重组大肠杆菌_谷氨酰转肽酶的PET载体的选择及乳糖诱导作用的初步研究

重组大肠杆菌_谷氨酰转肽酶的PET载体的选择及乳糖诱导作用的初步研究 γ 重组大肠杆菌 - 谷氨酰转肽酶的 PET载体的选择及乳糖诱导作用的初步研究 3胥俊峰 ,贾晓鹤 ,张正平 ,殷志敏 () 南京师范大学生命科学学院 ,江苏省分子医学生物技术重点实验室 ,江苏南京 210046 γ摘 要 :采用 PCR 技术以 E1coliK- 12 基因组 DNA 为扩增出 - 谷氨酰转肽酶基因 ,克隆至原核达载体 p ET28 ( )( )() a和 p ET32 a中 ,经测序鉴定后转化大肠杆菌 BL21 D E3 ,借助 SD S- PA GE分析方法 ,对于用乳糖诱导 ,由 T7 lac 启动子控制的重组目的产物蛋白的表达规律进行了优化研究 。在对诱导条件进行优化控制的前提下 ,分析比较了乳 γγ( ) ( ) γ糖诱导 p ET28 a/- ggt和 p ET32 a/- ggt两种重组质粒表达大肠杆菌 - 谷氨酰转肽酶蛋白的可溶性及酶活 。实 验结果表明 ,对于 T7 lac启动子控制的重组目的产物 ,乳糖作为诱导剂也可以起到很好的诱导表达效果 ,低温培养下 , γ( ) γ乳糖诱导 p ET32 a/- ggt重组质粒表达 -谷氨酰转肽酶具有更高的蛋白可溶性和酶活 。 γ( ) ( ) 关键词 :-谷氨酰转肽酶 ,克隆 , p ET28 a, p ET32 a,乳糖 ,诱导表达 γ Comp a rison exp re ssion s of- glu tam yl tran sp ep tida se in Escherich ia coli from two p ET p la sm id s u sing lac to se a s induce r 3XU Jun - fen g, J I A X ia o- he, ZHA NG Zhen g- p in g, Y I N Zh i- m in ( J iangsu P rovince Key L abo ra to ry fo r Mo lecu la r and M ed ica l B io techno logy, Co llege of L ife Sc ience, )N an jing No rm a l U n ive rsity, N an jing 210046 , Ch ina γ ( )1c o li K - 12 w a s am p lifie d b y PC R a n d from EA b s tra c t: Th e - g lu tam y l tra n s p e p tid a s e e n c o d in g g e n e g g t γa n d IP TG c o u ld in d u c e th e e xp re s s io n o f - ( ) ( ) c lo n e d in to p ET28 a a n d p ET32 a s u c c e s s fu lly1 B o th la c to s e g lu tam y l tra n s p e p tid a s e in E1c o li from p ET p la sm id s e ffic ie n tly1 A fte r a d d in g la c to s e , th e low c u ltu re tem p e ra tu re γc o u ld in c re a s e th e e xp re s s io n le ve l o f s o lu b le ta rg e t p ro te in, b u t th e s o lu b ility o f- g lu tam y l tra n s p e p tid a s e p ro te in () ( ) γ() in E1c o li BL 21 D E3 h a rb o rin g p ET32 a /- g g t w a s 3 - fo ld h ig h e r th a n th a t in E1c o li BL 21 D E3 h a rb o rin g p ET28 ( ) γ() ( ) γa /- g g t, a n d th e s p e c ific a c tiv ity o f th e e n z ym e in re c om b in a n t E1c o li BL 21 D E3 h a rb o rin g p ET32 a /- g g t w a s 116 - fo ld h ig h e r1 O ve ra ll, la c to s e c o u ld b e a p rom is in g in d u c e r in th e fu tu re la rg e s c a le p ro d u c tio n o f γre c om b in e d - g lu tam y l tra n s p e p tid a s e 1 γ( ) ( ) Ke y w o rd s: - g lu tam y l tra n s p e p tid a s e; c lo n e; p ET28 a ; p ET32 a ; la c to s e; in d u c e + ( ) 中图分类号 : TS20112 5 文 章 编 号 : 1002 - 0306 2008 01 - 0080 - 04 文献标识码 : A [ 2 ,6 ]()γ茶氨酸 L - Thean ine 是天然茶叶中的一种特殊 究的热点 。广泛存在于微生物中的 - 谷氨酰转 (γγ) 肽酶 - glu tam yl tran sp ep tida se,- GGT, EC 2131212 氨基酸 , 也是茶叶鲜爽味的主要成分 , 具有降血 压 、 γ具有转移 -谷氨酰基团的作用 ,可以将谷氨酰胺上 增强抗癌药物的疗效 、提高免疫力 、松弛神经紧张等 γ- 谷 氨 酰 基 转 移 到 乙 胺 受 体 上 , 催 化 合 成 茶 氨 [ 1 ] 药理作用 。由于直接从茶叶中提取高纯度茶氨酸[ 7 ,11 ] 的成本比较高 , 利用 微 生物 发 酵合 成一 直 是人 们 研 γ酸 。为了提高微生物中 -谷氨酰转肽酶的表达 γ量 ,本实验构建了重组质粒 p ET /- ggt, 并将其转化 收稿日期 : 2007 - 06 - 06 3 通讯联系人 ()BL 21 D E3 中 ,以无毒 、价廉的乳糖作为 至大肠杆菌 ( ) 作者简介 :胥俊峰 1980 - ,男 , 硕士研究生 , 主要从事生物化学与分 L ac启动子的诱导剂 , 来启动 T7RNA 聚 合 酶基 因和子生物学的研究 。 目的蛋白基 因的 转 录 , 从而 表达 合 成茶 氨 酸所 必需 ( ) 基金项目 :国家教育部基金 2002 SW XSBJBC22 ; 江苏省教育厅重点 γ的 - 谷氨酰转肽酶 , 初步探索了诱导表达 的条 件 。 ( ) 基金资助项目 2001 SW XTSBJB113 。 此外 ,还探讨 了 利用 乳 糖诱 导所 表 达产 生 的重 组产 [ 11 ] U ren A , B abayigit D1Co lo r p a ram e te rs of tu rk ish - typ e [ 13 ] Tucke r G A , W ood s L F J1酶在食品加工中的应用 [M ] 1 fe rm en ted sau sage du ring fe rm en ta tion and rip en ing [ J ] 1M ea t 北京 :中国轻工业出版社 , 2002: 75,781 ( ) Sc ience, 1997, 4 45: 539,5491 [ 14 ] 王永霞 ,曹东林 ,宋慧月 ,等 1不同发酵剂对发酵香肠色 ( ) 泽和质地的影响 [ J ] 1食品与机械 , 2006, 22 1: 4,61 [ 12 ] 阚健全 1 食品化学 [M ] 1 北京 : 中国农业大学出版社 , 20021121,1221 γ物 - ggt的酶活 ,利用较低的诱导温度和带有融合标 4 ?, 10000 r /m in离心 10m in,弃上清 。菌体沉淀用适 [ 12 ] ( ) 签 Trx的载体 p ET32 a ,比较分析以乳糖作为诱 量谷氨酰转肽酶裂解缓冲液重悬后 ,超声破碎菌体 ,导剂 ,重组目的产物的表达分布情况 ,旨在为今后该 4 ?, 12000 r /m in离心 15m in,分别取上清和沉淀留样 。 。 酶的生产和应用提供一定的参考依据作电泳 11213 表达产物活性的鉴定和比较 在以上优化的 条 1 材料与方法γγ,采用 - 谷氨酰转肽酶测定试剂盒测定 - 谷 氨件下 1 11 实验材料 酰转肽酶酶活以及氨基酸纸层析法检测转化生成 的( ) ( ) 质 粒 p ET28 a 、p ET32 a 、大 肠 杆 菌 E1coli ,比较两种重组菌诱导表达产物的活性 。 α() 茶氨酸 K- 12、DH 5BL 21 D E3 均为本实验室保存 ; Taq 、生物转化生成 茶 氨 酸 的 反 应 条 件 : 1mL 转 化 反 酶 连 接 a 公 司 ; 限 制 性 内 切 、T4 DNA 酶TaKaR酶μ,含 150L 超声上清 ,谷氨酰胺 20mmo l /L , 应体系中 X ho?、B am H ?、B g l ? N EB 公 司 ; 小 提 质 粒 试 剂 [ 7 ] 乙胺 150mmo l /L , pH 10 , 37 ?孵 育 24 h 。反 应 完 毕 () 盒 、胶回收试剂盒 、丙烯酰胺 A c r、甲叉双丙烯酰胺 μ后 ,点样 1L 进行氨基酸纸层析 。()( ) B is P rom ega 公 司 ; 蛋 白 胨 Tryp tone 、酵 母 粉 2 结果与分析( ) Yea st Extrac t英国 OXO ID 公司 ; 卡那霉素 、氨苄 ( ) γ 2 11 两 种 重 组 质 粒 p E T2 8 a /- g g t和 p E T3 青霉素 Am e re sco 公司 ; IPTG M e rck 公司 ; 四甲基 ( )乙二胺 TEM ED B ioR ad 公司 ; 考马斯亮兰蛋白测 2 γ定试剂盒 、- 谷氨酰转肽酶测定试剂盒 南京建成 ( ) γ a / - g g t的构建 生物工程研究所 ;其余试剂 均为国产分析纯。以 E1coli K- 12 染色体 DNA 为模板 ,用 P1、P2 作 1 12 实验方法为引物 进 行 PCR 扩 增 , 电 泳 表 明 , PCR 产 物 在 约 ( ) γ( γ) 11211 重组质粒 p ET28 a/- ggt和 p ET32 a / - 117 kbp 处 形 成 明 亮 的 条 带 扩 增 产 物 酶 切 纯 。将化 γ的构建 根据大肠杆菌 - 谷氨酰转肽酶基因序 ( ) ( ) 后 p a 和 p a 得 ,分别与 ET28 ET32 连接到重组质 ggt 列 设 计 两 条 引 物 : P1: 5 ′- CGGCA GA TCTA TG ( ) γ( ) γ粒 p ET28 a/- ggt和 p ET32 a/ - ggt,经上海生 A TAAAACCGACG - 3 ′; P2: 5 ′- A GGTCTCGA GTTA 工生物工程公司测序证明其 DNA 序列与 NCB I数据 G() 库中完全一致 结果未显示 ,重组质粒构建成功 。TACCCCGCCGTTAAA TC - 3 ′。其中 P1 含有 B g l?酶 , P2 含有 X ho?酶切位点 。以大肠杆菌 E1coli 切位点 K- 12 总 DNA 为模板 ,进行 PCR反应 ,扩增产物以常 ( ) ( ) 子 克 隆 手 段 连 入 p ET28 a 和 p ET32 a 载 规分 。 体中 11212 菌体生长及目的蛋白表达量和可溶性组分的 测定方法 菌体培养密度以 OD值表示 ; 重组产物 600 γ1 - 谷氨酰转肽酶基因 PCR 图 表达量及可溶部分比例的测定是将菌体诱导后的全 白 及 超 声 破 菌 后 上 清 和 沉 淀 分 别 留 样 , 经 扩增产物琼脂糖凝胶电泳分析菌总蛋SD S- PA GE后 ,通过江苏捷达科技发展有限公司捷达 M : DNA m a rke r; 1: PCR p roduc t 801 系 列 凝 胶 电 泳 图 像 分 析 系 统 B and scan 分 析2 12 乳糖诱导重组菌目的产物的表达及组分分布 确定 。21211 菌株最佳诱导起始生长量的确定 实验结果 1121211 菌株最佳诱导起始生长量的确定 分别在 () 如图 2 ,在重组菌不同生长阶段加入乳糖 ,至 表明 菌 生 长 至 OD值 为 012、014、016、018、110、600 重组 终浓度为 1 g /L ,均可诱导出重组产物的表达 。在重112、 1mL 加乳糖 ,至终浓度为 1 g /L , 28 ?继续诱导 5 h,取 ()组菌生长至对数中后期 OD 约为 110 时 ,添加乳糖 600 时 [ 13 114、116、118,参照文献 ]的用量 ,向培养液中添 菌液作全菌 SD S- PA GE电泳 。( ) γ是比较 理 想 的 , 此 时 含 p ET28 a /- ggt 和 p ET32 分别向处于最 1121212 乳糖诱导最佳浓度的确定 ( ) γ) (a/- ggt的重组 E1coli BL 21 D E3 都 可 获得 最大佳诱导起始生长量的菌体培养液中加入不同量的乳 糖 ,使其终浓度分别为 0105、011、015、1、5、10、20 g /L , 28 ?继 续 诱 导 5 h , 取 1mL 菌 液 作 全 菌 SD S - PA GE 电泳 。 1121213 乳糖诱导最佳时间的确定 根据上述实验 结 ,向培养液 中 加 入 1 g /L 的 乳 糖 后 , 28 ?持 续 诱 导 果 ( )图 2 菌体不同生长阶段加入乳糖 1g /L 进行诱导后 9 h。每 隔 1 h 取 1mL 菌 液 作 全 菌 SD S - PA GE 电 重组目的产物所占比例的变化情况泳 。以加 IPTG 至 终 浓 度 为 011mmo l /L 诱 导 5 h 为 γ() ( ) M :预染蛋白 m a rke r; A :含 p ET28 a/- ggt的重组菌 ; 1,9 。 对照() 表示 OD分别为 012、014、016、018、110、112、114、116、118; B :含600 1121214 不同诱导温度对表达产物分布的影响 在( ) γp ET32 a/- ggt的重组菌 ; 10,18与 1,9对应 ; 箭头所示为诱 (37 ?下 ,培养 50mL 重组菌至对数生长中期 约 OD600 导产物 。 ) 110 ,加入乳糖使其终浓度为 1 g /L ,分别在 37、28、 为 20 ?持续诱导 12 h 以 上 。诱 导 得 到 的 菌 体 培 养 液 , 20 ?诱导温度 ,均明显优于 37 ?诱导温度 。融合 于 产量 的 目 的 蛋 白 , 可 达 菌 体 总 蛋 白 的 2918 % 和 2614 % ,可见 , 当菌体密度达到较高水平时添加乳糖 标签 Trx由 109 个氨基酸组成 ,目的产物的分子量相 12 kD 左右 ,与预计的结果一致 。 有利于重组产物的生产 。应地增加了 21212 乳糖最佳诱导浓度的确定 在两种重组菌生 长 OD值为 110 时 ,加入不同浓度的乳糖 , 28 ?持 续600至 () 5 h ,实验结果显示 如图 3 , 在一定范围内 , 乳诱导 ,目的蛋白的表达量愈高 ,当乳糖终浓 度糖浓度愈高 1 g /L 时 ,两种重组菌目的蛋白的表达量均可 达达到 ,所占的比例分别为 3314 %和 3215 % ,此后 到最高 乳糖浓度再增加 ,目的蛋白的表达量并没有提高 ,这 β可能是由于乳糖从胞外转 移至 胞 内需 要 - 半 乳 糖 图 5 不同诱导温度下菌体蛋白 苷透过酶的作用 ,这是一种主动运输的过程 ,高浓度 可溶性与不溶性组分电泳图 体 质子 推 动力 的消 耗 , 从 而分 散 了 的乳糖会造成菌 γ( ) M :蛋白 m a rke r; 1、3、5:含 p ET28 a/- ggt的重组菌分别在[ 13 ] 1 g /L菌体的能量 。考虑到成本 ,乳糖的添加量为 20、28、37 ?下诱导的菌体蛋白可溶性组分 ; 2、4、6:与之分别 为宜 。γ( ) 对应的不溶性组 分 ; 7、9、11: 含 p ET32 a /- ggt的重组菌 分别 在 20、28、37 ?下 诱 导 的 菌 体 蛋 白 可 溶 性 组 分 ; 8、10、 12:与之分别对应的不溶性组分 ;箭头所示为诱导产物 。 2 13 表达产物活性的鉴定和比较 根据以上优化 条件 的 实验 结 果 , 分 别 检 测 两 种 γ重组菌表达的 - 谷氨酰转肽酶活性 , 如图 6 所 示 , 和乳糖诱导的目的蛋白均有很高的催化活性 , IPTG 图 3 乳糖诱导浓度对目的产物表达的影响 ( ) γγ含 p ET32 a/- ggt重组菌诱导产生的 - 谷氨酰转 γ() ( ) M :蛋白 m a rke r; A :含 p ET32 a/- ggt的重组菌 ; 1,7分 ( )( ) γ40U / g约为含 p ET28 a/- ggt重组菌 肽酶比酶活 ( ) 别为 0105、011、015、1、5、10、20g /L 的 乳 糖 诱 导 ; B : 含 ( ) γ诱导产生的 116 倍 ,这是由于含 p ET32 a /- ggt的 γ( ) p ET28 a/- ggt的重组菌 ; 8,14 与之对应 ; 箭头所示为诱 温诱 导 后 , 产生 更高 的 具有 生 物活 性的 重组菌经低导产物 。 产物 , 而 以 包涵 体形 式 存在 的 目的 产物 可溶性目的 21213 乳糖诱导最佳时间的确定 在菌体达到最佳 生 则没有催化活性 ,与 21214 实验结果一致 。 ( ) OD为 110 时 , 添 加 终 浓 度 为 1 g /L 乳 糖 , 600 长量 28 ?持续诱导 9 h,在 1,6 h间两种重组菌目的蛋白的 表达量均随着时间的延长而增加 ,从第 6 h 开始则趋 。实验结果表明目的蛋白诱导后最佳收获时 于稳定 6 h。 间为 ()图 6 表达产物的活性 比酶活柱状图 ;纸层析法 ( ) 1:谷氨酰 胺 ; M: 茶 氨 酸 标 准 品 ; 2: IPTG 诱 导 含 p ET28 a / γγ- ggt 的 重组菌表达 - 谷氨酰转肽酶催化活性 ; 3: 乳糖诱导含 ( ) γγp ET32 a/- ggt的重组菌表达 - 谷氨酰转肽酶催化活性 ; 4: γ( ) γ乳糖诱导含 p ET28 a/- ggt的重组菌表达 - 谷氨酰转肽酶 4 乳糖诱导后目的产物所占比例 图 催化活性 。 随诱导时间延长的变化情况3 讨论 () ( ) γA :含 p ET28 a/- ggt的重组菌 ; 1: 未诱导 ; 2: IPTG诱导 ; γ - 谷氨酰转肽酶是生物转化法生产茶氨酸广泛M :蛋白 m a rke r; 3,11分别为乳糖诱导 1、2、3、4、5、6、7、8、9 h; [ 7 ] 采用的一种催化合成酶 ,作为生物体内谷胱甘肽代 () γ( ) B :含 p ET32 a /- ggt的 重 组 菌 ; 12: 未 诱 导 ; 13: IPTG诱 [ 8 ] γ谢途径中的一个关键酶 ,它不仅可以催化 - 谷氨 导 ; 14,22与 3,11对应 ;箭头所示为诱导产物 。 γ 酰基化合物的水解反应生成 - 谷氨酸 ,还可以催化21214 不同诱导温度对表达产物分布的影响 在两 ()γγ 约为 110 时 ,添 OD- 谷氨酰基化合物上的 - 谷氨酰基团转移至氨基600 种重组菌生长至对数生长中期 [ 9 ] 1 g /L , 12 h 乳糖 37、28、20?持续诱导 以 加终浓度为 γ酸 、多肽 、HO 等受体上 ,利用这一性质 , - 谷氨酰 2 上 5 ,超声破菌后的结果如图 所示 ,在乳糖诱导条件 [ 14 ] 转肽酶在药物合成设计 , 氨基 酸 衍生 物 合成 方面 γ下 ,较低的诱导温度可减少重组 - GGT蛋白包涵体 γ也有着重要的应用 。本实验将大肠杆菌 K- 12 的 - 的形成 ,增加了表达产物中可溶性蛋白含量 ,且载体 ( ) (基因转入至原核表达载体 p ET, 构建了重组质粒 p ET32 a本身带有一段融合标签 Trx?Tag N - 端 硫ggt) γ,与 - GGT融合表达后 ,也明显提 高γ氧还蛋白序列 p ET /- ggt。在 p ET 系 统 中 , IPTG 作 为 一 种 十 分 有 , 28 ?诱导温度 稍 优 了融合蛋白的可溶部分比例 效的乳糖操纵子的诱导剂 ,加入少量的 IPTG就能对 L acUV 5 和 T7L ac强启动子产生持久的诱导作用 ,从 而高效的表达目的重组蛋白 ,但由于 IPTG对人体有 [ 1 ] Kam a th AB , W ang L , D a s H , e t a l1 A n tigen s in tea- beve rage p rim e hum an V gamm a 2V de lta 2 T ce lls in vitro and in vivo fo r 潜在的毒性且价 格 昂贵 , 一 些 国家 已规 定 在人 用 重 m emo ry and nonm emo ry an tibac te ria l cytok ine re spon se s [ J ] 1 组产物的生产工艺中不能使用 IPTG,故本实验用无 [ 13 ] 毒 L ac 、价廉的乳糖 作为 启动子的诱导剂 ,来启动( ) P roc N a tl A cad Sc i U SA , 2003 , 100 10: 6009,60141 γ目的蛋白基因的 转 录 , 从而 表 达合 成茶 氨 酸所 必 需 [ 2 ] Tach ik i T, Yam ada T, e t a l1- Glu tam yl tran sfe r reac tion by - 谷氨酰转肽酶 。 glu tam ina se from p seudomona s n itro reducen s IFO12694 and the ir γ的 () 乳糖 L ac操纵子是目前为止 研究 的 最为 深 入 γ app lica tion fo r the syn the se s of thean ine and - glu tam yl 操 纵子 , 利 用 其调 控机 理 设计 的 表 ( ) m e thylam ine [ J ] 1B io tech B iochem , 1998, 62 7: 1279,12831 的大肠杆菌基因 达系统和载体系统已得到广泛应用 。本实验研究结 [ 3 ] Yam amo to S, W akayam a M , Tach ik i T1C lon ing and 果表明 ,在两种重组 p ET载体系统中 ,当重组菌生长exp re ssion of P seudomona s tae tro len s Y - 30 gene encod ing ( ) 至对数生 长 中 后 期 OD约 为 110 , 加 入 终 浓 度 为glu tam ine syn the ta se: an enzym e ava ilab le fo r thean ine p roduc tion 600 1 g /L 的乳糖诱 导 6 h 后 , 均 可 收 获 最 大 量 的 目 的 产 by coup led fe rm en ta tion w ith ene rgy tran sfe r [ J ] 1B io sc i 物 33 % ,约占到菌体总蛋白的 ,且随着时间的延长 , ( ) B io techno l B iochem , 2006 , 70 2 : 500,5071 目的蛋白没有被降解 。 [ 4 ] Yam amo to S, U ch im u ra K, W akayam a M , e t a l1 Pu rifica tion γ 在大肠杆菌中 ,- 谷氨酰转肽酶在自身信号肽and cha rac te riza tion of glu tam ine syn the ta se of P seudomona s [ 15 ] 发 作 用 的介导下被转运至周质空间中挥其生理,tae tro len s Y- 30: an enzym e u sab le fo r p roduc tion of thean ine by 因此它的翻译后的加工过程 ,如信号肽的切除 、大小 coup ling w ith the a lcoho lic fe rm en ta tion system of bake r ’s yea st ( ) [ J ] 1B io sc i B io techno l B iochem , 2004 , 68 9 : 1888,18971 亚基的形成 、蛋白质的折叠等均发生在周质空间中 。 当 GGT前体转运到达周质空间的效率偏低时 ,大部 [ 5 ] 李平 ,宛晓春 ,张正竹 1生物合成茶氨酸的研究进展及构 建基因工程菌合成茶氨酸的可行性探讨 [ J ] 1 食品与发酵工 分将以未切去信号肽的前体分子形式聚集在胞内或 结合在内膜内侧形成包涵体 ,酶的分离十分困难 ,可( ) 业 , 2004 , 30 1 : 71,751 溶部分比例及活性都很低 。我们曾经用变性复性法 γ[ 6 ] 王娜 ,张洁 , 沈 微 , 唐雪明 , 诸 葛 健 1- 谷 氨 酰 基 转 肽 酶 中 回收 重组 蛋 白 , 但其 生 物活 性很 低 。改 ( )从包涵体GGT基因工程菌的构建及其发酵条件的初步研究 [ J ] 1 中 ( ) 变大肠杆菌的生长条件被认为是解决这一问题的有 国生物工程杂志 , 2006, 26 11 : 48,531 : 在乳糖诱导条件下 ,较低 [ 7 ] Suzuk i H , Izuka S, M iyakawa N , Kum aga i H1Enzym e 效手段之一 。本实验发现 γ- 谷氨酰转肽酶包涵体的形 的诱导温度可减少重组 p roduc tion of thean ine, an um am i componen t of tea, from 成 。这可能是在低温下 ,蛋白质的合成速度减慢 ,有 γ w ith bac te ria l - Glu tam yl glu tam ine and e thylam ine 蛋 白正 确 折叠 , 从 而减 少 包涵 体 的 利于合成的重组tran sp ep tida se [ J ] 1Enzym e and M ic rob ia l Techno logy, 2002, 31: [ 12 ] 形成 ,增加表达产物中有活性的可溶性蛋白含量 。 884,8891 原核表达载体的正确选择也是影响目的蛋白可溶性 [ 8 ] M e iste r A , A nde rson M E1Glu ta th ione [ J ] 1A nnu R ev ( ) ( ) 的因素之一 , 由于载 体 p ET32 a 比 p ET28 a 带 有 B iochem , 1983, 52: 711,7601( ) 一段 N - 端 硫 氧 还 蛋 白 Trx ? Tag 序 列 , 原 来 在[ 9 ] Ta te S S, M e iste r A1Gamm a - glu tam yl tran sp ep tida se: E1co li中以不溶形式存在的蛋白当与 N - 端硫氧还蛋 ca ta lytic, struc tu ra l and func tion a sp ec ts [ J ] 1Mo l Ce ll B iochem , )( 白 Trx ? Tag序列融合后 , 往往也可以增加目 的 蛋 白 1981 , 39: 357,3681,我们将其与不含有 Trx? Tag溶解性 。利用这一特性 γ [ 10 ] N akayam a R , Kum aga i H , Toch iku ra T1 - Glu tam yl )( 序列的载体 p ET28 a作了比较 ,结果发现 ,相同 条件tran sp ep tida se from bac te ria [ J ] 1Su lfu r Am ino A c id s, 1984 , 7: ( ) γ,以乳糖作为诱导剂 , 含 p ET32 a /- ggt的 重组下 427,4351(γ 的 - 谷 氨 酰 转 肽 酶 可 溶 部 分 比 例 约 菌表达[ 11 ] Suzuk i H , Kum aga i H , Ech igo T, e t a l1Mo lecu la r c lon ing of )( ) γ1218 % 明显 高于 含 p ET28 a /- ggt的 重 组 菌 , 可 γ E sche rich ia co li k - 12 ggt and rap id iso la tion of - glu tam yl () 约 40U / g也有了相应地提升 。由 溶部分的比酶活 tran sp ep tida se [ J ] 1 B iochem ica l and b iop hysica l re sea rch ( )p ET32 a表达的目的蛋白 N - 端融合了 于重组载体 ( ) comm un ica tion s, 1988, 150 1: 33,381 一段含有 109 个氨基酸长度的硫氧还蛋白 , 这 段 外 [ 12 ] Novagen1 p ET System M anua l[M ] 111 th Ed120061 源蛋白是否会对酶活产生影响 ; 另外 ,能否找到其它[ 13 ] 侯松旺 ,李小洁 ,马辉文 1受乳糖启动子控制的基因表 新型载体更进一 步 增加 该 酶的 可溶 性 , 或 者构 建 具 () 达过程的 优 化 [ J ] 1 武 汉 大 学 学 报 自 然 科 学 版 , 1998 , 44 GGT基因以更 有强启动子和强信号肽的载体来表达 ( ) 4: 513,5161 ,我们将作进一步的研究 。 大程度上提高该酶的酶活 [ 14 ] A lek sand ra M isicka, Iwona M a szcyn ska, A nd rze j W ,乳糖诱导表达系统是一种安全 、低 成本实验结果证明 L ip kow sk i, e t a l1 Syn the sis and b io logica l p rop e rtie s of gamm a - ,选用合适的载体和生长条 的生产重组蛋白方式 ( ) glu tam yl- demo rp h in, a p rod rug[ J ] 1L ife Sc ience, 1996, 58 11 : γ件会明显提高目的蛋白可溶性及活性 。本实验为 - 905,9111 谷氨酰 转 肽 酶 的 扩 大 规 模 生 产 提 供 了 一 定 的 参 考 γ [ 15 ] Suzuk i H , Kum aga i H , Toch iku ra T1 - Glu tam yl 。 依据tran sp ep tida se from E sche rich ia co li K - 12: Fo rm a tion and ( ) Loca tion [ J ] 1Jou rna l of B ac te rio logy, 1996 , 168 3 : 1332,13351参考文献 :