双核或多核的细胞，含两个不同亲本细胞核的细胞称为异核体 (heterokaryon);含同一亲本细胞核的细胞称为同核体(homokaryon)。存 活的异核体细胞通过有丝分裂，来自不同细胞核的染色体可合并到一个细胞 核中称为合核体(synkaryon)，也就是杂种细胞(hybridcell)。并且可通过 选择培养等方法，筛选出所需的杂种细胞。 细胞融合的范围很广，从种内、种间、属间、科间一直到动、植物两界 之间都获得成功。目前，这一技术已成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和幻灯40 生物新品种培育等的重要手段。特别是利用细胞融合技术而发展起来的杂交 瘤(hybridoma)技术，为制造单一的抗体开拓了新途径。这是生命科学领域 15 中研究技术的一个革命性突破，具有无比广阔的前景。 (三)细胞拆合 板书 细胞拆合是指以一定的实验技术，从活细胞中分离出细胞器及其组分，幻灯41 然后在体处一定条件下，交不同细胞来源的细胞器及菲人组分进行重组，使 其重新装配成具有生物活性的细胞或细胞器。 细胞器的装配 幻灯42 细胞器的拆合是离体的装配过程。如线粒体的装配，集中在其内膜变化 的研究。用内膜脂质和内膜蛋白质，可以合成一些闭合囊泡，具有合成ATP 的功能，只是在形态取向上，似乎是翻向外面的线粒体内膜囊泡，即“内翻 外”囊泡。细胞膜的装配，已能在适当条件下，使红细胞的空壳或从细菌中幻灯43 获得的去除细胞质的单位膜小泡，重新溶解、分级，重新组合而形成具钠、 钾泵性质、具电子传递和磷酸化生物合成等功能的膜结构。 细胞的装配 用显微操作器能进行细胞各部分的解剖，细胞各部分物质的抽取和移植、 注入各物质、测量微电位的变化等等。近年来，已开始在哺乳类细胞中得到 应用，该方法为研究细胞内的基因表达与调控，同时也为改良品种提供了一 种重要手段。 用两栖类的卵进行去核与植物实验已获得成功。从囊胚或原肠胚的细胞 中取出细胞核，再植入到同种的去核的卵中，可发育成正常胚胎。甚至用两 栖类的肿瘤细胞核移植至正常去核卵内，也获得了异常和正常个体。鱼类的 细胞核移植研究，已为克服鱼类之间远缘有性杂交的严重缺陷，培育出亚种 间、属间甚至目间的鱼类新品种提供了可能性。 细胞质杂种细胞的研究 1972年，Prescott首先成功地借助细胞松弛素B的诱发排核作用，分离 而得到一种哺乳动物细胞的胞质体(cytoplast)。 胞质体能在体外正常培养条件下，存活16,36小时，并呈现贴壁、铺展幻灯44 及运动等行为。电镜观察表明，胞质体内的细胞器与完整细胞相同，并占有 各自固定的位置。说明去核胞质体是深入研究细胞质作用的重要样品，胞质 杂种细胞是不同种系之间的一种真正的新型细胞，在适宜条件下能成功地生 存下去。 为了判明重新装配的细胞，并非只是原细胞中夹杂着掺入的核本 16 (karyoplast)与胞质体颗粒，往往用双标记法鉴别真伪，80年代以来，又 发展了一种形成杂种细胞或多核细胞的快速、简便方法，即电融合技术，这 是细胞工程的又一重大进展。该技术是在相互紧贴的真核细胞群中，通过高 频方波电脉冲，使在几十分钟内，形成杂种细胞或具几个至几十个核的多核幻灯45 巨大细胞。这些新形成的多核巨大细胞，必将对细胞生物学及其它一些应用 领域，如医学科学等产生重大影响。 (四)染色体转移 染色体转移是在染色体层次上建立一种新的技术体系，把同特定基因表 达有关的染色体或染色体片段转入受体细胞，使该基因得以表达，并能在细 胞分裂中一代又一代地传递下去。目前已建立的有两种方法:一是微细胞介 导的基因转移法(microcell mediated gene transfer，MMGT)，另一为染色 体介导的基因转移法(chromosome mediated gene transfer，CMGT)。前者 是指以微细胞作供体，通过与遗传完整的受体细胞融合，即可将微细胞内所 含的一条乃至几条染色体转移到受体细胞中去。用染色体介导作基因转移则幻灯46 是由受体细胞经细胞的胞吞作用来实现的，因而在此系统中仅有亚染色体片 段保持在受体细胞中。 其方法包括:微细胞介导(微细胞的制备和微细胞的融合)，染色体介导 (细胞同步化与染色体分离、中期染色体的转移)。然后对导入基因的受体细 胞进行分离和鉴定。 自从1973年发现染色体转移技术以来，这一技术正得到不断的完善和发 展。它不仅能将各种可供选择的基因导入受体细胞，而且还可以用于确定基 因在染色体上的连锁关系，研究病毒DNA的染色体整合现象以及从遗传角度 去培养细胞的成瘤表现。 (五)DNA介导的基因转移 DNA介导的基因转移是指应用分子生物学和细胞生物学手段，将纯化的外 源DNA导入受体细胞，并使外源DNA所包含的基因在受体细胞内进行表达的 过程。DNA介导的转移基因技术的发展，为基因分离、纯化、基因表达的控制、 基因定位以及基因治疗、遗传育种等开拓了一条新的途径。 板书 基因转移的方法有:DNA,磷酸钙法、载体携带法及显微注射法。 幻灯47 通过以上方法将纯化的外源DNA引入受体细胞后，必须从大量细胞中筛 选出已经被外源DNA转化了的细胞。筛选方法的设计取决于所转移基因的特 17 性和受体细胞的遗传性状。 DNA介导的基因转移技术是分离基因的有效手段之一。80年代初以来， 国内外一些实验室利用这一技术研究肿瘤细胞DNA的转化作用，成功地证明 了肿瘤细胞DNA中具有转化功能的癌基因的存在，并分离得到多种癌基因。 幻灯48 DNA介导的基因转移结合荧光激活细胞分类器(fluorescence-activated cell sorter)分析，是分离编码细胞表面抗原基因的有效途径。 利用显微注射技术，将外源基因导入受精卵或胚泡内，再移植到假孕动 物子宫内继续发育，是发育生物学探讨基因整合、表达和功能的独特的途径。 (六)核移植(nuclear transplantation，NT) 幻灯49 核移植是将动物早期胚的细胞核或卵裂球(供体核)移植到去核的受精 卵或成熟卵母细胞(受精卵)中，重新构建新的胚胎，然后通过体内或体外 培养使重构胚发育为与供核胚胎基因型相同后代的技术过程。因为采用这项 技术可以不经过有性繁殖而通过人工操作就能复制出同基因型的动物，所以 人们把这种技术又称为动物克隆(cloning mammals)技术或无性繁殖技术。 幻灯50 核移植的研究，不仅在探明动物胚胎细胞核的全能性，及核质关系等重 要的理论问题方面具有重要的科学价值，而且在畜牧业生产中有着非常重要 的经济价值和应用前景。 卵母细胞的去核及受体细胞的准备 牛、羊等家畜的核移植目前均以发育为减数分裂中期II的成熟卵母细胞幻灯51 为受体细胞。这种卵母细胞的来源包括体内成熟的和体外成熟的。体内成熟 的卵母细胞是从超数排卵处理母畜的输卵管中手术采集的。体外成熟的卵母 细胞是从屠宰母畜的新鲜卵巢中采得的，经体外培养成熟后作受体细胞。将 这些卵母细胞去核的方法有三，一是盲吸法，二是切割法，三是功能性去核。 早期胚的分离及供体核的准备 幻灯52 在生产性或商品化核移植时，要求供体核来自遗传上优秀的个体。供体 核的来源包括体内或体外受精的2,细胞期至囊胚期的早期胚胎。体内受精的 胚胎是从超排卵处理的母畜用手术(兔、羊和猪等)或非手术(牛)方法采 得。 供体核的移植及细胞融合 幻灯53 供体核的移植是将供体核(卵裂球)移入去核卵母细胞的技术过程。这 一过程的操作较为简单，在倒置显微镜下，用显微操作器的吸管将供体核通 18 过去核过程中透明带上所留下的孔道，移入受体细胞卵周隙内。然后，用人 工诱导作用使供体核与受体细胞相融为一体，以重组为新的胚胎。 幻灯54 核移植胚的培养和移植 核移植胚的培养可以分为体内和体外两种培养方法。体内培养是将核移幻灯55 植胚用琼脂包埋后移入绵羊或家兔输卵管内。培养4,5天后，交桑椹期、囊 胚期的胚胎用手术(羊、猪和兔)和非手术(牛)方法移植于同步发情受体。 目前，多数人都采用这种方法，但操作比较复杂，成本高，不利于商业性核 移植。体外培养可以节省劳力和，其方法与体外受精卵的培养完全相同 (参考本篇第一章)，但发育率不如体内受精卵，其原因及有效的培养方法尚 有待进一步探索。 (七)组织工程 幻灯56 “组织工程”是指应用工程学和生命科学的原理和方法来研究正常或病 理状况下哺乳动物组织的结构、功能和生长的机理，研究开发能够修复、维 持或改善损伤组织的人工生物替代物的一门学科。 目前在体外构建含活性细胞成分的工程组织的核心方法是:首先分离自 体或异体组织的细胞，经体外扩增后达到一定的细胞数量后，将这些细胞种 植在预先构建好的聚合物骨架上，这种骨架提供了细胞三维生长的支架，在幻灯57 适宜的生长条件下(通常通过培养系统技术对培养条件进行控制)，细胞沿聚 合物骨架迁移、铺展、生长和分化，最终发育形成具有特定形态及功能的工 程组织。这一技术的关键是在对细胞进行体外培养过程中，通过模拟体内的 组织微环境条件，使细胞得以正常生长和分化，此过程通常包含三个关键步 骤:首先需大规模扩增从体内分离获取的少量细胞，对于贴壁依赖性细胞，幻灯58 可使用常规的单层培养方法，传代培养后即可达到足够的数量;第二步是在 聚合物骨架上种植这些细胞，通过对骨架的内部结构与表面性能的优化设计， 在细胞-材料及细胞-细胞的相互作用下，诱导细胞进行分化;第三步是采用 灌注培养系统，维持稳定的环境条件，使工程组织维持长期的分化状态。采 用这些程序已成功地在体外培养了人工软骨、皮肤等多种组织。 (八)转基因动物 转基因动物(transgenic animal)是通过基因工程技术将目的基因导入 生殖细胞 或早期胚胎，并整合到受体细胞的基因组中，它们经过各种发育途幻灯59 径形成所有细胞都包含目的基因的个体，即转基因动物，也称个体表达系统。 19 这种转目的基因的过程称为“转基因建成”(transgenesis)。两个品种间的 杂交，不论是有性还是无性杂交，但由于不是用基因工程技术转移目的基因， 虽然个体获得新基因，也不能称为转基因动植物。 研究转基因动物的途径 1.受精卵原核显微注射 这是研究转基因动物最早、最普遍采用的方法， 也是最成熟的方法。本方法是在倒置显微镜下，将直径约1um细玻璃管插入幻灯60 受精卵的雄原核中，将针管内含有外源基因的DNA溶液注入原核，然后，将 这个被注射的受精卵移植到假孕母鼠的输卵管内，在其子宫发育成子代小鼠。 用外源基因作为探针，对每个子代小鼠的DNA进行Southern blot检测，把 产生杂交带的小鼠挑出来，它们即为转基因小鼠。用免疫荧光和Western blot 检测可以检测出哪几个转基因小鼠体内已有外源基因的产物，以证明外源基 因已在动物体内获得表达。这个方法的优点是外源DNA在宿主动物染色体上 的整合率高，可达到30,;每次注射外源基因长度可达50kb。其缺点是外源 基因是否能稳定地整合到受体基因组中，要等到子一代出生后以后经过选择 才能确定。这对许多生育周期长，产仔数少的大家畜来讲，效率就很低了。 2. 逆转录病毒感染 病毒作为载体具有很高的基因转移效率。现在最有 希望的病毒载体是逆转录病毒载体。由于逆转录病毒载体DNA没有合成病毒 蛋白的能力，所以被转化的宿主细胞不会再产生有害的病毒颗粒，在安全的 情况下，能够合成目的基因的产物，以满足人们的需要。这种逆转录病毒载 体有许多优点，能高效感染宿主细胞，感染率可高达100,。 3. 胚胎干细胞的介导 近年来，科学家经过20年的努力，发展了另一 种新的哺乳类遗传工程的方法――转基因动物育种的ES细胞途径。ES细胞即幻灯61 早期胚胎干细胞。 这种途径是用各种方法把外源DNA导入体外培养的胚胎多能干细胞(ES 细胞)，经筛选后获得整合稳定和表达好的转化细胞系，然后将这些细胞注入 受体囊胚腔中，聚集在内细胞团上，并参与其分化，发育成为嵌合体的生殖 系统中去，它能分化成为生殖细胞。再通过杂交繁育使这些ES细胞变成的生 殖细胞:精子和卵子结合，得到具有目的基因的纯合体，也即转目的基因动 物。这个新途径是ES细胞体外培养技术和嵌合体技术结合而形成的，是从20 世纪60年代起开始，经过科学家30年左右的长期努力建立起来的。当然还幻灯62 末达到成熟阶段，但正在蓬勃地发展。在20世纪末21世纪初将会有突破性 20 的进展。这个途径的技术工作可分成三大步骤:即(1)ES的分离和建立细胞 株;(2)嵌合体小鼠的制作;(3)通过具有目的基因和选择基因的逆转录病 毒载体转化的ES细胞形成转基因小鼠。 三、细胞工程技术的应用 (一)生产单克隆抗体和细胞因子 生产单克隆抗体 1975年Kohler和Milstein建立B淋巴细胞杂交瘤技术以制备单克隆抗 体以来，针对各种抗原的单克隆抗体已被广泛应用于生命科学的各个领域。 幻灯63 B淋巴细胞杂交瘤技术不但将淋巴细胞产生单一抗体的能力和骨髓瘤增 生的可能性巧妙地结合起来，并且还可以通过融合进一步的筛选获得具有期 望专一的抗体。 单克隆抗体的最主要的优点在于它的专一性、均质性、灵敏性以及无限 量制备的可能性。 单抗在生物工程技术中占有很重要的地位，已作为商品进入市场，前景 不亚于基因工程产品。其用途有以下几方面: (1)单抗作为体外试剂:单克隆抗体最广泛的商品用途，目前仍然是用 作体外诊断试剂。 (2)单抗作为体内诊断试剂:用同位素标记的单抗，在特定的组织中成 像的技术，可用于肿瘤，心血管畸形的体外诊断。 (3)单抗作为导向药物的载体:单克隆抗体最大的应用前景是有可能作 为导向药物的载体。导向药物是指以具有导向能力的物质为载体的药物，据 信在下一世纪导向药物将普遍取代目前的常规药，特别是抗癌药物抗生素等。 幻灯64 (4)作为治疗用的单克隆抗体:它必须具有专一性高、稳定性好、亲合 力强、分泌量大、针对非脱落抗原在靶细胞上的分布密度高等特点，但这是 很难获得的。 此外，近来报道用单克隆抗体检测工业生产及各种焊缝管道中的早期腐 蚀;人为某些化学工业的催化剂等。 T淋巴细胞杂交瘤和淋巴因子 T淋巴细胞在免疫系统中占有极重要的位置，它既是调节细胞又是效应 细胞。 目前，使T淋巴细胞长期在体外自下而上的方法有四种:?应用外源性 21 的T生长因子[白细胞介素2(interleukin 2，IL,2)]抗原不断再刺激的方 法，使T细胞系和T细胞克隆;?应用辐射白血病病毒(radiation leukemia virus)来转化T细胞，以建立永久化的T细胞培养系;?从已建立的淋巴瘤 系中来筛选有用的T细胞系;?应用杂交瘤技术来建立T淋巴细胞杂交瘤。 目前，对T淋巴细胞杂交瘤还牌理论研究阶段，为进一步用于诊断和治 疗打下基础。 幻灯65 (二)生产特殊动物 1.改良家畜品种 (1)转基因鱼 我国学者朱作岩(1985)是国际上首次将小鼠MT/ 人GH 融合基因注入金鱼受精卵中，获得了转基因金鱼。转基因金鱼的F1代比转基 因鱼的同代大两倍。至今他的实验室已获得鲫、红鲫、银鲫、红鲤及泥鳅的 转入生长激素基因鱼。经放射免疫检测证明，人的生长激素基因能在转基因 鱼的体内正常表达，转基因鱼的生长速度明显加快，生长激素基因还能于传 至后代。 在国际上，美国、加拿大和日本等国用鱼类的生长激素基因、催化素基 因和抗冻蛋白基因等进行了这项研究工作，并获得了转基因虹鳟鱼、转基因 鲑鱼等。 (2)转基因鸡 制作转基因鸡的转基因技术不同于哺乳类和鱼类，常用 的方法是以逆转录病毒为载体，感染刚产出的受精的胚盘，从而达到目的基 因导入种蛋的目的。到目前为止，所有的转基因鸡都是用这种方法制作的。 美国农业部地区家畜研究所，以Grittenden为首的研究小组首次采用含有A 亚型囊膜基因的、致病性低的逆转录病毒(RAV-O-A)感染系鸡的胚盘，获得幻灯66 转A亚型囊膜基因鸡，命名为AVI6，系鸡是不含内源性白血病病毒的鸡。AVI6 不能产生传染的禽白血病病毒(ALV)，而能编码囊膜糖蛋白，它对致病性A 亚型鸡白血病病毒的感染具有高度的抵抗力。这个事实表明，插入病毒囊膜 基因可能产生对某些病毒具有抵抗力的转基因家畜。美国农业部的报告认为， 如果抗A亚型禽白血病病毒的转基因用于养鸡，每年可使养鸡业减少几亿美 元的损失。 (3)转基因猪 人们为了提高猪的生产性能，希望能对瘦肉型猪基因工 程育种研究育成生长快、肉质好的新猪种。1985年Harmmer和Berm两人首次 分别用显微注射技术把MT为启动子的人生长激素融合基因(MT/hGH)注入猪 22 的受精卵雄原核内，并将这些受精卵移植入假孕母猪，前者得到了11头人生 长激素表达的转基因猪，后者得到了1头转基因猪。1987年，Pindert等人 和Pursel等人分别用MT为启动子的牛生长激素融合基因(MT/bGH)通过显 微注射法，获得了8头可表达牛生长激素的转基因猪。Vize (1988)采用猪 生长激素基因与MT启动子的融合基因注入猪受精卵内，获得1头可表达猪生 长激素的转基因猪。Ebert等(1988)获得转基因大鼠生长激素基因猪。 2.遗传病动物模型的研制 幻灯67 我们要以把致癌基因导入受精卵原核内，形成转致癌基因小鼠，它可成幻灯68 为研究某些癌基因的致癌机理和其表达的调控过程的模型。这种转基因动物 即为“癌模型鼠”。 用SV40 DNA MT启动子重组成不同的重组DNA产生的转基因小鼠， 发现 的成体常出现脑脉络丛乳头瘤(tumors of the choroid plexus)。发生瘤细 胞的组织在未产生瘤细胞之前，在组织内检测不到SV40大T抗原，只有在产 生癌细胞之后组织内才有SV40大T抗原及其mRNA的存在。这说明在胎儿发 育时期T抗原基因是处在非活化状态，而到成体得到激活因子激活T抗原基 因后，产生T抗原，导致肿瘤的发生，这项工作是由Brinster等(1984)完幻灯69 成的。Hanahan(1985)用胰岛素基因的强化子与SV40大T抗原基因重组， 导入小鼠的受精卵内，则在这种转大T抗原基因小鼠中产生胰腺癌。Steward 等(1984)以同样方法把乳腺癌病毒的强化子与myc癌基因接在一起，这种 重组DNA所形成的转基因小鼠，在乳腺中可发生癌变，这种致癌性可转给后 代。这类建造转基因小鼠模型的工作发展很快，目前已有十多种癌基因被用 来建立“癌模型鼠”。 3.生物反应器 把目的基因导入动物体内形成转基因动物，基因在其体内表达，人们可 以从其乳汁和血液内获得目的基因产物，使动物像一个活的发酵罐目的基因 的产物，我们称它为动物生物反应器叵或个休表达系统。这种途径将发展成 为新一代的基因工程，构建新型的工业基地――分子耕作(molecular farming)或基因耕作(gene farming)。 我国著名学者施履吉等人用含乙肝病毒表面抗原S基因与小鼠MT启动 pMTSA及含有人生长激素基因SV40启动子小鼠MT启动子的pMTSA注射到兔卵 的原核中，注射卵在假孕母兔子宫内发育成兔。虽然，这些转乙肝病毒表面 23 抗原兔的血液中的表达量还很低，但说明用哺乳类(羊、牛、猪)个体可以 代替在体外进行酶化学反应装置系统的常规生物反应器。目前，英国正在研幻灯70 究用羊β-乳球蛋白启动子和乳清蛋白启动子控制，在转基因羊体内表达α1 抗胰蛋白酶和凝血因子?。在美国用β-乳球蛋白启动子和乳清蛋白启动子控幻灯71 制tPA基因和促进腺激素基因转基因小鼠、乳羊和乳牛中表达产生tPA和促 进腺激素。 (三)生产特殊蛋白质和多肽药物 蛋白质及多肽药物的基因工程是生物工程中最活跃和最有成果的领域之 一。究其原因，不外两个方面:一是由于蛋白质(多肽)是基因表达的直接 产物，便于应用重组DNA技术进行研究和生产;二是在生物体内含量很低。 现在人们应用DNA重组技术，将目的基因转入微生物中就可以大幅度增产， 降低成本，取得巨大的经济效益，因此，基因工程首先在医药研究方面取得 突破是不奇怪的。由于基因工程等生物技术的巨大经济效益和社会效益，世 界各国都积极投资去研究和开发生物技术。以1992年为例，美国政府投资38 亿美元，日本政府投资8亿美元，大批私人投资尚未计算在内。 世界上现在已有数十种基因工程药吕，其中已被批准临床使用并已商业 化的药品列于表11,2。基因工程人胰岛素以可以作为杰出的代表。胰岛素是幻灯72 治疗糖尿病的主要药物。世界上有34万胰岛素患者。过去从猪和牛的胰脏中 提了取胰岛素，得率低，而且在临床上有5,的病人有副反应。1979年，美 国Genentech基因工程公司将胰岛素基因转入大肠杆菌，1983年已大规模投 放市场。人生长激素主要用于治疗侏儒症，同时对烧伤、创伤、骨折等病症 也有很好的疗效。由于种族特异性的限制，过去只能从人尸体的垂体中提取， 治疗一个病人需要60个垂体，因此远远无法满足需要。1979年美国Genentech 公司成功地将人生长激素基因转入大肠杆菌中，一升培养物在7个小时内就 能生成相当于60个垂体的生长激素。另外α-干扰素、β-干扰素、红细胞生 成素、凝血因子?、γ-干扰素、人生长激素、人胰岛素等十余种基因工程药 物的销售量在全世界具有大幅度上升的趋势。 (四)生产特殊器官和组织 1、皮肤组织工程 人工皮肤是发展较快的一个领域，体外制造人工皮肤不再是一个技术难 题，目前已有数种产品用于临床治疗。与传统的治疗方法相比，使用人工皮 24 肤的优点包括:在对烧伤的治疗中可减少对供体组织的需求;减少伤口结疤 和收缩现象;对大面积急性伤口可实现快速覆盖;可作为传递外界生长因子 的载体等。 人工皮肤基本上可分为三个大的类型:表皮替代物、真皮替代物和全皮 替代物。表皮替代物由生长在可降解基质或聚合物膜片上的表皮细胞组成。 真皮替代物是用含有细胞或不含细胞的基质结构，用来诱导成纤维细胞的迁 移、增殖和分泌细胞外基质。而全皮替代物包含以上两种成分，既有表皮又幻灯73 有真皮结构。 由于相对较小的烧伤市场并不足以支持人工皮肤工程的深入发展， 所以 目前主要研究方向是针对不同的临床症状，特别是针对不同病因引起的慢性 溃疡开发对其最适宜的产品。 幻灯74 2、人工结缔组织 在重建外科领域，通过多种途径已成功地进行了自体软骨、骨、肌腱等 的移植。1994年第一次通过移植自体软骨细胞和骨膜瓣修复外伤性关节。同 年用可吸收生物材料如PGA(聚羟基乙酸)和间充质细胞构成的人工组织在裸 鼠皮下、鸡与兔子的关节缺损中进行了广泛的测试，证明可以形成软骨、骨 和肌腱，人工软骨现已在临床上成功应用。应用组织工程技术还可以进行血 管化的组织再生，将成骨细胞种植于预制的带血管蒂的生物降解载体上，将 它作为一种细胞传送装置，在实验过程中，用新生胎牛的骨膜细胞种植于聚 合物支架上，在动物体内培养两周以后，在移植于小鼠的右股动脉部位，六 周时见有软骨细胞形成，包围于骨化小岛四周，最后在12个标本中有10个 表面有新骨形成，骨化程度及骨形成密度均岁时间推移、血管长入的数量而 增加，最终在血管蒂旁形成有小梁结构的新生骨组织。其中用到的生物材料 对细胞有诱导、促进分化及控制组织外形的作用，另外也提供细胞附着面。 3、器官工程 实验中的组织工程已将目标瞄准在人工肝、胰或肾等器官。肝细胞系统 的研究目标主要集中在两个方面，即体外系统和体内系统。体外系统适用于 肝功正在恢复的病人，或作为移植前的一个“桥梁”。它的优点是可以更好幻灯75 地控制细胞周围系统的介质，例如改善供氧、营养物质及废物的排泄等，另 外可控制使用时间及应用阶段降低排异反应;缺点是易诱发血栓形成。植入 肝细胞法则有成为肝脏永久性替代物的可能，通过现有技术可在体外培养得 25 到大量肝细胞，然后将其转入到由生物基质构成的细胞生物反应器之类的装 置中发挥功能。由于这两个步骤不连续，且不能确知细胞的分化和功能状态， 因此功能并不很理想。这种内含培养的肝实质细胞的生物反应器可暂时使病 人度过昏迷。 关于研究发展具有生物活性的人工胰方面，具有代表性的是微囊包裹异 体细胞，即用半透膜包裹异体胰岛细胞，以便于胰岛细胞分泌的胰岛素进入 血液循环及从血液中吸收营养、氧气及其它维持代谢功能必不可少的物质， 此也能使胰岛细胞免受细菌和与免疫排斥有关的淋巴细胞、抗体的作用。它 可对体内胰岛素的水平变化起灵敏的反应，可长期存活以及分泌胰岛素。胰 岛细胞不受体内其它激素堆积的影响，但有一个问题就是胰岛素分泌量太少。 4、人工血管 Weinber等用牛肺动脉的内皮细胞、平滑肌细胞及成纤维细胞成功培养 了动脉血管，它包括内皮细胞层、平滑肌细胞胶原层和成纤维细胞胶原层。 内皮细胞层由一平滑的单细胞层组成，并覆盖90%以上的面积，此可使血管产幻灯76 生渗透屏障作用，一些大分子如白蛋白不能透过。L’Heureux于1993年采取 共培养成纤维细胞、平滑肌细胞和内皮细胞的方法成功得到人工血管。首先 使成纤维细胞在三维空间的网状管状物上铺地生长，然后再植上平滑肌细胞幻灯77 和内皮细胞，并灌注培养最后形成人工血管，所承受的压力可超过1000mmHg， 可被用来进行搭桥手术用的移植血管。 5、其它 管状组织工程的制作扩展到其它组织和器官的修建，如再造食管、气管、 小肠、尿道及肾脏等，最近的实验将尿道表皮细胞移植于用PGA制成的管状 体中，然后移植于受体鼠内，20天后在载体上出现2-3层尿道表皮细胞;同 样将狗胎儿小肠移植于共聚物管内，再移植于大鼠体内，几周后观察到分化 极佳的小肠表皮细胞的生长，且有分泌肠液的功能。 Khan用细碳丝作为支架研究受损轴突的再生能力，发现神经轴突可在支架引 导下进行一定长度的再生生长，所以通过提供神经细胞的生长支架可使神经 组织具有一定的恢复功能。事实上，细胞与支架表面相互作用对促进某一类幻灯78 细胞的生长行为是极为 (五)细胞治疗 基因治疗可以理解为将正常的有功能的基因转移到患者体内发挥作用， 26 以纠正患者体内所缺乏的蛋白水平或赋予机体新的抗病功能。而基因要转移 到体内，大部分是通过以细胞为靶细胞和中介的，所以基因治疗也可称作细 胞治疗。 基因治疗得以实施必须具备以下条件:?.成熟的DNA克隆技术，克隆疾幻灯79 病相关基因片段，并进行DNA重组，构建带有靶基因表达的原件;?.合适的 基因转移手段，将靶基因转移至患者体内，并使其高效表达。1972年，Berg 成功地进行了DNA重组实验，创建了重组DNA技术，从此人们就能很方便地 将所需基因不断扩增并克隆到不同的表达质粒上和病毒载体中，目前生命科 学领域里的最大的研究项目,,人类基因组致力于疾病相关基因的克幻灯80 隆，相信会有越来越多的基因可以用作基因治疗的靶基因。另一方面，人们 进行了基因转移方法的探索，磷酸钙、电穿孔及脂质体转移等方法的建立， 使得外源DNA能够转移入哺乳动物细胞。目前这些技术仍然在广泛应用，特 别是反转录病毒介导的基因转移系统的建立，为人类基因治疗了基础，后来 在此基础上发展起来腺病毒、腺病毒相关病毒、单纯疱疹病毒等病毒系统， 从生物方法到物理、化学方法，从离体转移到体内直接转移，从随机转移到 靶向转移和靶向表达的各个方面都进行了深入的研究。但是目前所有的基因 转移系统尚不完善，离临床试验要求还有一定的距离，如果要取得理想的治 疗效果，首先要求提高转移效率。对遗传病而言，反转录病毒转移系统因其 安全性已得到公认，可列为首选。而对肿瘤疾病矾，基因转移系统应采用更 为灵活的方法，其中腺病毒系统具有潜在优越性。 遗传病基因治疗方面，迄今为止已胡20余种遗传病被列为基因治疗的主 要对象，如ADA缺乏症、PNP免疫缺乏症、囊性纤维瘤(CF)、血友病、血红 蛋白病等等，其中ADA基因缺乏所致的SCID病等十几种疾病研究已进入临床 试验阶段。 肿瘤治疗方面，大多选择恶性程度高，其它方面难以治愈的肿瘤作为研 究对象，包括恶性脑胶质瘤、黑色素瘤、肾母细胞瘤、肝癌、胃癌、肠癌、 白血病等，采用的治疗基因非常广泛，既有体内缺陷基因的补充，更多的为 体内原本不表达或低表达甚至根本不存在的新基因。 对于基因自身研究的深入将有利于基因治疗的研究。目的基因仅能高效 转移还不够，还需达到恰当水平的表达并受到生长、发育的调控，这需要研 究各种启动子和增强子及基因表达所需的其它各个调控元件的特性;合适的 27 动物模型对基因治疗研究非常重要，可以起到促进作用，因此，应该将制备 遗传病动物模型作为基因治疗的必需内容看待，例如FH基因治疗的临床试验 得益于遗传性高胆固醇血症，血友病B狗为血友病B基因治疗提供了有益的 动物模型。但由于天然的遗传病动物模型有限，因而需要采用基因打靶的方 法制备各种遗传病小鼠模型，肿瘤模型同样重要，但其制备相对容易。 幻灯81 (六)在基础研究中的应用 细胞工程学的所有方法在运用于生产实践之前，都要经过基础研究的阶 段，而在这一研究过程中细胞工程学的某些方法的应用又为基础理论的研究幻灯82 提供了更多、更宽的思路。下面仅以细胞融合为例说明该方法在基础理论研 究中的广泛应用。 (一) 基因定位 这是细胞融合技术应用最大的成果之一。由于不同细胞，特别是不同种 属的细胞融合时，常会出现一个亲本的染色体优先排除，而另一个亲本的染 色体却被选择性保留，由此，即可根据杂交细胞某一表型特征是否出现，与 某一染色体或其片段是否存在的相关性来确定与此表型特征相对应的基因在 特定染色体或其一定区段上的位置。 (二) 体细胞杂种的致瘤性分析 通过正常二倍体细胞与致瘤性或病毒转化细胞的融合，来进行致瘤性的 遗传分析，是较早应用细胞融合技术的一个重要方面。 Harris和Klein等(1969、1971、1974)的实验证明，一系列高恶变性 的小鼠肿瘤，与正常二倍体细胞及低恶变性的小鼠细胞融合后发现，多数杂 种细胞的恶变受到抑制，在小鼠体内致瘤率明显降低。说明在正常细胞中确幻灯83 实存在着某种肿瘤抑制机制。对于这种抑制因子的深入研究，必将为癌变分 子机理的阐明及癌症的基因，提供极其有价值的资料。 (三) 遗传缺陷的基因互补 幻灯84 人类遗传疾病均与基因突变、缺失或异常表达有关。细胞融合技术的建 立，则有可能使正常基因取代突变基因或补充缺失基因，或设法使异常基因幻灯85 关闭，或降低其表达水平等进行治疗。 (四) 分化功能表达调控的研究 通过细胞融合，可将不同分化状态或组织类型的细胞构建成为能够存活的种内或种间杂种，同时还可对其中纳入的两亲本细胞的基因组和细胞质， 28 如何通过相互作用而最终导致原先表达的分化性状消失或保留，或原先不表达的基因被激活，进行观察和分析。因而这一技术，也已成为真核细胞基因表达和细胞分化机制研究的有效途径之一。特别是在组织特异性分化功能表达的调控机制方面，业也取得不少有意义的结果。 29 一、干细胞 1. 概念; 2. 干细胞的分类; 3. 干细胞的特征; 4. 胚胎干细胞; 5. 成体干细胞; 6. 肿瘤干细胞。 二、细胞工程 1. 细胞工程的概念; 2. 药用蛋白生产; 小 结 3. 细胞培养; 4. 基因工程动物; 5. 组织工程; 6. 细胞治疗。 名词解释: 管家基因、奢侈基因、差别基因表达、去分化、转分化、细胞凋亡、细胞 工程、细胞培养、原代培养、传代培养、细胞系、细胞株 复习思考 问答题: 题、作业 1、细胞分化的基础是什么, 题 2、细胞分化的特点有哪些, 3、干细胞的特征及其生物学医学意义, 实施情况 及分析 30