.I型内皮素受体反义寡聚核苷酸抑制VSMC增殖及内膜增生

.I型内皮素受体反义寡聚核苷酸抑制VSMC增殖及内膜增生 雅思班www.seeree.net 您现在的位置:论文天下 > 免费论文 > 医药学论文 > 医学论文 I型内皮素受体反义寡聚核苷酸抑制VSMC增殖及内膜增生 作者: 时间:2007/11/22 11:29:00 来源:论文天下论文网 雅思培训班www.seeree.net 作者:钱济先 ，张柏根 ，李桂云 ，张岚，邓廉夫，朱雅萍 【关键词】 内皮素 关键词: 内皮素;反义寡核苷酸;血管平滑肌细胞 摘 要:目的 观察?型内皮素受体(ETA)反义寡核苷酸(ODN)对血管平滑肌细胞(VSMC) 增殖和内膜增生的抑制作用. 方法 ?细胞培养:取家兔主动脉中膜消化后培养传代，经抗α -actin鉴定后使用第4,6代传代细胞;?人工合成ODN:经Genbank检索筛选，合成含18bp ETA-ODN片段，再对5'端硫代修饰以增加稳定性，同时行地高辛标记以检测反义片段的细胞 膜穿透性;?MTT分光光度法检测ETA-ODN对VSMC增殖的抑制作用;?运用放射受体结合分析 法(125 I-ET-1)了解ODN对ETA蛋白表达的抑制作用，以探讨其反义作用;?兔颈动脉空气 干燥模型在体研究ODN对血管内膜增生的抑制作用:应用F-127凝胶载体携带ETA-ODN(3.0 μmol L-1 )导入血管周围，术后不同时间观察增生内膜相对厚度. 结果 ODN于培养后12h 1 ETA-ODN对VSMC增殖具有抑制作用，24h后即有显著进入细胞内，并逐渐增加;15μmol L- 作用;ETA-ODN对ETA表达亦有明显的抑制作用，表现为CPM于24h逐渐减少;ETA-ODN导入后， 血管增生内膜相对厚度减少. 结论 ETA-ODN以浓度和时间依赖方式抑制ETA蛋白表达以及 VSMC的增殖;反义寡核苷酸是通过反义机制实现对ETA蛋白和VSMC增殖的抑制作用. Antisense endothelin?1receptor oligonucleotide in?hibit vascular smooth muscle cell proliferation and intimal hyperplasia Abstract:AIM To evaluate the inhibitive effect of antisense endothelin-1receptor oligonucleotide(ODN)on VSMC growth and intimal hyperplasia.METHODS ?Cell cul-ture.The medium of rabbit aorta were harvested，digested and the dispersions were cultured.The cells of passage4,6were routinely used to study after identification withα-actin antibody.?ODN synthesis.The antisense sequences were designed and screened through Genebank scanning.After these procedures，eighteen phosphorothioate antisense com-plementary to ETA cDNA were synthesized，and eventually labeled with digoxin by which the sequences stability be aug-mented and membranous permeability tested.?MTT method was used to evaluate DNA synthesis in ODN treated VSMC.?125 I-ET-1radiobinding assay to ETA and immuno-histochemistry were utilized to examine protein expression of the receptor，and to discuss roles of the ODN.?ODN dis-solved in200mL L-1 F-127gel solution at concentration of3.0μmol L-1 were applied to surround the exposed region of carotid artery on the basis of Air Dry Model.Thus the inti-mal thickness and luminal narrowness could be investigated.RESULTS ?ETA-ODN could be found in cultured VSMC in12h and gradually increased.?ETA-ODN at concentra-tion of15μmol L-1 suppressed VSMC proliferation，which showed a 雅思培训班www.seeree.net significant action in24h.?ETA protein expres-sion was reduced，indicated by the phenomenas that CPM progressively decreased in24h.?Intimal thickness and lu-minal narrowness were lightened after ETA-ODN induction.CONCLUSION ETA-ODN suppresses ETA expression and SMC proliferation in a time and concentration dependent manner.ETA plays an important role in mediating cultured VSMC proliferation course.ETA-ODN exerts inhibitory function through antisense mechanism. 0 引言 血管移植或动脉腔内成形术后血管内膜均不同程度地发生增生，严重的可致血管狭窄或 再狭窄.内膜增生的细胞学基础是血管中膜平滑肌细胞(SMC)向内膜迁移并增殖，因此若能 控制血管SMC(VSMC)增殖即可实现抑制内膜增生.既往人们用化学药物，如阿斯匹林、潘生 汀、肝素和类皮质激素等试图抑制血管内膜增生,1, ，但效果均不理想.近年来的研究 I型内皮素(ET-1)在诱导血管收缩和VSMC增殖方面起重要作用，在动脉粥样硬化的VSMC 中，?型内皮素受体(ETA)mRNA表达显著增多,2, ，而且ET-1可增加VSMC内 3 H-TdR结合率,3, ，增强PDGF诱导的DNA合成,4, .现已明确，ET在血管内膜增生中发挥着重 要的促分裂效应.作为基因治疗的一方面，反义技术已逐渐成为血管领域的重要的治疗方法 ,5, .针对ET-1及其受体ETA在血管SMC增殖和内膜增生中的重要作用，我们合成了含18bp 的ETA反义寡聚核苷酸(ODN)，并经硫代膦酸修饰，在离体SMC培养和动物在体模型基础上 探讨ODNS对VSMC上ETA蛋白表达、SMC增殖和内膜增生的影响，为防治血管内膜增生和血 管狭窄提供实验依据. 1 材料和方法 1.1 细胞培养 无菌取家兔主动脉段，去内外膜置100mL L-1 NBS DMEM培养液中，剪碎，吸去DMEM， 加1.25g L -1 胰蛋白酶震荡消化45min，低速离心(1000r min-1 )，弃组织块，收集上清液加培 养液移至培养瓶(75mL)，置37?，50mL L-1 CO2 孵箱.取用第4,6代细胞，多余细胞分装 冻存备用. 1.2 SMC鉴定 将SMC按每孔1×10 4 个细胞转种于置有无菌载玻片的6孔板内，37?，50mL L-1 CO2 孵箱内培养，细胞贴壁生长至一定密度时取出载玻片，免疫组化(ABC)染色后观察. 1.3 反义核苷酸的设计合成 雅思培训班www.seeree.net 根据已克隆的大鼠ETA核酸序列,6, ，经中科院上海生化所Genebank检索后，分别筛选并设计特异性高的含18bp的反义片段，DNA合成仪合成30A的寡核苷酸.同法合成相应的正义片段.另外合成标有地高辛的反义ETA10A，以验证反义核酸的膜穿透性.5'端碱基硫代磷酸化修饰以增加寡核苷酸在血清中的稳定性. 1.4 ODN的膜透性检测 将地高辛修饰标记的ETA ODN(10μmol)与SMC共培养，爬片生长，孵箱培养4，12，24和48h后取出玻片，通过抗体免疫 组化呈色反应以显示ODN的细胞膜透性.每种因素重复3次. 1.5 ETA?ODN对血管SMC增殖的作用 MTT实验 取第四代细胞接种96孔板，密度每孔1×104 细胞，孵育48h，分别加入ETA-ODN5.0，10.0和15.0μmol L-1 ，设立正义对照、阴性对照(不加ODN)和空白对照(不加细胞)，每组3孔，培养12，24，48和72h后分别加入质量分数为50mg L-1 的MTT，孵育4h后再加入二甲基亚砜20μL，移至酶标仪测定光度值. 1.6 细胞生长计数 根据上述结果，用15μmol L-1 浓度的ETA-ODN观察对SMC生长的抑制作用.按1×104 密度接种24孔板，时间组和其他步骤同上，在倒置显微镜下计算活细胞个数. 1.7 ETA?ODN对ETA蛋白表达作用 放射受体结合分析法 将经ETA-ODN(15μmol L-1 )处理过的细胞制成悬浮液，加入125 I-ET-1250μL(摩尔活度63GBq mol-1 )，37?孵育2h，离心弃上清，用冷DMEM快速洗3遍，进行γ计数.以加入10-7 mol L-1 未标记的ET-1200μL后(不加为空白对照)所得的每分计数(cpm)作为非特异性结合率，样品的cpm减去非特异性结合的cpm为125 I-ET-1的特异性结合率. 1.8 ETA?ODN对血管内膜增生的作用的在体实验 1.8.1 血管模型的建立和反义寡核苷酸的导入 30mL L-1 戊巴比妥钠(40mg kg-1 )静脉麻醉，家兔取仰卧位消毒后，沿颈正中切开皮肤，显露颈动脉，轻柔剥离外膜后游离颈动脉2.0cm长，上下无创夹阻血后，从一端注入空气，另一端抽出空气，持续10min(Fig1)，造成血管内皮细胞脱落.在血管周围注入4?预 [1] [2] [3] 下一页 【收藏本论文】【我的收藏】 【我要投稿】 雅思培训班www.seeree.net 3000万硕士、博士、期刊论文全文下载 论文发表:快速、低价、优质 提供60万硕士论文、10万博士论文、2700万期刊论文全文下载服务，助您一臂之力～ 快捷的论文发表服务,保证所发表的杂志均为正规 十年的论文发表经验, 合法的期刊,收费同行最低～ [本文关键字] 内皮素 内皮素受体 受体 反义 核苷酸 抑制 增殖 内膜增生 增生 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