【doc】 AHMT分光光度法测定软骨鱼类硫酸软骨素

【doc】 AHMT分光光度法测定软骨鱼类硫酸软骨素 AHMT分光光度法测定软骨鱼类硫酸软骨 素 中国海洋药物杂志2005年8月第24卷第4期Chin_rMarD九’,2,005Aug,y0z.24N0.4 AHMT分光光度法测定软骨鱼类硫酸软骨素? 刘坤,高华 (1it岛大学医学院.山东青岛266021) 摘要:建立一种测定硫酸软骨素(chs)的新方法.本方法利用4一氨基一3一肼基一5一巯基一1,2,4.一-~(AH— MT)与硫酸软骨素反应生成紫色的衍生物,即6-巯基一3一均三唑并[4.3-b]对称四嗪,在540nIT1波长处测定硫 酸软骨素,浓度在0.1,1.Og?L范围内符合朗伯比耳定律.该方法简单,快速,灵敏度高. 关键词:硫酸软骨素;分光光度法;4一氨基一3一肼基一5一巯基一1,2,4一三唑 中图分类号:R917文献标识码:A文章编号:1002—3461(2005)04—0021—03 Spectrophotometricdeterminationofchondroitinsulfatewith4-? amino-3一hydrazine-5一mercapto-1,2,4-triazole LIUKun,GAOHua (MedicalCollege,QingdaoUniversity,Qingdao266021,China) Abstract:Toestablishanewmethodforthedeterminationofchondroitinsulfate.Themeth— odwasbasedontheinteractionofsodiumchondroitinsulfatewith4-amino..3..hydrazino..5.. mercapto-1,2,4一triazoletoyieldavioletproduct,6-mercapto一3一 suhstituted-s—triazolo—E4,3— 53一 S—tetrzainederivatives.Absorbanceat540nmobeyedBeer’sLawwithintheconcentration rangefrom0.1to1.0g?L_.andtheresultswerepreciseandaccurate.Themethodwasop— erationallysimpleandhadagoodprecisionandsensitivity. Keywords:chondroitinsulfate(ChS);spectrophotometry;4-amino-3一 hydrazino一5一mercapto- 1.2.4一triazole 硫酸软骨索是从动物软骨中提取的酸性 黏多糖,具有降血脂,抗动脉粥样硬化[1],抗 肿瘤[2],治疗关节炎的作用[3],ChS制剂在临 床上广泛用于治疗高血脂,动脉硬化,心绞 痛,偏头痛,神经痛,关节炎,肝炎等症[4]. 近年来,硫酸软骨素作为一种天然药用活性 成分,逐渐受到人们的重视.ChS是由【)_葡 萄糖醛酸和N一乙酰一氨基半乳糖组成,在 酸性条件下可以水解产生葡萄糖醛酸和氨基 半乳糖,其含量测定方法一般是通过测定两 水解产物的量换算而得.建立在氨基半乳糖 测定基础上的光度法有Emson—Morgan比 色法c引,建立在葡萄糖醛酸测定基础上的 ?基金项目:山东省科技厅女助项目(200IBBICBAZ) 光度法有咔唑比色法[6],另外还有问苯三酚 法[7].Emson—Morgan法和咔唑法操作繁 琐,重现性和准确度较差.4一氨基一3一肼基一5一 巯基一1,2,4,一三唑(4-amino一3一hydrazino-5一 mercapto一1,2,4-triazole,AHMT)作为显色 剂,最早被用于测定脂肪族或芳香族醛类. AHMT与己糖醛酸或硫酸软骨素显色灵敏, 在氧化剂K10.的碱性溶液中,AHMT与 ChS生成紫色的衍生物一6一巯基一3一均三唑并 [4,3_b]对称四嗪,在540nm波长处通过测 定该衍生物的吸光度可以测定ChS的含量. 该方法操作简便,准确度和重现性好,回收率 高,用其测定几种软骨鱼类硫酸软骨素含量, ? 21? n.,rDrugs,2005Aug,Vo1.24No.4中国海洋药物杂志2005年8月第24 卷第4期 获得满意结果. 1材料和方法 1.1材料 仪器:UV-26o紫外分光光度计(日本岛 津);CY42o恒温水浴箱(at京长安科学器材 厂);HY60混匀器(江苏金坛仪器厂). 试剂:鲨鱼,孔鳐和光虹ChS样品(青岛 信隆生化制品有限公司);ChS品(Ch孓 C),(Sigma产品);AHMT(Fluka产品);碘 酸钾,氢氧化钾,盐酸,乙醇,均为分析纯. ChS标准溶液:准确称取0.5000gChS 标准品,置于小烧杯中加入lmol?L-1KOH 溶解,用1mol?LKOH定容于50mL容量 瓶中,将此作为储备液(10g?L-1).将储备 液用lmol?LKOH适当稀释,配成所需 浓度的工作溶液(O.1,1.Og?L). AHMT溶液:5g?L_.,称取0.50g AHMT,加入0.5mol?L-1HCl溶液溶解, 定容于100mL容量瓶中. KIO4溶液:10g?L,,称取1.00g KIO.,加入0.2mol?LKOH溶液溶解,定 容于100ml容量瓶中. 1.2方法 1.2.1样品处理取硫酸软骨素样品于 105?干燥至恒重,准确称取0.5000g,加入 lmol?LKOH溶解,并定容于500mL容 量瓶中,即配制浓度为1g?L的样品溶液. 1.2.2分析方法准确移取硫酸软骨素标 准或样品溶液一定体积,置于10mL比色管 中,用蒸馏水稀释至1.0mL,加入2mol?L’1 K0H溶液3.0mL,5g?L-1AHMT溶液3. 0mL,盖塞,混匀.将比色管置于9O?水浴 中加热10min,然后取出立即置于冰水浴中 冷却5min,加入10g?L_.KIOt溶液1.0 mL,缓慢机械震荡20min,在540nm波长 处,以试剂空白为参比,用lcm比色皿测定 溶液吸光度. 1.2.3标准曲线移取浓度为0.10,0.2O, ? 22? 0.3O,0.40,0.5O,0.60,0. 70,0.8O,0.9O. 1.00g?L的ChS溶液各1.0mL,分别置 于10mL比色管中,其它处理同1.2.2.每 个浓度作3个平行管.以测定溶液的吸光度 (A)值(z土)为纵坐标,以所取标准溶液浓 度C(g?L-1)为横坐标绘制标准曲线. 2结果与讨论 2.1吸收光谱 移取1g?L-1硫酸软骨素标准溶液0.5 mL,置于10mL比色管中,按上述1.2.2方法 处理.在碱性介质中ChS与AMHT以及 KI氧化剂反应生成紫色溶液.用分光光度 计,在400~700nm波长范围,以试剂空白为 参比,对溶液进行扫描,得吸收光谱(见图1). 结果表明,在540nm波长处有最大吸收. 1 0.8 0.6 《 0.4 0.2 O 400500600 图1吸收光谮图 2.2AHMT浓度的影响 固定硫酸软骨素质量为lmg,改变AH— MT的浓度,使其质量在5,30mg范围,其 他步骤按1.2.2方法处理.结果表明溶液的 吸光度随AHTM浓度的增加而增大,当 AHTM的质量为15mg时,即相当于加入5g ? LAHMT溶液3.0mL时,溶液的吸光 度达到最大值,并且不再随AHTM的增大 而变化. 2.3KOH浓度的影响 ChS与AMHT的反应必须在碱性条件 下进行.固定硫酸软骨素质量为lmg,分别 加入3mL浓度为1.O,6.0mol?L-1范围的 KOH溶液,其他步骤按1.2.2方法处理. 结果表明溶液的吸光度随KOH浓度的增加 中国海洋药物杂志2005年8月第24卷第4期 Chin_rrDrugs,2005Aug,Vo1.24No.4 而增大,当加入2tool?LKOH溶液3.0mL 时,溶液的吸光度达到最大值,并且不再随 KOH溶液浓度的增大而变化. 2.4反应时间和温度的影响 固定硫酸软骨素质量为lmg,将反应液 分别置于9O,8O和7O?水浴中加热5, 60rain,每间隔5min取出一支,其他步骤按 1.2.2方法处理.结果表明溶液的吸光度值 与反应温度和时间密切相关(见图2).溶液 的吸光度值在加热温度为9O?,反应时间为 lOmin时达到最大,但加热超过20rain后吸 光度值开始减小.所以最适宜的反应温度 9O?,反应时间为lOmin. 2.5K10.浓度以及振荡时间的影响 选择不同的KIo4浓度以及振荡时间,其 他步骤按1.2.2方法处理,结果表明选用lOg ? LKIo4溶液振荡20min时,反应已完全. 2.6工作曲线 按1.2.3方法,当Imi硫酸软骨素标准 溶液浓度在0.1,1.Og?L-1范围内,溶液的 吸光度符合比耳定律,其回归方程为: A一1.632c+0.0053,相关系数r~---0.9993. 2 1.5 《1 0.5 0 02O4060 t/min 图2反应时间和温度的影响 2.7回收率试验 取1OraL比色管9支,分别加入硫酸软 骨素样品溶液0.2mL,其中2,5号比色管 中各加入1g?L-1硫酸软骨素标准溶液0.2 mL,6,8号比色管中各加入1g?L-1硫酸 软骨素标准溶液0.1mL.分别按1.2.2方 法处理测定,并计算回收率(结果见表1). 表1硫酸软骨素回收率试验结果 2.8样品测定结果 选择几种提取的软骨鱼硫酸软骨素样 品,进行平行测定,测定结果见表2. 由表2可知,本方法的精密度较高. 表2样品测定结果(=4) 参考文献: [1]MouranoPAS,PereiraMS,PavaoMSG,eta1. Structureandanticoagulantactivityoffucosyatedchon- droitinsulfatefromechinoderm[J]..,BioChem.1996,271 (39):23973. [2]TimarJ,DiczhaziC,BarthaI,eta1.Modulationof heparansulfate/chondroitinsulfateratiobyglycosamin? oglycanbiosynthesisinhibitorsaffectslivermetabolicpo? tentialoftumorcalls[刀.Int.,Cancer,1995,62(6)I755. [3]SugiuraN1wasakiS,AokiS,eta1.Suppressionof pannus—likeextenationofsynovialcellsbylipid-derivatized chondroitinsulfate;InvltroandinvivostudiesusingEs- cherchiacoli—inducedarthriticrabbits[J].Int.,Exp Pathol,1995;76(5);369. [4]JapanPharmaceuticalInformationCenter.Drugsin Japan(EthicalDrugs)[M].9thed.Tokyo:Yakugyoliho. 1985:344. [5]中华人民共和国卫生部药典委员会,中华人民共和国 卫生部药品标准[s]生化药品(第1册),1989t43. [6]宁正祥.食品成分分析手册[M].北京:中国轻工业 出版社,1998:52. [7]高华,刘坤,于兹东,等.问苯三酚分光度法测定硫酸 软骨素的研究[J].中国生化药物杂志,2000,21(5),247. (收稿日期:2005—01—08) ? 23?