促卵泡素与促黄体素对猪卵母细胞体外成熟的影响

促卵泡素与促黄体素对猪卵母细胞体外成熟的影响 促卵泡素与促黄体素对猪卵母细胞体外成 熟的影响 第27卷第3期 2006年5月 家畜生态 ActaEcologiaeAnimalisDomastici V01.27N0.3 May.2006 促卵泡素与促黄体素对猪卵母细胞体外成熟的影响 张晓华,罗光彬,李东全,朱增娟,袁水桥 (沈阳农业大学畜牧兽医学院,辽宁沈阳110161) [摘要]本试验探讨了促性腺激素(FSH,LH)对猪卵母细胞体外成熟的影响,最终找到了其 合理的使用剂量.在成熟液中添加LH浓度分别为1,5,10IU/mL时,与没有添加FsH与LH的 对照组(15.9%)相比,成熟率有显着提高,成熟率分别为49.1%,30.0%,36.3%.LH浓度为1 IU,mL的实验组成熟率最高,显着高于对照组(P<0.05);然后以成熟液中只添加11U/mLLH 为对照组,试验组分别添加1,5,10IU,mT.FSH.试验结果明:添加FSH浓度为5和101U/ml 时其成熟率分别为40.1%,27.6%,低于对照组(49.0%).添加FsH浓度为11U/mL时其成熟 率(49.1%)高于对照组(49.0%),但差异不显着(P>0.05).两组试验同时得出,随着LH与 FSH添加浓度的增加,成熟率呈下降趋势.通过本试验结果得出,在体外成熟培养猪卵母细胞 时,各添加1IU/mLLH与FSH时,得到最佳的成熟效果. [关键词]猪卵母细胞;体外成熟;FSH;LH [中图分类号】,5811.5[文献标识码】A[文章编号】1004.5228{2006)03.OO23.04 促卵泡素(FsH)与促黄体素(LH)是参与卵母细 胞成熟的最重要蛋白质激素.在猪卵母细胞体外成 熟培养中使用较多.大部分研究中已经证实了促性 腺激素(FSH,LH)在猪卵母细胞体外成熟培养中的 重要作用.但在许多报道中都选择PMSG与hCG或 eCG与hCG结合使用,并有报道证明eCG与hCG对 促进卵母细胞的体外成熟更为有效.因此,需要进 一 步探讨FSH与LH对猪卵母细胞体外成熟的影 响.确定其对猪卵母细胞体外成熟的作用,找到其 合理的使用剂量. 1材料与方法 1.1猪卵丘卵母细胞复合物的收集与成熟培养 摘取刚屠宰母猪的卵巢放入30—35?的生理 盐水中在3小时内运至实验室.用带有l2号针头 的10mL一次性注射器抽取卵巢表面直径2—6nlm 的卵泡内的卵丘卵母细胞复合物(COCs),选取卵母 细胞质均匀并具有3层以上致密卵丘细胞的COCs 进行培养. 卵母细胞培养采用微滴法,每个微滴50uL左 右,矿物油覆盖,在CO2培养箱内平衡2h以上.采 集的COCs用PBS(杜氏磷酸盐缓冲液)洗3次,然后 用成熟培养液洗3次,移入已平衡好的培养滴中,每 滴放COCsl020枚,在39?,5%CO2的空气和饱 和湿度下培养. 基础成熟培养液为改良的TCM一199(mTCM一 199)液,其成分为含Earle's盐的TCM199(G?CO)添 加4.12mM乳酸钙,0.91mM丙酮酸钠,3.05mM的 D一葡萄糖(Sigma),根据实验设计再添加不同浓度 的FSH和LH(宁波激素制品厂). 1.2卵母细胞成熟鉴定 培养结束后,将COCs移入0.1%透明质酸酶液 中处理2—3min,机械吹打将卵丘细胞去净,在4× 10倍实体显微镜下观察第一极体是否存在,以第一 极体排出作为卵母细胞成熟的标准.胞质破裂,核 结构消失或结构损伤的卵母细胞归于死亡或退化. 1.3试验设计 试验1:检验不同浓度的LH对猪卵母细胞体外 成熟的影响.试验分4组,对照组(contro1)不添加任 何激素,试验组2,3,4组LH添加浓度分别为1,5, [收稿日期]2005-09-05,修回日期:2005.10-26 [作者简介]张晓华(198o一),女,辽宁辽阳市人,在读硕士,专业方向:动物胚胎工程. [通讯作者]罗光彬(1959一),男,教授,博士.E—mn:luoguangbin@126.corn. 24家畜生态第27卷 10IU/mL.试验重复5次. 对照组1—1:mTCM一199 试验组1—2:mTCM一199+1IU/mLLH 试验组1—3:mTCM一199+5IU/mLLH 试验组1—4:mTCM一199+10IU/mLLH 试验2:检验不同浓度的FSH与LH协同对猪卵 母细胞体外成熟的影响.对照组只添加LH,浓度为 1IU/mL,各试验组LH浓度相同,均为1IU/mL,FSH 浓度分别为1,5,10IU/mL,试验重复5次. 对照组2—1:mTCM一1994-1IU/mLLH 图1未成熟的COCs Fig1InmuturedCOCs 试验组2—2:mTCM一1994-1IU/mLLH4-1 IU/mLH 试验组2—3:mTCM一1994-1IU/mLLH4-5 IUImLFSH 试验组2—4:mTCM一1994-1IU/mLLH4-10 IU/mLH 1.4统计 所得资料采用spssl1.5统计软件进行显着性检 验.对成熟率进行单因素方差分析,多重比较用邓 肯式法.P<0.05时确定为差异显着. 图2培养48h后的COCs Fig2COCswithexpanded cumulllsafter48hculturedinvitro 图3排出第一极体的卵母细胞 Fig3Oocytewiththefirst pohrcumulusbodyaftermaturation 表1LH浓度对猪卵母细胞体外成熟的影响 Table1F.~ect0fLHOIlnuc]earmatura~oninvitroofporcineoocytes 注:每列不同角标字母表示差异显着(p<0.o5);(5)每组试验重复5次,下表同. Note:valueswithdifferentsuperscriptletterswithinsameco]umnaresignificantlydifferent( P<0.o5).(5)Experimentswererepeated5 times.esa/nebelow. 2结果 2.1不同浓度LH对猪卵母细胞体外成熟的影响 试验1结果如表1所示,在猪卵母细胞体外成 熟液中,分别添加0,1,5及10IU/mLLH时,成熟率 分别为15.9%,49.1%,30.0%,36.3%.添加LH浓 度为1IU/mL,10IU,mL的两组与没有添加LH的对 照组相比较,前两者的猪卵母细胞核成熟率有明显 提高,与对照组相比差异显着.这说明,LH可明显 提高猪卵母细胞的核成熟率.尤其当LH浓度为1 IU/mL时,其核成熟率最高.之后随着LH浓度升 高,猪卵母细胞的核成熟率呈下降趋势.所以LH 的最佳添加量为1IU/mL,在试验2中LH仍使用这 个浓度. 2.2不同浓度的FSH与LH协同对猪卵母细胞体 外成熟的影响 试验2结果见表2,在已加入浓度为1IU/mLLH 的猪卵母细胞体外成熟液中,添加0,1,5及10IU/ mLFSH时,成熟率分别为49.0%,49.1%,40.1%, 27.6%.当添加LH浓度为1IU/mL,协同添加FSH 浓度也为1IU/mL时,测得的成熟率为49.1%,为本 试验组最高.但与成熟液中只添加浓度为1IU/mL 第3期张晓华等:促卵泡素与促黄体素对猪卵母细胞体外成熟的影响25 LH的对照组(其成熟率为49.0%)相比,差异并不 显着.说明FSH虽然可以促进猪卵母细胞的体外 成熟,但促进的效果不如LH明显.之后随着FSH 浓度的升高,猪卵母细胞的核成熟率也呈下降趋势. 由此可见,同时添加LH与FSH,并且二者浓度均为 1IU/mL时,可使猪卵母细胞达最佳体外成熟效果. 表2FSH浓度对猪卵母细胞体外成熟的影响 Table2EffectofFSI-IOilnuclearmalll~Ollinvitroofporcineooeytes 3讨论 大多数研究已经证明,促性腺激素(FSH,LH)在 猪卵母细胞体外成熟培养过程中起重要作用.秦鹏 春等认为b'StI和LH对猪卵母细胞的体内成熟和排 卵起重要作用,而eCG和hCG对促进卵母细胞的体 外成熟更为有效.Funashashi认为eCG和hCG配合 使用可促进猪卵母细胞的减数分裂和细胞质成熟. 本试验结果表明,添加FSH和LH对猪卵母细胞的 体外成熟有明显的促进作用,成熟率最高达到 49%,可见,在猪成熟液中,使用国产FSH与LH是 完全可行的. 在猪卵母细胞体外成熟液中,FSH浓度从0.25 — 20t~JmI.与LH浓度从0.5—100t,--dmI.都有添 加.Y.z.Bing等试验证明,FSH在一定范围内(1— 10t,-dmI.)对卵母细胞成熟的促进效果呈浓度依赖 性,随着FSH浓度增加,GVBD的发生率和成熟至M ?期的比例也不断增加.l~Iarehal等报道,成熟液中 添加FSH浓度为400ng/mI.时,对猪卵母细胞核成 熟的促进效果最佳.BraekettBG等和YounisAI等 试验得出在牛卵母细胞?M液中(加或不加血清) 添加高浓度LH(50或100mL)可提高胚胎体外发 育能力.卢晟盛等试验得出,当FSH和LH的添加 浓度处于0.25—2tlg/mI.时,FSH和LH无论以何种 浓度组合,均极显着促进猪卵母细胞的核成熟.本 试验中也得出FSH与LH在低浓度时,可明显促进 猪卵母细胞的体外成熟,但高浓度的LH与FSH对 猪卵母细胞体外成熟的促进效果呈下降趋势.当 LH与FSH的浓度均为1IU/mL时,促进效果最佳, 其作用机理尚未完全清楚.当LH与FSH的浓度小 于1IU/mL时,能否提高卵母细胞的成熟率还有待 于进一步研究. 本试验中亦得出LH的促进效果要强于FSH,只 添加1IU/mlLH与同时添加FSH和LH浓度均为1 IU/ml相比,两组差异不显着.l~Iattioli等也报道了 与FSH相比,LH对猪卵母细胞的体外成熟尤其质 成熟更有效.本试验最终得出,在猪卵母细胞的体 外成熟液中同时添加国产FSH与LH,浓度均为1 t~JmI.时可得到最佳的成熟效果.FSH与LH的结 合使用及单独使用对猪卵母细胞的体外成熟及随后 的胚胎发育的影响仍需进一步研究. 参考文献: [1]E.J.Selaoevor8,A.Kidson,J.H.MVorlaeijdeneta1.EffectoffoUide — stimulatinghormonoOnnueloarandey~plamiematurationof0oW ooeytesinvltl-o[J].1laea'iogenolol~".2OO3,59::2017—2O28. 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EffectofFollicle—-stimulatingHormoneandLuteinizingHormoneon InVitroMaturationofPorcineOocytes ZHANGXiao—hua,LUOGuang—bin2,LIDong—quan2,ZHUZeng— juan~,YUANShui—qiao (Co//egeof~Z,ndSe/en~n,IdVetMededne,Shmyaag柏妇'mflIn^w啦 y,/Zaon~Shmyaag110161) Abstract:,I1leobjectiveofthepresentstudywastoexaminetheeffectofFollicularstimulatin gHormone(FSH)and LuteinizingHormone(LH)oninvitromaturationofporcineoocyte8.andtofindtheoptinulld osesofthem.Inthefirst experiment,whenl,5,l0IIJ/IllLLHweresupplementedinthematurationmedium.theratesof maturationofthetreat. edgroupswere49.1%,30.0%and36.3%respectivelywhichwerehigherthanthatofthecontrol(15.9%).Andthe rateofmaturationoflIU/mLU{groupwaLsthehighestinallgroups,whichhadsignificantlydifferencewiththecontrol (P<0.05).Inthesecondexperiment,thegroupoflIIJ/mlLHwasthecontrolgroup,andl,5,l0IIJ/mLHwere supplementedrespectively.,I1leresultsshowedthatwhenl,5and10IIJ/mLHcombinedwithlIIJ/mLLHweresup. plemented,thematurationrateswere49.1%,40.1%and27.6%respectively,whichhadnosignificantdifferencewith thecontrolgroup(49.O%.P>0.05)..nleresultsalsoshowedthatthematurationratesweredecreasedwhenincreasing thesupplementationofLHorH.ItresultedthattheoptimalconcentrationofLHandHwa8lIIJ/mLinthisexperi- ment. Keywords:Porcineoocyte;Invitromaturation;H;LH