医学论文-孕妇外周血中胎儿红细胞的临床应用及其分离富集技术研究

医学论文-孕妇外周血中胎儿红细胞的临床应用及其分离富集技术研究 孕妇外周血中胎儿红细胞的临床应用及其分离富集技术研究 近年来，产前非创伤性诊断技术是国内外学者关注的重要课题。从妊娠母血中分离胎儿细胞,特别是胎儿红细胞（ＮＲＢＣｓ）,已成为国内外产前遗传性疾病的研究热点。作为胎儿遗传 物质的ＮＲＢＣｓ,在无创性产前基因分析方面已显示出良好的应用前景。20 世纪90 年代以来,随着单克隆抗体技术、流式细胞计数技术以及聚合酶链反应、荧光原位杂交技术及生物 素特异结合等方法的发展,已使从孕妇外周血中分离、纯化胎儿细胞,并进行无创伤性产前诊 断成为可能。虽然其基础研究取得了一定进展,但临床应用方面尚处于起步阶段。笔者查阅了 国内外有关文献,对这方面的进展综述如下。 1 孕妇外周血中胎儿红细胞的临床应用 从母体外周血分离胎儿细胞进行产前诊断是近年来产前诊断的研究热点，这些细胞包括滋养层细胞、 淋巴细胞、颗粒细胞和有核红细胞。目前的研究认为，胎儿有核红细胞（fetal nucleated red blood cells, FNRBCs）是用于产前诊断最理想的细胞，其理由包括：不存在于成人外周血中； 数量较多，从妊娠初期至分娩均存在；包含了胎儿的全部遗传信息；分裂快，寿命短（90天），不影响下次妊娠的产前诊断；细胞膜表面表达胎儿细胞特异性抗原，为各种分离和富集技术 提供了靶点。但由于母血中的FNRBCs极少（母血中有核细胞与胎儿细胞的比例约为105～109:1），因此，采用何种技术或方法对母体外周血中的FNRBCs进行高效和快速的分离与富集 成为能否将无创产前诊断在临床上推广应用的关键所在［1］。 目前从母血中获取胎儿ＮＲＢ Ｃｓ,应用于产前遗传学诊断最普遍。1990 年Camashella 首次应用PCR 法从孕妇外周血中扩增出父源性血红蛋白Lepore 基因特异性DNA,正确诊断2 例胎儿血红蛋白病;利用母血中胎儿细胞进行基因诊断的另一个成功范例是新近发展起来的用染色体ＤＮＡ特异序列作为引 物或探针来测定胎儿性别,其次是对染色体异常和单基因疾病进行产前遗传学的胎儿Rh 血型的分子诊断, Geifman等［ 2］ 采用FACS 法从Rh 阴性孕妇外周血分选到的胎儿NRBC 进行Rh 位点的PCR 扩增,预测胎儿Rh 血型的特异性和敏感性分别为100 %和84 %。1991 年Price 首次应用18 号染色体特异性探针对母血中胎儿细胞进行检测,诊断出1 例182三体胎儿;Simpson［ ３］采用抗CD71 和GPA 的单抗标记和流式细胞仪分离胎儿NRBC ,以X、Y、18 、21 号染色体特异性探针作FISH ,8 例非整倍体胎儿只有1 例未被检出,无1例假阳性。1998年Ｗａｔａｎａｂｅ成功地用单个ＮＲＢＣ首次对有鸟氨酸氨甲酰基转移酶缺陷的胎 儿进行了产前诊断,显示出9号染色体的一个位点突变。 2 孕妇外周血中胎儿细胞的富集分 离技术 目前主要有荧光激活的细胞分选法( FACS) ,也称流式细胞仪分选法、磁激活细胞分 选法(magnetic activat cell sorting ,MACS) 、电流分离法(charge flow separation ,CFS) 、简便的密度离心法和免疫磁珠或抗体结合柱法、单细胞的显微操作及最近的生物素凝集法等。 （1）FACS法自1990 年由Bianchi 首次成功应用于胎儿NRBC的分选,现已成为有效的分离工具而被广泛应用于胎儿细胞的分离。其优点是富集的纯度较高,可将胎儿细胞富集1000 倍,但耗时较长,设备昂贵,技术复杂,须专业技术人员操作。 （2）MACS 法1992 年由Ganshirt & Ahkrt 建立,其原理为在外加磁场的作用下,将结合磁性微粒的单克隆抗体标记的细胞 分离出来。随后,Bush 又报道了双重MACS 法,即先用携带磁性微粒的CD45 和CD12 的单抗标记细胞,再由携带磁性微粒的CD71 单抗做阳性选择富集胎儿的NRBC ,可大大提高分离效果。MACS ,特别是微型MACS 系统的优点是用时短、费用相对低廉、可同时分离多个样本。其缺 点是富集纯度相对较低,因其只能在一个标准参数上进行筛选。 （3）单细胞的显微操作采用 不连续密度梯度离心法和显微操作法来获取胎儿有核红细胞进行基因分析，即利用显微操作 的方法, 首先在显微镜下识别NRBC, 然后对其进行一一获取。该方法得到的细胞能消除母体 血细胞的干扰,能进行较精确的产前基因诊断，由于需要对NRBC进行一一识别和获取，故较 为费时，对操作人员的要求也较高。 （4）以大豆凝集素（soybean agglutinin, SBA）为代表的植物血凝素（lectin）可特异性识别和结合血细胞膜表面糖链［5,6］。SBA与FNRBCs具 有独特亲和力与特异性，十分适合应用于分离和富集FNRBCs［5,6］。因此,可以利用SBA与糖链的特异性结合力来特异性分离和富集母体外周血FNRBCs。 以上方法都只能增加母血中 的胎儿细胞的数量,而不能得到纯的胎儿细胞。至于哪种方法为最佳,Bianchi等［4］在模型系统中比较各种分离方法后认为以FACS 法为最佳方法,而Achtel 等［７］认为用CFS 法得出的结果最佳。在最近的报道中，Shinya等利用这种差异成功地从母体外周血中高效快速地 分离和富集到了FNRBCs，其结果表明该方法不仅比FACS、MACS和CFS等简便快速，更重要的是，它所分离和富集到的FNRBCs的数量更多［８］。 3 存在的疑问及展望 3.1 分离胎儿细胞的最佳时间尚待确定 Lo 等［9］ 的证据表明母血中胎儿细胞的数量随孕周的增加而增 加,并且存在于整个孕期; Kuo等［11］认为孕早期胎儿细胞数量最多。有学者提出母血中的 NRBC 并非全部来源于胎儿。Troeger 等［11］ 应用单个细胞PCR 技术检测母血中的NRBC ,发现约51%来自胎儿;Wachtel［12］则认为胎儿NRBC 只占母血中全部NRBC 的30%。有人试图用胎儿血红蛋白染色法解决这一难题,但来自孕妇的NRBC 也会产生胎儿血红蛋白,这些都会影响诊断的准确性。3.2 显微操纵技术 利用显微操纵技术还可以通过单个NRBC 来评价胎儿的特性,从而解决了经富集后胎儿NRBC 的数量仍很少的问题。这种技术目前已被应用于 HLA 单模标本,并用于地中海贫血、镰状细胞性贫血、DNA 异常的诊断。最近,显微操纵技术又被应用于胎儿RhD 类型和胎儿性别的诊断。 3.3 胎儿细胞鉴别技术的进展 胎儿细胞的鉴别多采用PCR 和FISH。PCR 易受污染,假阳性率高; FISH 必须用眼睛筛选成百上千个分裂间 期核,是高强度的劳动,并带有主观性。目前已开始研究用自动化筛选和图像分析法筛选［13］,另外还有人利用胎儿细胞鉴别器将血片上与母体细胞混在一起的胎儿细胞迅速识别出来。 总之，从母血中分离胎儿细胞进行产前诊断具有广阔的前景,并且新技术、新方法仍仍层出不穷， 但是到目前为止,大部分工作仍处于实验阶段。因此,这种无创伤性产前诊断方法并不能很快 取代侵入性产前诊断的地位,除非分离胎儿细胞并确定其核型获得完全成功。尽管如此,从孕妇血中分离胎儿细胞的方法目前被证实在产前筛查中是行之有效的［１４］ ,尤其是筛查13 、18 、21 、X 和Y三体疾病,而这些疾病占胎儿染色体病的95%。另外还可用于筛查与妊娠相 关的疾病,如先兆子癎、早产等。 【参考文献】 1 Sitar G, Brambati B, Baldi M, et al. 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