外源性DNA残留量检测

外源性DNA残留量检测 1.目的 描述外源性DNA残余量检定(地高辛法)的操作过程和注意事项。 2.材料及设备 2.1试剂试液 无水乙醇。Tris饱和酚。三氯甲烷。异戊醇。吐温20。 20%十二烷基硫酸钠(SDS)溶液，用盐酸调pH至7.2。 0.2mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液(pH8.0)。3mol/L醋酸钠溶液。 20×SSC溶液:0.3mol/L柠檬酸钠,3mol/L NaCl,调pH至7.0。 Buffer I (0. lmol/L Tris-HCl，0.15mol/L NaCI，用固体NaOH调pH7. 5)。 Buffer ? (100mmo1/L Tris-HCl 100mmo1/L NaCI, 50mmo1/LMgCl2，pH9. 5)。 TE缓冲液(pH8.0):量取1mol/L Tris溶液(pH8.0)10ml,0.5mol/L EDTA溶液(pH8.0) 2ml, 加灭菌水至1000ml。 ECORI内切酶(宝生物(大连)有限公司) BamHI内切酶(宝生物工程(大连)有限公司) 2.2材料和用具 细菌基因组DNA提取试剂盒(天根生物)批号H6611 琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根生物)批号I7908 )货号:11745832910和1109365791 外源DNA残留量检测试剂盒(Roche 尼龙膜(PALL 0.45微米) 点样器(Bio-RAD;Model No:Bio-Dot SF Cell;Serial No:160BR07680)、移液器、tip 、离心机、三维旋混仪、电磁炉 头、恒温水浴锅、超净工作台、冰盒 3.操作原理 用随机启动法，将地高辛甙元标记的脱氧尿苷三磷酸掺入未标记DNA，通过一个手臂将dUTP与载体半抗原地高辛甙元连接起来(dig-dUTP)。与目的DNA杂交后，杂交分子用酶联免疫法检测;应用抗体,酶联接物(抗地高辛甙元,碱性磷酸酶复合物)和随后用酶促颜色反应使5,溴,4,氯,3,吲哚磷酸(BCIP)和氮蓝四唑(NBT)显色。 图 探针效率确定 酶切 获得DNA片段 探针标记 纯化探针 基因组DNA提取 阳性DNA 变性DNA点膜 预杂交 杂交过夜 样品 终止保存 显色 抗体杂交 封闭 严谨洗涤 4.操作过程 4.1探针制备 4.1.1提取后的基因组DNA用等体积的饱和酚溶液(饱和酚:三氯甲烷:异戊醇=25:24:1)混合均匀，12000rpm离心(4?)5分钟。轻轻吸取上层液体到另一EP管，在上清液中加入1/10体积3mol/L乙酸钠，稍微震荡或轻弹混匀，然后加入2倍体积(加入乙酸钠后的体积)冰无水乙醇，混匀后置于-20?4小时或-70?2小时。12000rpm离心(4?)5分钟，弃液体，加入70%冰乙醇10000rpm离心(4?)5分钟，弃去液体，室温晾干。加入适量无菌水或TE缓冲液，-20?保存。 4.1.2纯化后的基因组DNA进行酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收小片段。取1μg 回收DNA用灭菌双蒸水加至16微升，然后放入沸水浴中将DNA变性，水浴10分钟后，立即放入冰水浴中，冰浴5分钟。 4.1.3冰浴后加入试剂盒中的1#试剂5微升，轻轻摇晃混匀，37?培养过夜。 4.1.4次日，将探针取出，向其EP管内添加0.2mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液(pH8.0)2微升，3mol/L醋酸钠溶液2微升，无水乙醇50微升。 4.1.5将EP管放于-70?环境中2小时以上。 4.1.6取出探针，15000rpm离心(4?)15分钟，倾倒上清，用50微升灭菌双蒸水溶解探针，放于4?环境中备用(不宜超过一周)。 4.2供试品，阳性，阴性及对照处理 4.2.1用纯化后的基因组DNA，稀释梯度为10ng/100μl、 1ng/100μl、100pg/100μl、10pg/100μl，1pg/100μl的阳性对照。阴性对照为稀释液。 4.2.2将供试品、阳性对照、阴性对照置100?水浴加热10分钟，迅速冰浴冷却5分钟，以8000转/分离心5秒甩水。 4.3点膜及杂交 4.3.1用抽滤加样器将100μl样品全部点样于的杂交膜上。 4.3.2取下杂交膜，点样面向上，置紫外灯下照射30分钟。 4.3.3取无菌培平皿，加10ml已预热(37?)杂交液，并将杂交膜全部浸泡于其中，置37?水浴孵育30分钟进行预杂交。 4.3.4预杂交完毕后，倒掉预杂交液加入10ml新鲜预杂交液(50?)及全部探针(探针置100?水浴加热10分钟，冰浴5分钟)，然后置37?水浴孵育过夜。 4.4洗脱及显色 4.4.1低严谨性洗脱:取无菌培养平皿，加10ml2X SSC(含0.1%SDS),将杂交膜全部浸泡其中，室温下置水平脱色摇床，洗,次，每次5分钟。 4.4.2高严谨性洗脱:取无菌培养平皿，加10ml0.5X(0.1%SDS)(68?预热),将杂交液全部浸泡其中，置68?摇动，洗,次，每次15分钟。 4.4.3平衡:取无菌平皿，加10mlBuffer1(含0.3%吐温20),将杂交膜全部浸泡其中，室温下置水平脱色摇床震荡。 4.4.4封闭:取一次性无菌培养平皿，加10mlBufferI稀释过的封闭液，将杂交膜全部浸泡其中，室温下置水平脱色摇床震荡30分钟。 4.4.5抗体孵育:取一次性无菌培养平皿，加10mlBufferI稀释过的封闭液，同时加入试剂盒中的4#试剂2微升，将杂交膜全部浸泡其中，室温下置水平脱色摇床，30分钟。 4.4.6洗脱:取一次性无菌培养平皿，加10mlBufferI(0.3,吐温20),将杂交膜全部浸泡其中，室温下置水平脱色摇床，15分钟，,次。 4.4.7平衡:取一次性无菌培养平皿，加10mlBufferIII，将杂交膜全部浸泡其中，室温下置水平脱色摇床，,分钟。 4.4.8显色:取一次性无菌培养平皿，加10ml BufferIII(含200μl 5#)，将杂交膜全部浸泡其中，室温下避光静置0.5小时以上至显色完毕。 4.4.9终止反应:将杂交膜置无菌水中,分钟。 4.4.10湿膜扫描、风干并封膜。 5.结果判定 5.1阳性对照应显色，其颜色深度与DNA含量相对应，呈一定颜色梯度。 5.2阴性、空白对照应不显色，或显色深度小于阳性DNA对照最低的稀释度。 5.3将供试品与阳性对照进行比较，根据显色的深浅判定供试品中外源性DNA的含量。