EGFR-T790M突变所致吉非替尼耐药肺腺癌细胞化疗药物敏感性变化的研究(可编辑)

EGFR-T790M突变所致吉非替尼耐药肺腺癌细胞化疗药物敏感性变化的研究(可编辑) EGFR-T790M突变所致吉非替尼耐药肺腺癌细胞化疗药 物敏感性变化的研究 中图分类号 学校代码 密级塑 硕士学位论文 ?突变所致吉非替尼耐药 肺腺癌细胞化疗药物敏感性变化的研究 ? ? . 作者姓名: 李学真 学科专业: 临床医学 研究方向: 肿瘤学 学院系、所: 湘雅二医院 指导教师: 邹文副教授 论文答辩日期为畎.诱 答辩委员会主席 中 南大学 二一三年五月原创性声明 本人声明,所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果。尽我所知,除了论文中特别加以标注和致谢 的地方外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不 包含为获得中南大学或其他单位的学位或证而使用过的。与我 共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。 作者签名: 日期:?堕年』月堕日 奎黑箕 学位论文版权使用授权书 本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定,即:学校 有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文, 允许学位论文被查阅和借阅;学校可以公布学位论文的全部或部分内 容,可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科 学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》, 并通过网络向社会公众提供信息服务。 作者签名:奎望复导师签名垒日期:丛年上月立日突变所致吉非替尼耐药肺腺癌细胞化疗药物 敏感性变化的研究 摘要 研究背景 近年来靶向治疗成为治疗的重要手段,但是用药一段时 间后都不可避免的产生继发性耐药。目前对靶向治疗继发性 耐药后的治疗尚无统一定论,改行化疗仍是其有效的治疗方法之一。 如何选择对靶向治疗耐药敏感的化疗药物具有重要的临床意 义,值得深入研究。 本实验检测肺腺癌细胞株.及一/,对顺铂、吉西他滨、 长春瑞滨、紫杉醇、多西紫杉醇、培美曲塞的敏感性,以及两个细胞 株、冰、、基因及蛋白的表达情况。为 临床突变导致?继发性耐药患者后续化疗药 物的选择提供临床前依据。 材料和方法 、将细胞培养于含有%胎牛血清的完全培养基, /细胞培养于含浓度为/的吉非替尼及%胎牛血清 的完全培养基,并置于?、%、湿度为%的培养箱中 培养。 、应用法检测及/细胞对顺铂、吉西他滨、 长春瑞滨、紫杉醇、多西紫杉醇、培美曲塞的。 、分别利用液相芯片法和?法,检测及/ 细胞、删、、基因】州及蛋白的表达水平。 、采用.统计软件包对数据进行,以.为有 统计学意义。 结果 、方法检测结果,与细胞比较,/细胞对顺铂、 吉西他滨、培美曲塞的值明显增高.,对长春瑞滨、 紫杉醇、多西紫杉醇值明显降低.。 、液相芯片方法检测/细胞较细胞、、 】的表达量明显升高.,瑚矾的表达 量明显降低.。、.?方法检测/细胞较细胞、 、、删蛋白的表达量明显升高.,蛋 白的表达量明显降低.。 结论 、肺腺癌细胞株发生突变后对化疗药物敏感性发 生变化,对顺铂、吉西他滨、培美曲塞的敏感性降低,对长春瑞滨、 紫杉醇、多西紫杉醇的敏感性增高。 、肺腺癌细胞株发生突变后犯、砌重、 向?及蛋白表达量明显升高,训埘及蛋白表达量明显降 低,可能是其化疗药物敏感性发生变化的原因之一。 本论文共计图幅,表个,参考文献篇。 关键词:肺腺癌;突变;耐药;;;;; 化疗 分类号:. 锣?? . ,龇 印 船巧 印,., 任. .、 仃 .珂 仃唱 如 ? , ./ ,,,,,,, 切【,, 刚? ,? 印 .:、%;/ 仃 / % .% %. 、, ,,【,, / . 、宅. ,,,瑚 / . 、 ., 士 . 恐 . 铲, 目录 原创性声明摘要??...?.:.??. 中英文词汇简表前言材料和方法? .实验材料? ..实验细胞. ..主要试剂及配制方法?. ..实验器材. .实验方法? ..细胞培养. .. 法?。 ..液相芯片法??. .. .?.. ..统计学分析实验结果?. . 实验结果?。 .液相芯片检测结果??一 . 实验结果?.. 讨论?. 结论. 参考文献??. 综述??.. 攻读学位期间主要的研究成果??. 致谢?. 中英文词汇简表 英文缩写 英文全称 中文全称 血?聆 丝氨酸苏氨酸激酶 水通道蛋白. 印一 完全缓解 无病生存期 二甲基亚砜 臼 细胞外基质 肌舯 表皮生长因子受体 印 切除修复交叉互补基因 ;柏 肛 胎牛血清 基质金属蛋白酶 印 核普酸切除修复肿瘤客观缓解率总生存期 能 磷酸盐缓冲液 疾病进展 ,无疾病进展时间 磷脂酰肌醇.激酶部分缓解 同源丢失性磷酸酶一张一?一一“‘一”、 。,一. 力蛋白基因 曲 核昔酸还原酶亚单位 病灶稳定. 信号传导和转录激活子.够 酪氨酸激酶抑制剂胸苷酸合酶 硕士学位论文 日?吾 前言 肺癌是世界上发病率最高的恶性肿瘤之一,在我国,肺癌的发病 率及死亡率 亦占各种恶性肿瘤的首位。非小细胞肺癌作为肺癌的主要类型, 占肺癌病例的 %以上,并且多数病人确诊时已处于晚期,丧失了手术治疗的机会,需要进行 化疗或分子靶向治疗。对于大多数晚期患者,以铂类为基础的一线化疗 有效率仅为%.%,疗效已达到平台期。近年来,随着肺癌基因分型及分子 靶向药物的发展,以吉非替尼、厄洛替尼为代表的靶向治疗己成为晚期非小细胞 肺癌内科治疗的主要手段,并取得惊人效果【】。但是,即使?初始治疗 非常有效的患者,治疗一段时间后,最终还是会出现继发性耐药而导致疾病的进 展。对于发生?治疗耐药的患者该如何优化治疗,是当前肺癌临 床治疗亟待解决的难题。针对非小细胞肺癌.继发性耐药的分子机制, 学者提出应用不可逆的?,多靶点的?,抑制剂与 联合应用等治疗策略,已取得了初步成果和可贵经验,但仍存在一定 的局限性。目前为止,晚期非小细胞肺癌应用治疗出现继发性耐药后 的治疗尚无统一定论,挽救性化疗仍是可选择的治疗方法之一。然而,晚期非小 细胞肺癌应用?继发性耐药后,其对化疗药物的敏感性是否有变化,如 何选择对?耐药的肺腺癌高效且相对低毒的化疗药物具有重要的临床意 义,值得深入研究。 目前对非小细胞肺癌应用产生继发性耐药的机制越来越明确,由 不同机制导致继发性耐药的对后续治疗的反应性可能存在差异,对这部 分患者实施有效的个体化治疗是十分必要的。本试验应用大剂量吉非替尼冲击结 合逐步递增浓度体外诱导获得的.突变肺腺癌细胞株./及其亲 代细胞株。,检测两个细胞株对顺铂、吉西他滨、长春瑞滨、紫杉醇、多西紫 杉醇、培美曲塞的敏感性,并检测其相关敏感性基因、洲、、 及蛋白的表达情况,以了解肺腺癌应用?发生突 变导致继发性耐药后对上述药物化疗敏感性的变化情况。为临床? 突变致继发性耐药患者改行化疗时,选择高效的化疗药物提供临床前 依据。材料和方法 硕士学位论文 材料和方法 .实验材料 ..实验细胞 细胞株:肺腺癌细胞株和/由广州呼吸研究所赠予 ..主要试剂及配制方法 ...细胞培养试剂 中南大学湘雅二医院医药技术开发公司分装 培养液 中南大学湘雅二医院医药技术开发公司分装 磷酸盐缓冲液 .%胰蛋白酶 中南大学湘雅二医院医药技术开发公司分装 胎牛血清 杭州四季青生物工程材料有限公司 ... 试剂 英国仃 吉非替尼 顺铂 山东齐鲁制药有限公司 吉西他滨 山东齐鲁制药有限公司 长春瑞滨 山东齐鲁制药有限公司 山东齐鲁制药有限公司 紫杉醇 山东齐鲁制药有限公司 多西紫杉醇 培美曲塞 山东齐鲁制药有限公司 四甲基偶氮唑蓝 美国 二甲基亚砜 美国 ...液相芯片试剂 益善生物技术股份有限公司 裂解液 益善生物技术股份有限公司 缓冲液 益善生物技术股份有限公司 洗涤液 益善生物技术股份有限公司 链酶亲和素一藻红蛋白 益善生物技术股份有限公司 液相芯片试剂盒 ... 试剂 上海国药生物 常规化学试剂 三羟甲基氨甲基烷 美国 美国 过硫酸胺 硕士学位论文 材料和方法 十二烷基硫酸钠 美国舯 四甲基乙二胺 美国 . 美国 丙烯酰胺 美国舯 甘氨酸 美国肿 甲叉双丙烯酰胺 美国 丽春红 美国肿 兔抗人、尉?、 、抗体 鼠抗人.抗体 蛋白酶抑制剂 蛋白磷酸酶抑制剂 砌裂解液超敏发光液 肌 显影液定影液 ...试剂配制 .×磷酸盐缓冲液 . . . 适量双蒸水溶解,用调整值为.,加水定容至,高压蒸汽灭菌 ,室温保存。 .几吉非替尼 吉非替尼 二甲基亚砜 溶解后,用的过滤器过滤,置于?避光保存。 .%培养液 标准胎牛血清 链霉素一青霉素混合液 培养液 混匀后置于?保存。硕士学位论文 塑坐互鲨. ./吉非替尼的培养液 标准胎牛血清 链霉素一青霉素混合液 】几吉非替尼 培养液 混匀后置于?保存。 。 ,./ 。 . 蒸馏水 溶解后,用浓盐酸调至所需点见下所示,最后用蒸馏水定容至, 高温灭菌后室温下保存。 调节: 约 ...// . 异丙醇 溶解后,分装于.离心管中,一?保存。 .%蒸馏水至 ?水浴下溶解,室温保存。如在长期保存中出现沉淀,水浴溶化后, 仍可使用。 .%过硫酸胺 过硫酸胺 . . 超纯水 溶解后,?保存,保存时间为周。 ../ ?. . . 超纯水 溶解后,用浓盐酸调至.,最后用超纯水定容至,室温下保存。 硕士学位论文 材料和方法 ../ ‘. . . “ 超纯水 溶解后,用浓盐酸调至.,最后用超纯水定容至,室温下保存。 .%/ 丙稀酰胺 甲叉双丙稀酰胺 超纯水 溶解后?保存。使用时恢复至室温且无沉淀。 .还原型上样缓冲液 . / . ?. 二硫疏糖醇,. . . 溴酚蓝 . 甘油 . 混匀后,分装于.蹦离心管中,?保存。 .电泳缓冲液 . . 甘氨酸. . 蒸馏水至 溶解后室温保存,次溶液可重复使用~次。 .转移缓冲液 甘氨酸. . . . . 甲醇 蒸馏水至 溶解后室温保存,次溶液可重复使用~次。 .丽春红染液 丽春红 硕士学位论文 材料和方法 三氯乙酸 磺基水杨酸 蒸馏水至 使用时将其稀释倍。 ..缓冲液、缓冲液 缓冲液 /. . 蒸馏水至 可以配制成缓冲液进行保存,稀释倍使用 % 缓冲液 .混匀后即可使用,最好现用现配。 .封闭液 脱脂奶粉..实验器材 公司 单人生物净化工作台 美国 锄 培养箱 美国 觚公司 旧 光学显微镜 日本 倒置荧光显微镜 德国公司 普通冰箱 美国珊公司 美国咖公司 .度冰箱 美国公司 一高速离心机 培养瓶 美国公司 美国 孔细胞培养板 美国 孔细胞培养板 上海精密 血细胞计数器 国产大龙 微量移液器 上海泸西分析仪器厂有限公司 涡轮振荡器 公司 恒温水浴装最 材料和方法 硕士学位论文 、“、可调微量加样器 德国公司 低温微量离心机 德国公司 电泳仪 美国公司 紫外分光光度仪 美国公司 扩增仪 公司 美国 实时荧光定量仪 公司 美国 核酸蛋白测定仪 德国公司 可调温水浴箱 中国上海南阳仪器有限公司 摇床 江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司 北京六一仪器厂 电泳槽 转膜仪 北京六一仪器厂 磁力搅拌器 山西荣华集团 电磁炉 美的集团 精密计 上海雷磁仪器厂 电子天平 上海民桥医疗器械有限公司 电动玻璃匀浆器 宁波新芝生物科技股份有限公司 台式冷冻离心机 深圳黑马仪器有限公司 酶联免疫检测仪 美国.黜 舢工作台 苏净集团安泰公司制造 纯水系统 美国公司 微量加样器 德国公司 恒温加热器 美国公司 液相基因芯片系统 美国啪公司 阅读仪 广州益善生物有限公司 超微量核酸蛋白分析仪 美国 .实验方法 .. 细胞培养 ...细胞复苏 .将冻存管从一?冰箱里取出后,迅速放入?的恒温水浴中,并不 时摇 动,使冻存的细胞在内迅速完全融化,然后在无菌的环境下取出细胞。 硕士学位论文 材料和方法 .将取出的细胞在/速度下离心~分钟,弃去上层液,加入适量 培养液后接种于培养瓶中,接种浓度×/,置于?的温箱静置培养,次日 更换一次培养液,继续培养,观察细胞生长情况。若细胞密度较高,则及时传代。 ...细胞培养 人肺腺癌细胞培养于含%胎牛血清的培养液中,/细胞 培养于含%胎牛血清及浓度为岬/吉非替尼的培养液中,置于?、 %、湿度为%的培养箱中培养,每?天更换一次培养液,?天传代。 细胞融合成单层贴壁细胞后,取对数生长期生长状态良好的细胞作为实验对象。 ...细胞传代 .显微镜下观察细胞贴壁状况和生长状态,选择细胞覆盖培养瓶底壁面积达 到%,细胞生长状态良好的细胞进行传代。 液洗涤细胞两次。 .传代前先倒掉培养瓶内旧培养液,用 ,洗涤后将浓度为.%胰蛋白酶加入培养瓶中进行消化,在显微镜下 观察,当%以上贴壁细胞分离呈现圆粒状时,将细胞移入超净工作台中,加入 完全培养液终止消化。 .用吹打管轻轻吹打,打散细胞团块,形成均匀的细胞悬液,用移液器将细 胞悬液平均移入相应数量瓶中,补加完全培养液至./瓶。盖紧瓶盖, 轻轻晃动培养瓶,使培养液均匀铺满瓶底,置于?、%、湿度为%培 养箱中培养。 ...细胞冻存 ,选择处于对数生长期生长状态良好的肺腺癌及/细胞作为冻存 细胞。 .依照细胞传代方法,将需要冻存的细胞,配制成为均匀分散的细胞悬液, 然后将细胞收集于离心管中离心/,分钟。 .离心结束后,倒掉上清液,加入预先配好的冻存液胎牛血清:培养 /之间。 基:,用吹打管轻轻吹打使细胞均匀,细胞浓度为×~× .将上述细胞分装于.冻存管中,用盖子将冻存管盖紧,置于?的冰 箱中,然后一?的冰箱中,最后置于.?冰箱中保存,并标记好细胞 名称和冻存同期,同时作好登记同期、细胞种类及代次、冻存支数。 材料和方法 硕士学位论文 ...细胞计数 .用浓度为.%胰蛋白酶消化贴壁细胞后,加入完全培养液配制成单 细胞悬液。 .取一干净计数板,将盖玻片覆盖在计数板上面,用移液器将一滴细胞悬液 倾斜滴入盖玻片的一侧,待悬液完全覆盖盖玻片。 .显微镜下计算计数板四角大方格的细胞数,用如下公式计算细胞数:每毫 升细胞数等于边角大格细胞数之和/。 .每次计数时重复操作三次,结果取平均值。 .. 法 ...细胞接种,收集对数期生长的肺腺癌细胞及/,分别制成细 完 胞悬液后调整浓度,取个/孑细胞接种于孔板,每孔加入 全培养基,每组设个复孔。 ...细胞在%、?温箱中常规培养后,分别加入不同浓度的吉非 替尼溶液岬/,.岬。此,.岬/,.岬。儿,.岬/,.岬。儿,? /,陋,,岫。儿,岬,;顺铂浓度分别为:/,岬/,./ ,岬?/,肛/【。,岫/,?/,/,?几;紫杉醇、多西紫 杉醇、长春瑞滨、吉西他滨、培美曲塞药物浓度分别为肛/,.岬 /, ./,.肛/,.肛儿,.岬/,岬/,/,“儿 继续培养。 ...在加药的第的前,每孔加入“溶液,,即.% ,继续培养后终止培养。 ...小心吸去孔内培养液,每孔加入“二甲基亚枫,置摇床上低速 振荡 ~分钟,使结晶充分溶解。在酶联免疫检测仪上选用波长测量各孔 的 吸光度。 ...计算抑制率抑制率实验组值/对照组值。 ..液相芯片法 ...液相芯片法检测 .将细胞离心收集于. 。 管中,加入裂解液,?下裂解反应 硕士学位论文 材料和方法 .采用美国公司超微量核酸蛋白分析仪检测裂解液中总州 纯度。 .将样本裂解液转移至孵育板上,加入支持探针.微球、支持延伸 探针、缓 冲液,度震荡孵育过夜。 .次日将孵育板放在磁力架上分钟,此时磁性微球聚集在底部,吸 取弃 去上清。 .加入洗涤液,震荡洗涤分钟,孵育板放在磁力架上分钟,吸取弃 去 上清,重复洗次。 .加入扩增延伸探针和标记探针,度震荡反应小时。 .孵育板放在磁力架上分钟,吸取弃去上清:用沈涤液洗次。 .加入链霉亲和素一藻红蛋白,度震荡反应分钟。 .孵育板放在磁力架上分钟,吸取弃去上清:用洗涤液洗次。 .加入洗涤液,震荡分钟,于阅读仪上读取数据。 .数据分析,得出检测结果; ... 仪器参数设定 : : : ;;;;;;; :,~ , ... 操作规程 .在的程序管理器中双击 .图标以打开 .程序。 .啪 .的封面及主窗口。 .启动成功后出现 . .程序自动连接仪器,并自动启动仪器激光系统预热。 为红色,并显示倒 .此时啪 .程序主窗口左下角的 数的离预热完成的时间。 .激光系统预热完成后, 转变为绿色锄 。 .在啪.程序主窗口,按键,仪器的样本口的门打不,托盘移出。 .将装有待测样本反应液的孔板置于托盘上。 .在 .程序主窗口,按键,托盘移入,样本口的门自动关闭。 .在啪 .程序,输入读数的参数设置和样本孔在孔板上的位置。 材料和方法 硕士学位论文 .按键,仪器开始读数。 .当仪器完成指定孔的读数后会自动停止。 ...数据采集和分析 软件读取原始结果显示为微球中位荧光读数,经益善生物有技术 股份有限公 司提供数据处理软件产生最终结果。 .. . ...样品制各 .用冰预冷洗涤细胞一次,吸尽。加入肛对裂解液,反复 吹打混合液 .冰上,蛋白裂解分钟。 .?,叩离心。提前开离心机预冷。 .将离心后的上清分装转移倒.的离心管中,冻存于.?。 ...蛋白浓度检测 按照蛋白定量试剂盒色使用说明操作,测定蛋白浓度。 .根据样品数量,按体积试剂加体积试剂:配制 适量工作液,充分混匀。工作液室温小时内稳定。 .完全溶解蛋白标准品,浓度为咄。蛋白样品在什么溶液中,标准 品 也宜用什么溶液稀释。 .将标准品按、、、、、、山加到孔板的标准品孔中,加用于 稀释标准品的溶液补足到“。 。加适当体积样品到孔板的样品孔中,加用于稀释标准品的溶液 到 “。 .各孔加入山工作液,?放置。 .测定,.之间的波长也可接受。根据标准曲线计算出蛋白 浓度。 ... 一电泳 .配%一%分离胶,加入后立即摇匀即可灌胶。灌胶后,用异 丙醇封胶。 .当水和胶之间有一条折射线时,说明胶己凝了。再等使胶充分凝 固硕士学位论文 材料和方法 就可倒去胶上层异丙醇并用吸水纸将其吸干。 .配%的浓缩胶,加入后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满 浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。 .电泳样品准备,使每个样品总蛋白上计算各个样品所需取样 量,并与牛 妇混匀,沸水煮,放入冰盒中速冷。 .上样,开始电泳。浓缩胶电泳电压为,分离胶电泳电压为。待 溴酚蓝电泳至胶底部时终止电泳。 二转膜 .准备张与胶同样大小的滤纸和张膜,膜先在甲醇中浸 湿,然后与滤纸一起放入转膜缓冲液中,至完全浸透。 .按照张滤纸,膜,胶,另张滤纸的顺序依次放好,要求中间没有气 泡。 .盖上仪器,接通电源,转膜约。 .转膜完毕后,将膜取出放入.中洗次,时间。 .用丽春红染膜,检测蛋白转膜的效率。用.将丽春红洗净。 三封闭 用配制%脱脂奶粉,将膜浸入后,室温放置小时。 四一抗孵育 用封闭液将一抗按照一定比例稀释,将膜与一抗一起孵育,度过 夜。孵育 结束,.洗次,每次。 五二抗孵育 用封闭液稀释标记的二抗,稀释比例:,将稀释 后的二抗与膜共同孵育.。孵育结束,.洗次,每次。 六显色/曝光 显色曝光:使用化学发光液珊与膜孵育,用吸水纸 吸尽液体,用保鲜膜将膜包裹杂交膜,在暗盒内与胶片曝光数秒 至数分钟; 显影冲洗。 ...数据分析 将曝光后的底片扫描。 ..统计学分析 采用.统计软件包对数据进行分析,各组数据用均数士标准差? 表示,组问比较采用独立样本检验,以.为有统计学意义。 实验结果 硕士学位论文 实验结果 . 实验结果 根据各浓度抑制率分别计算出吉非替尼、顺铂、吉西他滨、长春 瑞滨、紫杉 醇、多西紫杉醇、培美曲塞对肺腺癌细胞株、‘/的以表示上述各 化疗药对两个细胞株的敏感性。结果显示肺腺癌细胞对吉非替 尼、顺铂、 吉西他滨、长春瑞滨、紫杉醇、多西紫杉醇、培美曲塞的分别为: . 士.岬儿,.士.岬?。,.士. 邮?/,.士./, . 士.岬/,.士.岬/,.士. 岬/:肺腺癌/细 胞对吉非替尼、顺铂、吉西他滨、长春瑞滨、紫杉醇、多西紫杉 醇、培美曲塞的 分别为:.士.叭/,.士.肛/,.士.岬/, .士.岬/,.士./,.士./,.士.岬/ 。与细胞株相比较,/细胞株对吉非替尼、顺铂、吉西他滨、培美 曲塞的明显增高.;对长春瑞滨、紫杉醇、多西紫杉醇的明 显降低.。/细胞对吉非替尼、顺铂、吉西他滨、长春瑞滨、紫 杉醇、多西紫杉醇、培美曲塞的耐药指数分别为,.,.,.,., .,.见表.。 表. 肺腺癌细胞、/对化疗药物的岬几 .液相芯片检测结果 啪阅读仪读取微球中位荧光值的数据,检测各基因微球中位荧光 值与 相应对照组微球中位荧光值比值代表的相对表达量。结果显示, 细 胞株检测、汛、、基因的相对表达量分别为:硕士学位论文 实验结果 .士.,.士.,.士.,.士.;/细胞 株检测、?洲、、基因?的相对表达量分别为: .士. ,.士.,.土.,.士.。与细胞株 的表达量相比较,/细胞株、、的?表达量 明显增高.,的?的表达量明显降低.,均具有 统计学意义见表.。 表?肺腺癌细胞、/细胞株相关基因?的表达情况 表达量 值 基因 / ..土. .士.. .土. .士. 王 . . 土. .士. .士. .士. . ‘ 三:. 主 :.? : :::砧:: :汪 墨:三 图. 液相芯片检测、、、斟表达情况 . 实验结果 利用凝胶成像系统分析,以?作为内参蛋白,以各组待测蛋白条带 灰 度值/?条带灰度值表示各组待测蛋白的表达量。细胞株、、 、蛋白相对表达量分别为.士.,.士.,.士., .士.;/细胞株、、、蛋白表达量分别 为.士.,.士.,.士.,.士.;与细胞株蛋 硕士学位论文 实验结果 白的表达量相比较,/细胞株地、砌洲、的蛋白表达量明显增 高.,的蛋白表达量明显降低.,均具有统计学意义 见表.。 表?肺腺癌细胞、/细胞株相关基因蛋白表达情况 蛋白表达量 基因 值 / .士 . .士. . .士. .士. . .士. .士. . .士. .土. . / 图 检测、砌垤、、蛋白的表达情况实验结果 硕士学位论文 篓 口一 三 ?一: 三 薯 : : ::二: ::.: :三三: :二 基三 图? 检测、冰、、蛋白表达情况 硕士学位论文 讨论 讨论 肺癌是全世界最常见的恶性肿瘤之一,其发病率逐年升高,严重影响着人类 的生命健康。在我国,肺癌的发病率和死亡率亦占各种恶性肿瘤的首位。 是肺癌的主要类型,占其病例的%以上,主要治疗方式有化疗、放疗、分子靶 向治疗、生物治疗、中医中药治疗等。但是绝大部分非小细胞肺癌患者发现时已 处于中晚期,失去了手术治疗的机会,需要行化疗或分子靶向治疗等全身治疗。 靶向药物治疗突变型非小细胞肺癌取得了良好效果,但是大部分患者在治 疗.个月【】后仍然会出现继发性耐药导致疾病的进展。这使靶向治疗的应用产 生了一定的局限性。 目前已知多种机制可导致非小细胞肺癌.?继发性耐药,二次 突变突变【】、基因扩增【、.下调【、向小细胞肺癌转化【。、 缺失【、 外显子和及外显子?突变等。 其中突变是首个被国际上认证的导致继发性耐药的分子机制。 年等】首次报道了例发生突变晚期非小细胞肺癌患者,该 患者治疗前存在外显子缺失突变,在接受吉非替尼二线治疗完全缓解 年后疾病进展,对病灶进行二次活检时发现在原有突变基础上发生了新的基因突 变, 外显子位核苷酸发生点突变,该位点上的胞嘧啶核苷被 胸腺嘧啶核苷代替,导致其蛋白水平上苏氨酸被蛋氨酸取代,即酪氨酸激 酶功能域位点发生了突变,被称为突变。后续的研究发现,%以上 的非小细胞肺癌刚继发性耐药都是由己.突变所致【。 突变可独立发生,也可与上述其他继发性耐药机制同时存在。等对 突变和扩增的相互关系进行了研究,发现暴露于厄洛替尼的肺 癌细胞株出现了基因扩增而未检测到突变,暴露于厄洛替 尼和抑制剂.,的肺癌细胞株产生了突 变,并且也检测到中等量的基因扩增,同时体内实验研究也得到的相似的结 果,说明扩增与.突变之间存在互补的关系。年 等报道了一例治疗前存在外显子突变的非小细胞肺癌患者,该患者行 化疗和厄洛替尼治疗疾病进展后,再次行活检发现在外显子突变的基础上,同 时出现了突变和向小细胞肺癌转化的肺癌组织,说明这两种继发性耐药机 制可同时发生在同一患者。有趣的是,再次活检时发现外显子缺失突变存在于 非小细胞肺癌组织和小细胞肺癌组织,但突变仅存在于非小细胞肺癌组 织,在小细胞肺癌组织中并未检测到突变。结果显示,尽管这两种继发性 耐药机制出现在同一患者肺癌组织中,但是又好像是相互独立 的。对于上述 硕士学位论文 讨论 继发性耐药的分子机制之问的相互关系,尚有待进一步研究。 有关突变产生的原理,学者也进行了较为深入的研究。经 治疗后出现突变的机制主要有两种,一是吉非替尼慢性暴露 诱导 外显子核苷酸发生错义突变,胞嘧啶核苷被胸腺嘧啶核 苷替代;二是突变在未经.?治疗的肿瘤组织中微克隆存在, 治疗过程中耐药克隆得到扩增,被选择性富集。等【】进行了一系列研究, 首先采用吉非替尼浓度递增的方法,诱导人肺腺癌细胞产生了对吉非替尼耐 药的细胞株;将.细胞用逐步增加吉非替尼浓度的方法诱导,应用突变 体.富集法检测基因突变情况,在暴露吉非替尼天时,检测到..细 胞有突变,而且在.细胞突变更明显。说明暴露于吉非替尼或 厄洛替尼可能是诱导发生突变的原因之一。年等【应用一种使 突变富集的高敏感性检测方法,从例未经治疗的肺癌患 者中发现例突变,而用直接测序仅检出例,发现其在原发性肺癌耐药患 者中比例明显增高,并随治疗而选择性克隆增长。等【】 分析了例晚期非小细胞肺癌外周血循环肿瘤细胞及肿瘤组织的 突变状况,发现不仅存在于已经接受治疗患者的?中,亦存 在于治疗前肿瘤组织中,且治疗前突变与较差的无进展生存时间有关.个月 .个月,.。说明突变阳性并非只存在于?获得性耐药患者 中,也存在于未经治疗的肺癌组织中,同时也可能是.原发耐药的原因 之一。 目前临床上用于治疗的可逆性靶向治疗药物.主要有吉非 替尼、厄罗替尼及埃克替尼,它们通过竞争细胞表面的.催化域上镁三 磷酸腺苷?结合位点,截断生成信号传递至细胞内,从而遏制 细胞的增殖和血管生成,起到抗肿瘤作用。大量临床研究证实?的高敏感性与 体细胞突变明显相关,突变阳性者对的有效率明显高于野生型 患者%.%%一%。突变【主要集中在胞内段编码结构域外 显子~,包括外显子的缺失突变一、外显子点突变 鼬、外显子插入突变和外显子点突变。这些突变多发生在 结合裂隙附近,正是吉非替尼结合的靶点,其中以外显子缺失突变和 外显子点突变的患者疗效较好,而外显子突变疗效最好。?突变为 在.治疗过程中 外显子发生的二次突变,即 外 显子在位上发生错义突变,胸腺嘧啶核苷代替了胞嘧啶核苷,从而使 苏氨酸变成了蛋氨酸,蛋氨酸的侧链构型对的结合形成位阻,减弱了 其与.的亲和力,同时增加了与之问的亲和力,使重新 讨论 硕十学位论文 处于被激活状态。,最终使这类药物无法阻止磷酸化所介导的信号传导 而发生继发性耐药。 为克服非小细胞肺癌突变导致?继发性耐药的问题,学者采 取了相应的治疗策略。第二代,如,?一等,可与 催化域结合位点边缘的.共价结合,使药物浓度大幅度升高,同时提供 持续的封锁效应,能进一步增强对肿瘤细胞的抑制,对突变所致继发性耐 药的非小细胞肺癌患者可起到较好的治疗效果。“】等研究显示在体 内外实验中均能抗和,并能克服突变所致继发性耐药。 玎.【】为不可逆的啪和双重抑制剂,与发生结合,形 成不可逆的复合物,从而产生更强的抑制作用,同样对突变所致吉非替尼 耐药非小细胞肺癌患者有较好的临床疗效。除第二代单独应用外,其 与抗血管生成药物的联合应用也取得了较好的治疗效果。研究显示删,对既往 接受吉非替尼或厄洛替尼治疗后出现获得性耐药特别是突变的患者, 应用阿法替尼联合西妥昔单抗治疗,可获得%的部分缓解。第三代靶向治疗药 物【】选择性以为靶点,显示了惊人的治疗活性。体外研究显示,与 基于喹唑啉的表皮生长因子受体抑制剂相比,第三代靶向药物具有.倍以上 的抗 突变活性。此外,学者还提出了许多其他治疗策略,如 抑制剂【,特异性【等。 尽管基础和临床研究均显示,上述治疗方法对突变所致继发性耐药非 小细胞肺癌取得了一定的疗效。但是,已有研究显示第二代?尚并不能 充分阻止依赖信号通路的细胞出现。卧,【】等通过对突变的 非小细胞肺癌细胞采用阿法替尼浓度递增培养方法体外建立了阿法替尼耐药细 胞株。通过检测区域.外显子发现,所有依赖的耐药克 隆细胞均存在外显子突变。同时作者还报道了一例不吸烟的 期肺腺癌女性患者,治疗前存在.缺失突变。此患者未应用过吉非替尼 或者厄洛替尼治疗,参加了阿法替尼的期临床研究。虽然开始治疗时患者对阿 法替尼敏感,最终还是出现了肿瘤复发转移,再次活检发现肿瘤组织存在 突变,这在治疗前的肿瘤组织中是不存在的。这个临床案例说明,延长阿 法替尼的治疗,最终也会出现突变导致继发性耐药。此外,也有研 究现?,依赖的肺癌也以类似的方式对?.产生耐药。上述报道说明, 不可逆的二代.同样存在继发性耐药的问题。 目前,对于可逆性治疗后疾病进展的晚期非小细胞肺癌患者尚无 标准的治疗方案。指南指出【,一线厄洛替尼治疗进展后可选择含铂的 两药联合方案类推荐;而二三线治疗失败后,指南并没有推荐 硕士学位论文 讨论 明确的治疗方案,专家认为需根据患者的一般情况选择试验性治疗或最佳支持治 疗。年中国抗癌协会会议上吴一龙和郭文斌报道了吉非替尼治疗 失败后的患者给予多西他赛治疗仍可取得较好的疗效。等 对例 一线行含 铂两药方案化疗及后续治疗失败的患者患者行挽救性化疗多西他赛、 培美曲塞或其他方案。所有患者中无一例完全缓解,其部分缓解患者占.% /,稳定患者占.%/,疾病进展患者占.%/。其总有效率 .%,疾病控制率.%。中位生存期及中位无进展生存期分别为.个月和. 个月。而且既往?治疗时间个月的患者其化疗效果及无进展生存期较 其他患者更好。等】回顾性分析了例晚期患者应用培美曲塞单 药作为三线、四线化疗的疗效。结果显示例患者部分缓解.%,例患者 稳定.%,例患者进展.%,疾病控制率.%,总生存期为. 个月。同时,应用免疫组织化学法分析了例患者的肺癌组织中胸苷酸合成酶的 表达情况,例患者.%的肺癌组织表达胸苷酸合成酶,但是其表达与临床 病理因素之间并没有明显的相关性。上述研究结果显示,.?治疗失败后 化疗仍可取得一定的治疗效果,是可选择的治疗方案之一。 对于?治疗失败后化疗的应用,目前虽然没有高级别的临床试验 证 据,但多数文献报道认为如果患者一般情况允许,采用含铂联合化疗能取得一定 的效果;尤其是.?治疗时间超过个月的患者收益更大。上述临床研究均 是对化疗及?治疗失败后整体人群进行的研究,并未针对不同机制导致 的继发性耐药的患者进行分组研究,故而不同机制导致的继发性耐药的非小细胞 肺癌对化疗药物的敏感性是否不同,尚需进一步的研究。 目前研究证实一些分子标记物与化疗药物敏感性存在相关关系,可以通过这 些分子标记物的表达水平来预测化疗药物的敏感性。铂类药物的敏感性与肿瘤细 胞损伤修复能力相关,其发生耐药主要是因为肿瘤细胞损伤修复能力 增强,使其对损伤产生耐受。修复主要有核苷酸切除修复 . . ,和链内交联修复 ,?两条 途径。铂类药物作用主要激活核苷酸切除修复是主要修复途径。切除修 复交叉互补基因是一种核苷酸内切酶,也是途径中的关键酶, 在铂类药物一加合物修复中其限速作用。如果缺乏,铂类与加合 物修复被限制,则化疗药物敏感性增加。相反,高表达,使该修复能力增 加,从而使化疗敏感性下降,表现为铂类耐药。临床研究也证实了与铂类 化疗药物耐药的关系,其表达水平与铂类药物化疗疗效呈负相关川。在接受铂 类化疗前进行 斟表达水平检测可提高治疗有效率列。核苷酸还原酶 它能使二磷酸核苷 曲 ,是合成通路中的限速酶, 硕士学位论文 讨论 酸转化为二磷酸脱氧核苷酸,后者是合成所必需的原料。核苷酸还原酶包 括泳和砌舵两个亚单位,其中?洲是核苷酸结合位点,控制底物的特异 性和整个酶的活性。吉西他滨的作用靶点为刚基因编码核糖核苷酸还原酶 亚单位,它在细胞内经过核苷激酶的作用转化成具有活性的二磷酸核苷 及三磷酸核苷心,二磷酸核苷可抑制的活性,使合成所 必需的三磷酸脱氧核苷产生受抑制,减少了合成的原料,从而抑制 肿瘤细胞的生长增殖。临床研究显示脚?表达水平低的肺癌患者的吉西他滨治 疗效果相对较好,中位生存期较长引。胸苷酸合成酶??嘧啶核苷酸合 成的限速酶,其主要功能是与亚甲基四氢叶酸结合,催化尿嘧啶脱氧核苷酸甲基 化为胸嘧啶脱氧核苷酸。培美曲塞能够抑制叶酸合成所必要的酶的活性,如胸苷 酸合成酶、二氢叶酸还原酶和苷氨酰胺核苷酸甲酰转移酶等,从而破坏细胞内叶 酸依赖的正常代谢过程,抑制肿瘤的生长增殖。的高表达相关与培美曲塞 的耐药性相关,表达量低的患者接受培美曲赛化疗的效果较好】。紫杉类药物 及长春瑞滨都属于抗微管药物,其靶点是微管。微管是构成细胞骨架成分之一, 由微管蛋白二聚体和微管相关蛋白组成。微管蛋白二聚体是组成微管亚 单位,由.微管蛋白和.微管蛋白组成。紫杉类药物通过促进微管聚合,形成稳 定的微管束,抑制微管解聚,使之不能形成纺垂体,使细胞停止在和期,抑 制细胞的增殖。长春瑞滨则是抑制微管蛋白聚合成微管,使纺垂体无法形成,从 而使细胞停止于有丝分裂的中期。目前知道至少有种小微管蛋白和种.微管蛋 白同种型。.由编码,在结构上、功能上较其他?同 种型均不一样,它与抗微管化疗药敏感性的关系最密切却】。可以作为 预测患者对接受微管类药物治疗的重要指标。表达水平低的肿瘤 患者接受紫杉醇类药物化疗的效果较好,中位生存期较长。反之,高表 达的患者的经抗微管类化疗的疗效较差。 本实验中,为吉非替尼敏感肺腺癌细胞株,/为采用大剂量吉非替 尼冲击结合逐步递增浓度体外诱导获得的吉非替尼继发性耐药肺腺癌细胞株, /对吉非替尼的耐药指数为。液相芯片检测显示细胞株 外显 子缺失突变.;/细胞株不仅存在 外显子缺失突变 ,同时存在 外显子突变。我们应用法检测 及/两个细胞株对顺铂、吉西他滨、长春瑞滨、紫杉醇、多西紫 杉醇、 培美曲塞的,分别应用液相芯片法和法检测上述药物化疗敏感性 相关基因、、、 ?及蛋白的表达情况。,不实验结 果显示,/细胞株对顺铂、吉西他滨、培美曲塞的较细胞株明显增 高,其对长春瑞滨、紫杉醇、多西紫杉醇较细胞株明显降低。同时,与 硕十学位论文 讨论 及蛋白表达量明显 细胞株相比,/细胞株、?、 升高,其 及蛋白含量明显降低。说明/细胞株较细胞株 对顺铂、吉西他滨、培美曲塞的药物敏感性明显降低,产生了不同程度的耐药; 而对抗微管类药物长春瑞滨、紫杉醇、多西紫杉醇的敏感性增高。【】等回顾 性分析了例肺癌患者,这部分患者一线应用吉非替尼耐药后,改行化疗,其 有效率为%,其中以铂类为基础或者以紫杉类为基础的联合化疗,其有效率明 显较单药或者其他化疗方案有效率高,其中紫衫类联合铂类有效率最高,达. %。的研究中应用紫杉类化疗药物的有效率最高,说明非小细胞肺癌 继发性耐药后,对紫杉类药物仍有较高的敏感性,与本实验的结果一 致。但是其应用顺铂为基础的化疗药物也较敏感与本实验结果不相一致,原因可 能是的研究中应用的是以顺铂为基础的联合化疗,而本实验中是进行的顺铂 单药化疗的研究。另外,周彩存】等进行基础研究发现吉非替尼获得性耐药的肺 腺癌细胞株与亲代非耐药细胞株相比,其对顺铂敏感性明显减弱,对多西他赛敏 感性增强,这与本实验的结果一致;同时周彩存的研究中,耐吉非替尼细胞株与 非耐药细胞株对培美曲塞的敏感性无明显变化,其原因可能是由于他的研究中应 用的细胞株是应用致突变剂及吉非替尼短时间内诱导突变导致的吉非替尼耐药 细胞株,并未对其进行耐药机制的检测,其产生耐药的机制并不明确,而本实验 的/细胞株对吉非替尼耐药是由‘突变导致的,两者可能存在耐 药机制及其他方面的不同。本实验中经吉非替尼治疗发生耐药后, 对顺铂、吉西 他滨、培美曲塞敏感性降低可能分别与、对洲、表达量明显升高有关。 及蛋白表达量明显降低,可能是紫杉类药物化疗敏感性增高的原 因。此外,研究显示/与肺癌的多药耐药的产生存在密切关系,吉非替 尼作用导致/信号通路的变化,可能使肺腺癌细胞产生多药耐药,从而 进一步导致其对某些化疗药物的敏感性降低。而对以微管蛋白为基础的紫杉类 化疗药物敏感性提高,原因可能与细胞株产生继发性耐药后,细胞株? 蛋白表达水平降低相关。已有研究显示一蛋白的过度表达参与了细胞多药耐 药机制的产生,且与紫杉类的化疗耐药相关,其表达水平降低,可能使细胞株对 紫杉类化疗药物的敏感性增高。肺腺癌细胞株突变导致吉非替尼继 发性耐药后,对上述化疗药物的敏感性发生变化的机制尚待进一步研究。我们的 研究提示,临床使用吉非替尼导致.突变发生继发性耐药后,改行化 疗时,建议应用以紫杉类为基础的化疗方案,避免使用吉西他滨及铂类为基础的 化疗方案。 我们的研究还存在一些不足的地方,首先并未对实验所应用的细胞株进行 .以外其他耐药机制的检测,并不确定除突变,细胞株是否 讨论 硕士学位论文 还存在其他导致吉非替尼耐药的机制。此外,实验检测了吉非替尼耐药细胞株对 肺癌一线及二线化疗药物单药的敏感性变化,并未对联合用药进行研究,也未对 化疗药物敏感性发生变化的机制进行研究。结论 硕士学位论文 结论 、肺腺癌细胞株发生.突变后对化疗药物敏感性发生变化,对 顺铂、吉西他滨、培美曲塞的敏感性降低,对长春瑞滨、紫杉醇、多西紫杉醇的 敏感性增高。 、肺腺癌细胞株发生突变后、、 及 蛋白表达量明显升高, 及蛋白表达量明显降低,可能是其化疗药 物敏感性发生变化的原因之一。参考文献 硕士学位论文 参考文献 趾 ? . 【】? 吼 :丘 培锄: 瑚血 仃. . :. . ,础 ,油 , : 【】 印 】喀玎【 谢 砷】 咖 置 : . ,砌 :一,. 叩 . : , 锄 , 【】 缸. .. 觚 .王 ,】 砬 血 . 锣 啪 争 ::?. 啦 , , 】们 . 够 :】 谢 哪. . , :. 【】 ,,舳 ,锄 , . 叮锄 匣卸 如. .,:. , , , 【】 . 衄 .锣 犯 柚. 印 印掣 印?. , : 玎, 】 , , .锄 诅. 眦 ;:. 出 , ,? ., . 协 ::.. , ,【 , ,. ,:?. 硕士学位论文 参考文献 . , , 】 , 、析廿 . .印. ;: ~, .【】 , , 咖、矾 胁 ? 粥诵 切.::一.】觚,硒 ,, .硎 蠡 珊 船印 口 丽 此 . ;:. . 【 , , , ?. ,,:. 【】 , , , .舭 咖 沁鼬船. ::.. , 【】 ,唱 , . 咖?. 啪 ,啪 , 。 ?. 符立梧,江本元.的突变富集检测方法和克隆演化假设.循证医 学.年月第卷第期:?., , , 【 】 . 叭 ,,:. 培吼 【】. . , 】 , , 印 砒? . ,, :?. . , , 】 , . ,,:. 砌 】 ,砌, , . 瑚 【. ,,:?. 蚰 .,‘、 【 , ? ? . 印 ;:一. 参考文献 硕学位论文 . , 【】谢撕 . ::. 曲 , , , . 【】 、访 【雒 ,,:. 【. . 【 , ,锄, . . ,,: . 诵 、, 】锄,曲 , , .锄撕 切 删切 谢咖 曲 【. ,,: .. ?啪 ,啪 , , 枷够 【】.,,:?. 】 ,. , , . 印咖 吐 协 眦 谢 . ,, :?. , , / 【】 , ., 仃.,, ,. . 【】 ,缅 , ,勾 够 一 ?一, . ,盯 柚 ::?. . 】 , , 唱 勾. ::一. , , , . 哆 觚 塔::. , . , , , , ,印 ? . :: . 参考文献 硕士学位论文, , 】 ,埏 . ? . ::?. .., , , 【】 切? 锄妒 撕 诵 . “. . , 【】 ,曲 , .;:. . 】?撇, ,由 , ”” :【 .;:仁. 【】. .., , . 印 】缸,.. ?.彻曲 ;:..’ , , ,伍 班 ?? 汕 , ,】.吼 . , , 埘 一, . ? 】跏 , ,:. . 锄. . , , 廿 , : 玛 :?. .: . , . ,、厂 ,【??:一 . ,, . , , .】 , .,:.. ,知 ,【】 , 硕士学位论文 参考文献?? ?、? 诅印 玛. ,,:.. .? . 【 , , 岫.、 . 【. ;:.. , .弱 , , , , 硼 虹 仃 .鼢, :.. , . ’ ? 】 , , 叩? 】. .,: .. 】邓沁芳,粟波,赵印敏等.吉非替尼获得性耐药细胞株对不同化疗药物的敏感 性分】.中华肿瘤杂志.,:..硕士学位论文 综述 综述 .与化疗在非小细胞肺癌治疗中的应用策略 摘要:化疗能使晚期患者中位生存期达到~个月,但其疗效已达 到一个平台期,患者和无法获得进一步的延长。随着人们对肿瘤分子生物 学和基因水平的深入研究,以吉非替尼、厄洛替尼为代表的表皮生长因子受体酪 氨酸激酶抑制剂?靶向治疗成为其治疗的重要手段。虽然两者作用 机理不同,但是大型临床研究显示化疗与联合应用并未显示出临床获 益,先化疗后序贯应用才能产生协同增效作用。现就与化 疗在非小细胞肺癌中的应用策略的研究进展作一综述。 关键词:化疗;.?;非小细胞肺癌 肺癌是世界上发病率最高的恶性肿瘤之一,在中国肺癌的发病率及死亡率亦 占各种恶性肿瘤的首位。非小细胞肺癌作为肺癌的主要类型,占肺癌病例的% 以上,并且多数病人确诊时已处于晚期,丧失了手术治疗的机会,需要进行化疗 或分子靶向治疗。对于大多数晚期患者,以铂类为基础的一线化疗有效 率仅为%。%,疗效已达到平台。近年来,随着肺癌基因分型及分子靶向药 物的发展,靶向治疗已成为晚期非小细胞肺癌治疗的重要手段,并取得惊人的效 果。化疗和表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂?是晚期非小细胞肺癌 的两大主要治疗手段,二者作用机制不同,理论上联合应用能产生增效作用,但 是多中心临床研究证明联合用药并未优于单独化疗【捌,先化疗后序贯应用 .才能产生协同增效作用【,】。近年来,许多学者就?与化疗 在非小细胞肺癌中的应用进行了较为深入的研究,现将其综述如下。 ?与化疗作用机制 . ?作用机制 .. 结构功能 表皮生长因子是人表皮生长因子家族成员,属于受体酪 氨酸激酶家族,为原癌基因。一表达产物。编码基因位于第 号染色体短臂上,长,由个外显子组成,编码个氨基酸唑其糖蛋 白分子量约为【。它由胞外配体结合区、跨膜区和胞内酪氨酸激酶区个 不同的结构区组成。特异性配体如表皮生长因子、肝素结合样生长因子、转 ’硕士学位论文 综述 化生长因子、双向调节蛋白等与胞外结合区结合并诱导其二聚化形成同源 二聚体。二聚体形成后使受体的结构发生改变,发生交联磷酸化,激活胞内区的 酪氨酸激酶,从而进一步激活下游一系列信号传导通路。下游有三条主要 信号通路:?瓜舳舳刚通路、舯/通路、刚、 吖通蹦。这些通路可以调节细胞生长、增殖、分化等多种生理过 程,而 在人类许多上皮性肿瘤中被异常激活,与肿瘤细胞增殖、新生血管形成、侵袭、 转移、抗凋亡及预后差等有关。 .. 作用机制 表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂.?是一类作用于细胞内表皮生 长因子受体酪氨酸激酶区的小分子药物,通过竞争细胞表面的.催化域 上哥结合位点,抑制与受体胞内酪氨酸区结合,从而抑制酪氨酸激 酶活化,阻断生成信号传递至细胞内,从而遏制细胞的增殖和血管生成, 起到抗肿瘤作用。的敏感性与体细胞突变相关【,突变 阳性者对?的有效率为%.%,而野生型患者有效率仅为%.%。 突变主要集中在胞内段编码结构域外显子~