葡萄柚中细胞色素P450酶抑制剂

葡萄柚中细胞色素P450酶抑制剂 P450 ，，，113112322谢凤妮，王 辉*，丘秀珍，曹尚文，王三永，李春荣，徐 勇 （1. 华南师范大学 化学与环境学院，广东 广州 510006； 2. 广东省食品工业研究所，广东 广州 510308； 3. 中山大学 化学与化学学院，广东 广州 510275） 葡萄柚果汁中富含呋喃香豆素类化学成分，这些呋喃香豆素类化合物特别像 6,7-DHB及其类似物能抑制药物代谢酶细胞色素P450，以致于提高特定药物口服生物 利用率或阻碍致癌物质的活性。本文综述了近年来发现的呋喃香豆素化合物的类别、 活性、及合成方面的情况。 葡萄柚汁；细胞色素P450(CYP3A4)；6‘,7’-香柠檬素 Reseach progress of furanocoumarins as CYP3A4 inhibitors in grapefruit XIE Feng-ni,WANG Hui,QIU Xiu-zhen,CAO Sang-wen,WANG San-yong,LI Chun-rong,XU Yong （1.School of Chemistry & Environment, South China Normal University，Guangzhou,510006） （2.Guangdong Food Industry Institution, Guangzhou, 510308） （3.School of Chemistry and Chemical Engineering , Sun Yat-sen University , Guangzhou 510275） Abstract : The grapefruit jiuce contains many furanocoumarins, especially 6’,7’-DHB and its analogues , which can inhibit the cytochrome P450 drug metabolizing enzyme (CYP3A4) and result in increasing the oral bioavailability of certain drugs or preventing the activation of carcinogens. In this arcticle ,the recent development of categories , activities , separation and synthesis of furanocoumarin are reviewed. Key words : Grapefruit juice ; CYP3A4 ; 6’,7’-DHB 葡萄柚(Citrus paradisii)，亦名胡柚或西柚，芸香科，被认为是柚与甜橘杂交的品 [1]种。葡萄柚汁富含果胶，有降低胆固醇的作用，其黄酮类成分也被广泛认为具有抗 [2][3~5]癌作用 。1989年美国化学家Bailey等首次报道了葡萄柚汁影响处方药物菲洛地 平的口服生物利用率，这一发现引起了药物学家和化学家对葡萄柚汁化学活性成分的 广泛关注。随后，药物学家又发现多种药物与葡萄柚汁产生这种相互作用，进一步研 广东省食品工业公共实验室开放课资助项目FIPL-05-004 通讯人:王辉，广大学城华南师范大学化学与环境学院；邮政编码：510006 E-mail: huiwang@scnu.edu.cn 1 究表明葡萄柚汁并不是直接与这些药物发生作用，而是通过对一种氧化代谢酶的调控 来起作用的，这种酶就是细胞色素P450（简称CYP3A4）。尽管这些药物在化学成分 和药理特性上有差异，但是它们在人体内的代谢途径都是通过肠道内的CYP3A4调控进行的，CYP3A4酶可部分地摧毁药物，加速药物成分在肠道内的分解，以致降低药 物的生物利用率。早期的研究认为可能是柚汁中的富含成分黄酮类、柚苷在起这种作 用，但进一步研究发现柚汁中一类含量比柚苷要少得多的呋喃香豆素衍生物才是与 CYP3A4发生作用的主要活性成分，这些呋喃香豆素衍生物在不改变专一mRNA水 [6]平的前提下，通过选择性抑制CYP3A4酶的活性，减少了药物成分在肠道内的分解， 导致药物以通常数倍乃至十几倍的量进入血液，从而提高人体对药物的吸收水平，延 [7, 8]长药物的使用周期，提高药物疗效。葡萄柚汁是通过所含的呋喃香豆素衍生物成 分对CYP3A4活性进行选择性抑制而提高药物的口服生物利用率。因此研究对 CYP3A4活性具有抑制作用的呋喃香豆素衍生物在化学、生物、医药领域具有重要的 意义，本文综述了近年来天然呋喃香豆素类化合物及其类似物的研究情况。 1 目前在柚类中已发现的呋喃香豆素主要是在呋喃香豆素的5位和8位连有烃氧基的衍生物，基本上可归为如下3种通式结构，如图1所示。其中?和?是呋喃香豆素 5或8位的单取代衍生物，?是呋喃香豆素5、8位的二取代衍生物。呋喃香豆素芳 环中的R一般为甲氧基（A系列）、3-甲基-2-烯丁氧基（B系列）以及3，7-二甲基-2，6-二烯辛氧基（又称香叶基）（C系列），其中B、C系列的3种取代物均为双键在氧 化再开环过程中的衍生产物。 [9]2004年瑞士的Eric等利用HPLC联合紫外、荧光和质谱研究了香柠檬、柠檬、 苦橙、葡萄柚、橘子和红橘等六种不同柚种的皮油中呋喃香豆素化合物的存在情况， 结果表明两种橘子中没有任何呋喃香豆素成分，而其余四种均含有香柠檬素 bergamottin（?C1）、bergapten（?A1）和oxypeucedanin hydrate（?B3），香柠檬、柠檬中的bergamottin含量较高，而葡萄柚中的epoxybergamottin（?C2）含量较高。含呋喃香豆素成分种类最多的是柠檬，可检测出的有byakangelicin（?B3）、oxypeucedanin（?B2）、bergapten（?A1）、heraclenin（?B2）、byakangelicol（?B2）、oxypeucedanin hydrate（?B3）、imperatorin（?B1）、phellopterin（?B1）、isoimperatorin（?B1）、8-geranyloxypsoralen（?C1）和bergamottin（?C1）等11种。香柠檬中 2 的总呋喃香豆素含量最高，且以香柠檬素?C1为主；葡萄柚中的总呋喃香豆素含量 居次，以?C2为主。其实从目前的研究情况来看，呋喃香豆素不仅仅存在于柚类果 [10]实中，Umbelliferae, Moraceae和Leguminosae属植物中也含有呋喃香豆素衍生物， [11]甚至是更强的CYP3A4抑制剂。 [12]除了单体以外，还存在一些呋喃香豆素二聚体，Guo L. Q.等将柚子汁离心，在 沉淀中发现了三种?C3的二聚物，这三种二聚物分别简称为GF-I-1、GF-I-4和GF-I-6，其结构式见Fig.2，这些二聚物主要是两个?C3分子侧链中的羟基通过醚键的方式结 合，或者是一个?C3分子侧链的2个邻位羟基与另一个?C3分子的内酯羰基的缩合 物。如果将柚子汁离心，发现6’,7’-dihydroxybergamottin (?C3 )在上层清液中含量较 高，而?C1、?C2主要分布在柚子汁沉淀中。 [13]柚汁中的呋喃香豆素的含量一般在ppm级，Manthey采用HPLC-MS研究了新鲜柚子汁提取物中呋喃香豆素的含量，研究发现柚子汁提取液经离心后，离心滞留物 中香豆素衍生物的含量最高，即含有892 ppm的?C1，628 ppm的?C3，116 ppm的?C2，105 ppm 的7-geranyloxycoumarin以及大约467ppm的呋喃香豆素二聚物。上 层清液中则以?C3和?C1为主，分别为139ppm和89ppm。 OCHR3 OOOOOOOOORR ? ??其中 OHOOHOCH3OOO A1B1B3B2 OHOOOOC1OHC3C2 OCH3 O OHC4 Fig.1. Categories of furanocoumarins in grapefruit juice 3 OH OOOH OOOOHOOOOOOOOOOOOOOOOHOH OOOOOOO H GF-?-1 GF-?-4 GF-?-6 Fig.2. Structures of furanocoumarins in grapefruit juice 呋喃香豆素侧链主要以5或10个碳原子为主，这可能与这些植物中次生代谢产物 的生物合成途径有关。柚肉中还存在一些非5、8位取代的呋喃香豆素衍生物，如7-geranyloxycoumarin，其侧链也是香叶基。 2 柚子汁中的6’,7’-DHB及其类似物都属于呋喃香豆素类化合物，那么呋喃香豆素 [14]化合物的结构与酶的活性之间有些怎样的关系，Row E.C.等以人肝微粒体和小肠中的标记底物6β-羟基睾甾酮作为CYP3A4的活性指标，比较了多种合成呋喃香豆素衍生 物的抑制活性，提出了呋喃香豆素衍生物与CYP3A4作用的四个可能活性部位，如Fig.3.中所示。 8OOO cd5 O8'3'5'7'1'4'2'6' a bFig.3. Proposed sites of interaction between bergamottin and CYP3A4 第一部位是烃基部分，在烷基化系列衍生物中，抑制能力的次序是 ?A1>?B1>?C1，表明烷基链长的增加与降低CYP3A4的抑制活性有关，即随着链长的增加，呋喃香豆素更易与亲水性的键合点发生作用。 第二部位被认为是 6’,7’-双键位置：在香叶烷基链6’,7’-位通过引入官能团成醇、环氧和醚后，其抑制活性明显增大，这是呋喃香豆素衍生物与酶活性位点之间通过氢 键相互作用的结果。所以侧链烃基上连接的极性基团越多，与酶的作用越强，抑制作 用也就越大。引入极性大的取代基可将呋喃香豆素的抑制能力提高一个数量级，如 ?C1、?C2、?C3和?C4，对人肝微粒体CYP3A4的IC值分别是4.48、0.33、0.6550 4 和0.13μM，羟醚衍生物是这系列中抑制作用最强者，甚至是比异戊烯基系列更强的 CYP3A4抑制剂。Row E. C.等还比较了异戊烯基衍生物?B1、?B2和?B3的抑制活性，发现极性大的取代基引入到异戊烯基双键中导致抑制活性下降，其大小次序是 ?B1>?B3>?B2，表明异戊烯基侧链更倾向与CYP3A4活性位点的疏水区域发生键 合作用。 第三部位是2,3-呋喃环部分，研究发现呋喃香豆素中呋喃环的双键如果被还原， 其抑制酶活性只有香柠檬素的1/10，表明呋喃环部分是一个重要的作用位点。 第四部位是内酯部分，7-羟基香豆素及苄基、异戊烯基醚化的香豆素衍生物对 CYP3A4只有微弱的抑制作用，表明三环体系内酯部分对这些化合物键合到活性位点 上很少或没有起到作用。 研究还发现，当以6β-羟基睾甾酮为作用标记底物时，除了香豆素和酚呋喃香豆 素外，其它呋喃香豆素化合物都对CYP3A4的活性有不同程度的抑制作用。香豆素和 酚呋喃香豆素没有抑制活性也表明，中心芳香环上的呋喃环和5位上的烷基对CYP3A4的活性抑制起了关键作用。呋喃香豆素化合物单体还可以通过连接在6’,7’位具有亲水基团的香叶氧基来增强其潜在的抑制作用，这些事实表明呋喃香豆素衍生 物既能与酶的疏水部位，又能与酶的亲水部位发生作用。 [12]Guo.等研究了多种葡萄柚及相关柑桔汁液中六种不同呋喃香豆素含量与抑制 微粒体CYP3A活性程度的关系，结果显示，甜桔子汁没有明显的抑制作用；葡萄柚 汁离心后，抑制成分GF-I-1、GF-I-4、GF-I-6、bergamottin和epoxybergamottin主要分布在离心滞留物中，但6’,7’-DHB则主要分布在上层清液中，这种现象与Bailey et al.,1998，Edwards et al.,1999文献报道是一致的；任何一种相当于原汁液最高含量水 平的单一呋喃香豆素成分配制汁液的抑制活性均达不到最高含量水平原汁液抑制能 力的40%；将5种呋喃香豆素成分按最高含量水平混合成的葡萄柚汁也能大致重现活 性最强的葡萄柚汁原液的抑制能力，但是任何一种成分的缺失将降低抑制能力，葡萄 柚汁所有的呋喃香豆素成分对CYP3A最大程度抑制都是必需的，但每一种成分的贡 献都会因抑制能力和天然丰度而不同。呋喃香豆素二聚体的含量在葡萄柚原汁中虽然 比单体如DHB低得多，但其抑制能力要比单体高得多。另外，所有六种被研究的呋 喃香豆素实验液及葡萄柚汁原液在NADPH存在下预置15分钟后，其比未经预置的 有更强的抑制能力，这表明葡萄柚汁与药物相互作用是通过竞争性抑制和基于机理抑 5 制两种方式进行的。所有5种呋喃香豆素按照原汁液中最低浓度水平的混合液，其抑 制CYP3A活性比呋喃香豆素含量最低水平的原汁液弱，这反映了抑制CYP3A活性的物质不仅仅限于所研究的5种呋喃香豆素，如葡萄柚汁中的柚苷配体黄酮类物质也 可调节CYP3A的抑制能力，柚苷配体的抑制能力弱但含量大，所以也能体现在实验 结果中。 36’,7’-DHB [15]6’,7’-DHB及其类似物与药物发生相互作用的机理主要可概括为两方面：（1）对肠道转运蛋白的作用。6’,7’-DHB及其类似物能够抑制位于人类小肠黏膜上皮细胞 上的有机阴离子转运多肽如QATP-A、OATP-B，从而抑制其介导的以其为作用底物 的药物运转，故可以提高该药物的生物利用；同时，6’,7’-DHB及其类似物还能够抑 制小肠黏膜上皮细胞上的外转运载体蛋白P-糖蛋白，反而提高了P-糖蛋白介导的以P-糖蛋白为底物的药物运转，从而提高生物利用率。（2）对膜上皮细胞上的代谢酶的 影响。细胞色素CYP450系统中的CYP3A4参与50%以上药物的代谢，而CYP3A4又是含量最丰富且最重要繁衍代谢酶，因而6’,7’-DHB及其类似物主要被CYP3A4代谢，同时也能抑制CYP3A4 的活性，从而抑制药物氧化代谢，提高生物利用率。此 外，肠道CYP3A4和P-糖蛋白可协同限制口服药物的经肠吸收， 6’,7’-DHB及其类似物可降低其协同屏蔽作用。 4、 [16]呋喃香豆素衍生物的合成主要是以1(bergapten)为起始原料，首先在CHCl22中用BBr脱去甲基保护基生成酚衍生物2(bergaptol)，产率可达83%；然后在丙酮3 的碱性条件下分别与香叶溴或2-甲基-4-溴-2-丁烯反应，生成3(isoimperatorin)和4(bergamottin)，产率分别为70%和74%，接着在CHCl中与间氯过氧化苯甲酸22 （MCPBA）作用，则生成侧链末端双键的环氧化产物5和6；在二氧六环中用3%的HClO氧化开环，分别可得到二羟基化产物7(Oxypeucedaninhydrate) 和8 4 (6’,7’-DHB)。 6 OOOOOOBBr3 CHCl22213OHOCH BrBrCOCH33 KCO23CH OOOOOO COOOH 34OOClCOOOHCHCl22Cl22 r t?O-10 COOClCH OOOOOO O6O53% 稀 HClO4O4O3% 稀 HClO OOOOOOO OHOHOO OHOH Fig.4. Synthetic route of furancoumarin derivate 87 一般情况下，环氧化合物受到亲核试剂的进攻而开环，可以利用环氧化合物作为 中间媒介点，理论上可以引入许多不同的官能团，如香柠檬素的末端双键环氧化物6 在樟脑磺酸（CHOSOH）催化下，甲醇开环，可得9(6-羟基-7-甲氧基香柠檬素)。 10153 OOOOOO HOSOHC10153 OHOOH3CHOO82%3OCH69 Fig.5. Synthetic route of 6’-Hydroxy-7’-methoxybergamottin 5 大量的研究已经证明6’,7’-DHB是细胞色素酶CYP3A4的主要抑制者，它通过抑制CYP3A4和P－糖蛋白，使许多通过CYP3A4代谢的或P－糖蛋白转运的药物受到影响。 因此,许多CYP3A4代谢的药物都会因为它的活性被抑制而使生物利用率增加。实际上 有些药物的生物利用率并非越高越好，过高反而增加其毒副作用；而有些价格昂贵的 特效药物，又往往需要提高其生物利用率，以降低服药的成本。因此，开展呋喃香豆 素衍生物的研究，对于寻找适合抑制强度的相关衍生物，在药理以及药物的研究上具 7 有理论价值和应用价值。 [1] Scora RW. On the history and origin of citrus[J].Bull torrey bot club, 1975,102:369-375. [2]Erlund I, Meririnne E, Alfthan G, et al. Plasma kinetics and urinary excretion of flavanones naringenin and hesperetin in humans after ingestion of orange juice and grapefruit juice [J]. J. Nutrition, 2001, 131: 235-241. [3]Baily DG，Spence JD，Edgar B, et al. Ethanol enhances the hemodynamic effects of felodipine [J]. Clin. Investig Med. 1989,12 (6):357-362. [4] Bailey DG. Spence JD, Munoz, C. and Arnold J.M., Interaction of citrus juices with felodipine and nifedipine[J]. Lancet. 1991,337,268-269. [5] Bailey DG, Dresser GK, Kreeft JH,et al. Grapefruit juice-felodipine interaction: effect of unprocessed fruit and probable active ingredieats [J]. Clin phamacol Ther., 2000,68(5):468-47. [6] Lown KS, Bailey DG, Fontana RJ, Janardan SK, Adair CH, Fortlage LA, Brown MB, Guo W and Watkins PB. Grapefruit juice increases felodipine oral availability in humans by decreasing intestinal CYP3A protein expression[J]. J. Clin. Invest., 1997,99:2545-2553. [7] Ho PC, Saville DJ, Wanwimolruk S. Inhibition of humanCYP3A4 activity by grapefruit flavonoids, furanocoumarins andrelated compounds[J]. Pharm. Pharm. Sc,. 2001,4,217-227. [8] Schmiedlin-Ren P, Edwards DJ,Fitzsimmons ME.,et al. Mechanisms ofenhanced oral availability of CYP3A4 substrates by grapefruitconstituents: Decreased enterocyte CYP3A4 concentration and mechanism-based inactivation by furanocoumarins[J]. Drug Metab.Disp, 1997,25,1228-1233. [9] Frerot E., Decorzant E. Quantification of total furocoumarins in citrus oils by HPLC couple with UV, fluorescence, and mass detection[J]. J. Agric. Food Chem., 2004, 52,6879-6886. [10]Pathak MA, Daniels F and Fitzpatrick TB. The presently known distribution of furocoumarins (psoralens) in plants[J]. J. Invest. Dermatol, 1962,39:225-239. [11]Guo LQ, Taniguchi M, Xiao YQ, Baba K, Ohta T and Yamazoe Y. Inhibitory effect of natural furanocoumarins on human microsomal cytochrome P450 3A activity[J]. Jpn. J. Pharmacol., 2000, 82:122-129. [12]Guo, LQ, Fukuda K, Ohta T, et al. Role of furanocoumarin derivatives on grapefruit juice-mediated inhibition of human CYP3A4 activity [J]. J. Drug Metab Dispos, 2000,28(7):766-771. 8 [13] Manthey JA, Buslig BS, Distribution of furanocoumarins in grapefruit juice fractions[J]. J. Agric. Food Chem., 2005, 53,5158-5163. [14] Row EC, Brown SA, stachulski AV and Lennard MS, Design,synthesis and evaluation of furanocoumarin monomers as inhibitors of CYP3A4[J]. Org..Biomol.Chem, 2006,4.1604-1610. [15]Soldner A, Christians U. Grapefruit juice activates P-glycoprotein-mediatded drug transport[J]. Pham-Res., 1999,16 (4):478-485. [16]Bellevue FH, Woster PM, Edwards DJ, He K and Hollenberg PF. Synthesis and biological evaluation of 6’,7’-dihydroxybergamottin, a naturally occurring inhibitor of cytochrome P450 3A4[J]. Bioor. Med Chem Lett, 1997,7:2593-2598. 9