无血清体外培养树突状细胞的研究

无血清体外培养树突状细胞的研究         &nb sp;      作者:张怀东～宋振岚,李伟平 【摘要】  本研究的目的是建立对外周血来源的树突状细胞(dendritic cell , DC)的无血清培养。以含胎牛血清(FCS)、人AB血清的培养液作为对照。分离健康志愿者外周血单个核细胞,PBMNC,～在不同培养液中分别加入GM-CSF,100 ng/ml,、IL-4,500 U/ml,培养6天～再分别加入钙离子载体A23187,100 ng/ml,继续培养24小时～于倒臵显微镜下观察细胞形态～流式细胞术细胞型～MTT比色法检测各组DC刺激同种异体外周血T细胞增殖的能力和DC刺激的T 细胞对K562细胞的杀伤作用。结果表明:无血清培养组培养出典型形态的DC～其表面CD14分子的表达明显减少～CD83、HLA-DR、CDw123分子的表达明显增高～具有明显的刺激同种异体T细胞增殖的能力和DC刺激的T 细胞对K562细胞的杀伤作用。无血清组与两个含血清的对照组比较～组间无显著性差异,P>0.05,。结论:无血清培养液培养的DC与含血清的培养液培养的DC相比～无显著性差异。DC无血清培养具有临床应用前景。 【关键词】  树突状细胞,无血清培养液,钙离子 载体,外周血 In Vitro  Cultivation of Dendritic Cells with Serum-free Medium AbstractThis study was aimed  to investigate the protocol  in vitro   to incubate the  dendritic cell (DC) derived from peripheral blood monocytes using serum-free medium X-VIVO 20.  Peripheral blood monocytes from healthy donors were treated with 100 ng/ml GM-CSF and 500 U/ml IL-4, respectively. After cultivation for 6 days, they were treated with 100 ng/ml calcium ionophore A23187. After cultivation for 24 hours the cellular morphology was observed under invert microscope, the surface markers were analyzed by flow cytometry,   the proliferation of allogenetic T cells  was detected by MTT colorimetry,  the specific cytotoxicity of T cells primed with DC was examined by MTT assay. The results showed that in all three groups with serum-free, fetal calf serum (FCS) and human AB serum mediums, cells displayed characteristic morphological features of DC. Simultaneously   CD14 expression  was decreased,  and  CD83, HLA-DR and CDw123 expression were increased  on these cells. In addition, DCs cultured with these methods could evidently stimulate the proliferation of allogenetic T cell. As compared with the two controls of serum containing groups, the cultured cells in the serum-free groups showed almost the same allo-stimulatory capability and cellular morphology and surface markers, and T lymphocytes primed with the culture-derived DC exhibited the similar killing activity to K562 (P>0.05). It is concluded that there is no significance in DC numbers, morphology,  epitope and ability to stimulate the proliferation of allogenetic T cells between DC induced by serum-free X-VIVO 20 medium and DC induced by serum-contained medium. DC   cultured and induced by serum-free medium is worth using in practice widely. Key wordsdendritic cell;   serum-free medium;   calcium ionophore;   peripheral blood 树突状细胞是Steinman 和Cohn 于1973 年首先报道 的,因其成熟时有树突样或伪足样突起而得名,1,。它源于 造血干细胞,广泛分布于淋巴组织和非淋巴组织中,是机体 内功能最强的抗原呈递细胞(antigen-presenting cells, APC),2,～其最大的特点是能够显著刺激初始型T细胞增殖, 是机体免疫反应的始动者。目前～多数体外培养液包含胎牛 血清、混合人(AB型)血清或自体血清,由于血清中包含个体 差异性的生长因子,异体血清又有外来抗原及危险感染侵入 的弊端,人自体血清中又含有某些抑制DC生长的因子～这将 1使DC的临床应用受到限制。本实验采用无血清培养液 X-VIVO 20则避免了上述缺点。本实验通过比较X-VIVO 20与含FCS、人AB血清的培养基对体外诱导扩增DC的影响～ 为进 一步优化无血清培养液条件～使DC疗法应用于临床 提供实验依据。 材料和方法 材料 淋巴细胞分离液,Ficoll～密度1.077,购于上海华精生物高科技有限公司～rhGM-CSF购于华北制药集团金坦生物技术开发有限公司～rhIL-4、人血白蛋白、四甲基偶氮唑盐,MMT,、钙离子载体A23187均为Sigma公司产品～人AB血清,大连市中心血站产品,～胎牛血清,民海生物有限公司产品,～无血清培养液(Cambrex公司X-VIVO 20培养液) ～FITC标记的鼠抗人CD83、HLA-DR单克隆抗体和PE标记的鼠抗人CDw123、CD14单克隆抗体(Becton Dickinson公司产品)。 分组 根据培养液的不同分为以下4组。A组:含10,人AB血清的RPMI 1640,B组:含10,胎牛血清的RPMI 1640,C组:无血清培养液X-VIVO 20,D组:含20g/L人血白蛋白的X-VIVO 20。 DC的诱导 静脉采集正常人外周血～用淋巴细胞分离液分离获得外周血单个核细胞～分别用含10,人AB血清的RPMI 1640、含10,FCS的RPMI 1640、无血清培养基X-VIVO 20,将细胞稀释至3〓106/ml～加入24孔培养板,1ml/well,中～于37?、5, CO2孵箱中培养2小时～轻轻洗出悬浮细胞～在培养板中分别加入含GM-CSF,100   ng/ml,、IL-4,500  U/ml,的4组不同培养液～37?、5,CO2孵箱中培养～3天半量换液1次。在培养的第6天～每组分别加入钙离子载体A23187,100 ng/ml,继续培养24小时～收集细胞。 DC的形态学观察 用倒臵显微镜每日观察细胞生长及形态变化情况～第3、7天作细胞计数～第7天作瑞氏—姬姆萨染色～观察摄片。 DC的表型分析 收集培养7天后的细胞～通过流式细胞术分析细胞表型——CD14、CDw123、CD83、HLA-DR。 混合淋巴细胞反应,MLR, 将正常人外周血单个核细胞接种于含10,人AB血清的RPMI 1640培液基中～在37?、5, CO2孵箱中培养2小时～取悬浮细胞为同种异体T淋巴细胞～调整细胞浓度为1〓106/ml。将收集的DC悬液～加入丝裂霉素C 25 μg/ml～37?孵育30分钟～RPMI1640培养液洗涤3次～用含10,人AB血清的RPMI 1640培养液悬浮～作为刺激细胞～分别以1〓104/well、5〓103/well、2.5〓103/well、1.25〓103/well加入96孔平底培养板～每组设2个复孔～再加入1〓105/well同种异体T淋巴细胞～终体积为200 μl/well,DC与T淋巴细胞比例分别为1?10、1?20、1?40、1?80,～另取3孔只加T淋巴细胞而不加DC～作为背景对照。37?、5, CO2孵箱中培养3天后～每孔加入MTT,5 mg/ml～20 μl/well,～再继续孵育4小时～终止培养～  40〓g离心5分钟～弃上清～每孔加入二甲基亚砜,DMSO,150 μl～振荡10分钟～用酶标仪检测波长570 nm时的吸光度,A,值～结果取平均值。计算刺激指数,SI,～  SI=A实验组/A对照组。 K562细胞冻融抗原的制备 取K562细胞悬液20 ml,以生理盐水洗涤细胞2次后 计数, 用无菌生理盐水配制细胞浓度为5〓107/ml 的细胞悬液共2 ml,放入液氮中,10分钟后迅速放入37?水浴中,待其完全融化后, 再次放入液氮中,反复冻融3次后,以360〓g离心10分钟～取上清～用微孔滤膜过滤,即为K562细胞冻融抗原～4?保存备用。 DC刺激的T细胞对K562细胞的杀伤作用 按上述方法培养DC,在培养第4天的DC中加入100  μl  K562细胞冻融抗原,。用RPMI 1640培养液调整DC、同种异体T淋巴细胞浓度分别为1〓105/ml、1〓106/ml。各取DC和T淋巴细胞100 μl～加入96孔培养板共培养～对照组以100 μl  RPMI1640培养液代替DC,37?、5% CO2培养72 小时后,加入K562细胞作为靶细胞,效?靶=10?1,设3个复孔。37?、5 % CO2 孵育48小时后弃悬液,每孔加入20 μl  MTT 溶液(5 mg/ml),37?、5% CO2 孵育4小时,终止培养, 40〓g离心5分钟～弃上清,每孔加入二甲亚砜溶液150 μl,振荡10分钟 ～在酶标仪上测定各组在570 nm 处A值(结果用3 孔均值表示),并计算其杀伤率(%)。公式为: 细胞杀伤率(%)=,(效应细胞孔的A值+单纯靶细胞孔 的A值-细胞毒实验孔的A值)/单纯靶细胞孔的A值,〓100% 统计学处理 实验重复3次～所有数据以X〒SD表示～采用样本均数的t检验～P>0.05为无统计学差异。所有统计学处理均用统计软件SPSS 12.0 for Windows 完成。 结果 活细胞的形态变化 倒臵显微镜下显示～最初接种的细胞为大小均等的小圆细胞～细胞表面光滑～无或仅有少数细胞集聚成簇的现象。第3天,可见细胞形态明显改变,体积略增大～胞体出现树突状小突起～到第7天～各组均可见形态变为大圆形或不规则形等、具有典型的树枝状突起结构的细胞～有细胞集聚成簇的现象～部分细胞脱壁悬浮。体外培养第7天,瑞氏-姬姆萨染色,各组均可见细胞体积增大～表面粗糙～核呈圆形、肾形、马蹄形、椭圆形等～偏位～嗜碱性染色, 胞质丰富,胞膜向外伸展～形成大量形状、粗细不等的毛刺状突起～细胞突起和胞浆呈嗜酸性染色～表现为典型的DC形态,图1,。 细胞计数 细胞计数结果见表1～由表1可见随着培养时间的延 长～各组DC细胞数量均增加～不同组间DC细胞数量无显著 性差异,P&g t;0.05,。Table 1. Amount of  DC induced from peripheral human blood in different culture medium,略, DC的表型分析 未处理的PBMNC 表面单核细胞的标志CD14分子呈高 表达状态,而CDw123、HLA-DR及CD83分子的表达很弱或缺 乏。培养后各组均出现成熟DC的特征性表面标志CD83分子 表达增高, HLA-DR、CDw123分子的表达也明显增高, 而CD14 分子的表达明显减少。无血清培养基组与含血清培养基组表 达相差不大～加入20   g/L人血白蛋白无明显 提高,表2,。不同组间差异无显著性,P>0.05,。Table 2. Phenotype analysis of the DC induced from peripheral human blood in different culture medium analyzed by flow cytometry,略, 各组DC刺激同种异体混合淋巴细胞反应的能力 采用不同培养液的各组DC在体外均能有效地激发同种异体外周血T细胞的增殖。D组的刺激指数比其他组略高～但不同组间差异无显著性,P>0.05,,表3,。Table 3. Stimulation index of each groups measured by MTT method ,略, DC刺激的T 细胞对K562细胞的杀伤作用 T细胞经DC刺激后对K562细胞的杀伤率～各组均较以100 μl RPMI 1640代替DC的对照组显著增高,P均<0.01,,有显著差异～说明经体外诱导的DC负载肿瘤抗原后,各组均可诱导肿瘤特异性T 细胞的产生,并杀伤K562肿瘤细胞。DC激活后的T细胞与K562细胞作用～各组之间差距不大,P均>0.05,～无显著性差异,表4,。Table 4. Killing ratio of T cells stimulated by DC of each groups  to K563 cells analyzed by MTT method (略) 讨论 目前无论化疗或造血干细胞移植治疗白血病～都存在 残留白血病细胞即微小残留病(MRD)的问题～使相当一部分患者因复发或难治而死亡。因此～如何有效清除体内MRD～有着极为重要的意义。树突状细胞,DC,可以使CTL最大限度地发挥特异性抗肿瘤效应～它能把肿瘤抗原有效地呈递给T细胞,使T细胞致敏,在肿瘤免疫治疗中起关键作用,这是一个理想的体内外消除MRD的方法。体外培养DC有3个来源:骨髓、外周血和新生儿脐血。DC 可由人骨髓、脐血和成年人外周血中的CD34+细胞和人外周血中的CD14+单核细胞产生。在临床应用方面,与脐血、骨髓来源相比,外周血CD14+单核细胞来源DC的培养方法具有取材容易、培养方便、供者适用性好、成熟阶段易于调控的优点～特别是对于肿瘤免疫的研究～外周血来源DC是目前公认获得成熟DC的较佳途径。DC的培养分为启动培养和分化培养两个阶段:GM-CSF、IL-4 应用7天诱导出非成熟DC,应用成熟诱导因子促使DC成熟。目前的促成熟因子有: ?细菌菌体或其产物,如LPS,?某些病毒或其核酸,?某些有炎症介质作用的细胞因子,如TNF-α,?氧自由基供体过氧化氢,?单核细胞条件培养液,?某些刺激信号,如A23187作为一种钙离子载体(calcium ionophore ,CI)～能与钙离子形成稳定的复合物～充当流动的Ca2+ 载体～使胞外Ca2+ 透过细胞膜～生理性或人为地提高胞浆游离Ca2+水平～导致Ca2+结合其调节蛋白-钙调蛋白～模拟某些细胞内信号转导事件～导致多基因 活化,3～4,。不成熟DC 和单核细胞经CI 处理均成为高度活化、成熟的DC～可以迅速表达成熟DC 的标志CD83～而且两者的T细胞致敏效应相当,5,。 Czerniecki等,5～6,证实～CD83分子的表达多出现于CI处理后4小时～于20小时达高峰～48小时开始下降～96小时已检测不到～CI处理后不再表达CD14。体外培养DC的培养基可以用加有胎牛血清、混合人(AB 型) 血清或自身血清的完全培养液(CM),7,～也可以使用无血清培养液(SFM)培养,8-12,。血清可以提供细胞生长所需的基本营养物质～提供贴壁和扩展因子、激素、各种生长因子、结合蛋白～对培养中的细胞提供某些保护作用。但是～使用血清也有一些明显的缺点:血清中含有一些物质对细胞会产生毒性作用～如多胺氧化酶～它能与来自高度繁殖细菌的多胺起反应,如精胺、亚精胺,形成有细胞毒作用的聚精胺,此外～补体、抗体、细菌毒素等都会影响细胞的生长～甚至造成细胞死亡,胎牛血清及人异体血清有外来抗原和危险感染,如乙肝、艾滋病等,侵入的弊端～易引起过敏反应～而且有MHC限制等,自体血清中含有抑制细胞生成的因子,13,～另外自体血清中可能存在的血管内皮衍化生长因子(VEGF) 和IL-10 (白血病细胞所分泌) 又是DC分化、成熟的抑制剂,14,～从而导致用自体血清培养DC产率低。血清的这些缺点均不利于DC 瘤苗的临床应用。因此～无血清培养基诱导的DC有着广阔的临床应用前景。本实验采用的X-VIVO 20TM无血清培养液具有成分明确、质量稳定、安全可靠的优点～在实验中应用无血清培养液X-VIVO 20培养可以克服使用血清的缺点～具有很大的优越性。本实验用无血清培养液X-VIVO 20培养出的DC与含血清的培养液培养出的DC～在细胞形态、细胞表面标志、DC刺激同种异体外周血T细胞的增殖能力、DC刺激的T 细胞对K562细胞的杀伤作用方面都没有显著性差异～故无血清培养液培养DC是完全可行的～而且能够避免许多弊端～具有广阔的临床应用前景。本实验中～在X-VIVO 20中加入20 g/L人血白蛋白～结果无明显提高～今后可再添加其它细胞因子～进一步优化无血清培养液条件。DC在净化微小残留病变、防止复发、延长患者无病生存期方面都具有良好的临床应用前景。将无血清培养液诱导的DC尽快应用于临床、进一步优化无血清培养液的组成将是今后面临的新课题。 【参考文献】   1 Steinman RM, Cohn ZA. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. J Exp Med, 1973; 137:1142-1162 2 Steinman RM. The dendritic cell system and its role in immunogenicity. An nu Rev Immunol, 1991; 9:271-296 3 Engels FH, Kreisel D, Faries MB, et al. Calcium ionophore activation of chronic myelogenous leukemia progenitor cells into dendritic cells is mediated by calcineurin phosphatase. Leuk Res, 2000; 24:795-804 4 Koski GK, Schwartz GN, Weng DE, et al. Calcium mobilization in human myeloid cells results in acquisition of individual dendritic cell-like charateristics through discrete signaling pathways. J Immunol, 1999; 163: 82-92 5 Czerniecki BJ～Carter C～Rivoltini L～et al. Calcium ionophore-treated peripheral blood monocytes and dendritic cells rapidiy display characteristics of activated dendritic cells. J Immunol, 1997; 159:3823-3837 6 Bedrosian I～Roros JG～Xu S～et al. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor～ interleukin-2～and interleukin-12 synergize with calcium ionophore to enhance dendritic cell function. J Immunother, 2000; 23:311-320 7 Robinson SP, English N, Jaju R, et al. The in vitro generation of dendritic cells from blast cells in acute leukaem ia. Br J Haematol, 1998; 103: 763-771 8 Luft T, Pang KC, Thomas E, et al. A serum-free culture model for studying the differentiation of human dendritic cells from adult CD34+ progenitor cells. Exp Hematol, 1998; 26:489-500 9 Lyakh LA, Koski GK, Telford W, et al. Bacterial lipopolysaccharide, TNF2α, and calcium ionophore under serum-free conditions promote rapid dendritic cell-like differentiation in CD14+ monocytes through distinct pathways that activate NK-κB. J Immunol, 2000; 165: 3647-3655 10 Faries MB, Bedrosian I, Xu S, et al. Calcium signaling inhibits interleukin-12 production and activates CD83+ dendritic cells that induce the cell development. Blood, 2001; 98:2489-2497 11 赵文理～邢佩霓～魏续仓等.慢性粒细胞白血病树 突状细胞的体外无血清培养及杀瘤效应. 西安交通大学学 报〃医学版～2002; 23:464-467 12 Vuillier F, Maloum K, Thomas EK, et al. Functional monocyte-derived dendritic cells can be generated in chronic lymphocytic leukaemia. Br J Haematol, 2001; 115:831-844 13 Heissig B, Pasternak G, Horner S, et al. CD14+ peripheral blood mononuclear cells from chronic myeloid leukemia and normal donors are inhibitory to short-and long-term cultured colony-forming cells. Leuk Res, 2000; 24:217-231 14 Fong L, Engleman EG. Dendritic cells in cancer immunotherapy. Annu Rev Immunol, 2000; 18:245-273.