小鼠睾丸巨细胞病毒感染对精子顶体反应与膜功能的影响

小鼠睾丸巨细胞病毒感染对精子顶体反应与膜功能的影响 小鼠睾丸巨细胞病毒感染对精子顶体反应 与膜功能的影响 ? l714?2005年6月29日第85卷第24期NailMedJChina.June29,2005,Vol85,No.24 小鼠睾丸巨细胞病毒感染对精子顶体 反应与膜功能的影响 熊锦文熊承良田永红李双徐惠敏胡廉丁晓芳 【摘要1目的探讨小鼠睾丸巨细胞病毒(MCMV)感染对附睾尾部精子顶体反应与膜功能的 影响.方法随机选择无MCMV感染史的BALB/c雄性小鼠48只作为实验组,睾丸直接接种 MCMV,分别于感染后第1…246,9,14天处死小鼠,用地高辛标记的MCMVM83mRNA寡核苷酸探 针对睾丸组织进行原位杂交,检测睾丸MCMV感染情况,同时取附睾尾部成熟精子进行精子顶体反 应与精子膜低渗肿胀功能检测.另设平行对照组雄性小鼠30只(同法随机选择),睾丸接种不含 MCMV的细胞培养液,其他处理方法同实验组.结果实验组48只雄性小鼠睾丸组织间质及(或) 生精细胞中均出现原位杂交阳性信号.实验组精子顶体反应与膜功能在接种病毒后的第2天,第4 天,精子顶体反应率(58%4-9%,56%4-9%)低于平行对照组(71%?6%,70%4-7%)(P均< 0.05),精子膜尾部低渗肿胀率(48%4-9%,38%4-8%)低于平行对照组(60%4-7%,50%4-4%)(P 均<0.05).结论小鼠睾丸MCMV感染模型成功建立.小鼠睾丸MCMV急性感染可导致精子顶体 反应与膜功能的显着下降. 【关键词】鼠巨细胞病毒属;睾丸;精子 Effectsoftestisroutinecytomegalovirusinfectiononspermacrosomereactionandspermaticfunction ofmembraneinmiceXIONGJin-wen,XIONGCheng—liang,TIANy0一,LIShuang, xUHui— min.HUl&m.DlNGXiao-fang.CenterofReproductiveofMedicine.ResearchInstituteofFamily Planning,To,~giiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030,China Correspondingauthor:XIONGCheng—liang,Email:clxiong@mails.tjmu.edu.en 【Abstract】 ObjectiveToexploretheeffectsoftestismurlnecytomegalovirus(MCMV)infectionon maturespermacrosomereactionandspermaticfunctionofmembraneinmice.MethodsBALB/cmice withoutMCMVinfectionwererandomlydevidedintotwogroups:anexperimentalgroup(48mice)anda controlgroup(30mice).rI1lemiceinthecontrolgroupweretreatedbyinoculationDMEMwithoutMCMV intotestis,whilethoseintheexperimentalonewereelirecflyinoculatedwithMCMVintotestis.Miceintwo groupsweresacrificedseparatelyat1,2,4,6,9,14dpostinoculation(D1,2,4,6,9,14PI),andthe MCMVM83mRNAgenewasdetectedinsidethetestesbyinsituhybridization(ISH)withoneepisode MCMVlate— mRNAprobelabeledwitlldigoxin.meanwhileacrosomereactionandthefunctionofmembrane ofmaturespermsintheepididymistailswasmeasured.ResultsThepositivesignalofISHofMCMVwas mainlyfoundedinthetwokindsoftesticularceUs(spermatogeniccellsandLeydigceUs)intheexperimental group.Comparedwitllthatofthecontrolgroup.thespermacrosomereactionintheexperimentalgroupwas decreasedsignificantlybytheratefrom(714-6)%,(704-7)%to(584-9)%,(564-9)%(P<0.05) separatelyonD2PIandD4PI.Andthespermmembranehypo— osmoticsweUingwasdecreasedsignificantly bytheratefrom(604-7)%,(504-4)%to(484-9)%,(384-8)%(P<0.05)separatelyalsoonD2PI andD4PI.ConclusionThemodelofCMVinfectioninmurinetestiswasestablished.Thespermacrosome reactionandfunctionofmembraneinmicemightbedescentedsignificantlybyMCMVinfectionintheearly period,whichshowsthatMCMVinfectionmightinfluentthespermsfunction. Muromegalovirus;Testis;Spermatozoa 【Keywords】 男性生殖系统微生物感染是影响精子质量的重 作者单位:430030武汉,华中科技大学同济医学院生育研 究所生殖医学中心 通讯作者:熊承良,Email:clxiong@mails.tjmu.edu.cn . 论着 要原因之一,可直接或间接地导致男性生育障 碍….人巨细胞病毒(humancytomegalovirus, HCMV)属于13疱疹病毒亚科,在人群中普遍存在, 临床上常呈潜伏状态,活动感染时可导致全身各大 器官不同程度的各种损害[.为研究巨细胞病毒 2005年6月29日第85卷第24期NatlMedJChina,June29,2005,Vol85一No.24 (CMV)感染对精子质量的影响,便于今后深入探讨 CMV感染机制及其与男性生殖系统疾病的相关性, 本文将小鼠巨细胞病毒(murinecytomegalovirus, MCMV)直接接种小鼠睾丸,造成小鼠睾丸组织的人 工急性感染,并检测MCMV感染对小鼠精子顶体反 应与膜功能的影响. 与方法 一 ,材料 1.细胞和病毒:小鼠胚肺成纤维细胞(murine embryolungfibroblast,MEL)NIH/31r3株购自中国 典型培养物保藏中心(Chinacenterfortypeculture collection,CCTCC).MCMVSmith株购自美国典型 培养物保藏中心(Americantypeculturecollection, ATCC).细胞与病毒在我所细胞培养室按常规方法 培养传代,病毒滴度为10TCID50/0.1ml. 2.实验动物:清洁级BALB/c雄性小鼠,8— 10周龄,已性成熟,体重20g?4g,购自湖北省武汉 生物制品研究所. 3.主要试剂:MCMV—IgG,IgM抗体酶联免疫吸 附试验(ELISA)试剂盒购自珠海海泰生物制药有限 公司.敏感性加强型原位杂交检测试剂盒 (MK1030),二氨基联苯胺(DAB)试剂盒均购于武 汉博士德生物工程公司.MCMVM83基因(相当于 HCMVpp65基因)mRNA序列为5cGAGAccTccAT GTCCTIEATGC3,由北京奥科生物工程有限公司 合成探针并予5末端标记地高辛. 二,方法 1.小鼠睾丸MCMV感染模型的建立: (1)动物处理:实验前鼠尾采血0.1ml/只,取 血清进行ELISA检测,操作严格按说明进行,选 择MCMV—IgM阴性小鼠78只用于实验.随机选择 人选小鼠48只设为实验组,微量进样针穿透白膜, 于两侧睾丸分别接种MCMV悬液20—25l [(3.4—4.25)×10一TCID50];另选平行对照组雄 鼠30只,每侧睾丸直接接种不含MCMV的细胞培 养液20—25J.观察各组小鼠的体重,被毛,精 神,食量等变化,并于接种后的第1,2,4,6,9,14天 分别处死各组小鼠(实验组每次8只,平行对照组 每次5只),无菌采集双侧睾丸组织,快速置4%多 聚甲醛溶液固定6—8h,石蜡包埋,切片. (2)MCMV感染检测:采用单相寡核苷酸探针 mRNA原位杂交方法检测睾丸组织MCMV感染情 况.技术操作严格按说明书进行.其中睾丸组织行 胃蛋白酶消化5min;地高辛标记的寡核苷酸探针浓 度为2g/ml.每次实验均设阴性对照,即对照标 本用不含标记探针的杂交液代替杂交液.光镜下分 析结果,细胞内出现棕黄色颗粒者判断为杂交信号 阳性.小鼠双侧睾丸标本有一侧阳性结果出现即判 定为睾丸MCMV感染阳性. 2.精子顶体反应功能检测:处死小鼠后,取两 侧附睾尾部组织0.02g,置2.0mlCa"浓度为 1.3mmol/LL4的TYH培养液中剪碎,37~C,CO 孵箱温育10min,使精子游离,加TYH液至4.0ml, 调整精子浓度至(3—6)×10个/ml,待检.取处 理过的精液1ml,置37~C,CO孵箱温育5h,使其 获能;1000r/min离心3min,弃上清,沉淀以5%甲 醛溶液固定10rain,混匀,吸取50l精子悬液滴于 载玻片上涂片晾干,用0.22%考马斯亮兰G250染 液浸染至少30min,双蒸水冲洗,晾干,400倍显 微镜下完整视野计数至少200个精子.精子顶体反 应率计算参照文献[7,8]. 3.精子膜低渗肿胀实验:取精子浓度为(3—6)× 10/卜/ml的待检精液300l,加入0.5ml低渗肿 胀液…,混匀,37~C,CO孵箱温育30min,滴片,400 倍显微镜下完整视野计数至少200个精子,其中精 子尾部卷曲者(尾部膜肿胀精子)计为阳性结果. 精子尾部膜肿胀率:尾部膜肿胀的精子数/总检测 精子数. 4.数据处理:所获实验数据均用?s表示,两 组平行对照组间均值比较用t检验,采用SPSS13.0 软件包进行处理. 结果 小鼠感染征象:实验组87.5%(42/48)小鼠 1. 于接种病毒后第2天即出现被毛耸立,精神烦燥,嗜 斗等征象,其余12.5%(6/48)小鼠未出现以上征 象;另外,实验组小鼠在接种病毒后2—6d出现了 食量减少,体重下降等状况,随后饮食,体重缓慢恢 复.而平行对照组小鼠均无上述现象出现.两组无 感染致死小鼠. 2.原位杂交结果:实验组睾丸间质细胞和(或) 各级生精细胞胞浆中可见棕黄色颗粒状阳性着色. 组织中血管各层,生精小管管周肌样细胞及睾丸包 膜等均有阳性杂交信号出现,提示MCMV可感染睾 丸组织内各种细胞,主要是睾丸间质细胞.从病毒 感染的第2天起,MCMVM83mRNA阳性表达开始 在睾丸生精细胞中出现,而此期睾丸生精细胞也开 盘堕_轩』_塑盟第:?—Chi 始山现同程度的病理损害;在感染后第4天,第6 天的睾丸组织中MCMVM83mRNA阳件表达信号 逐渐增强.而问期的睾丸组织病变相应加蓖,笙第9 天阳性表达投病变程度达到高峰(图1,6)这提 示.MCMVM83mP~NA在不同的感染时段,不同程 度病理损害的组织中有不同的表达.实验皇I【48M 小鼠双侧睾九取一侧检测均有m性杂交结果, MCMV活动感染率为100%,而对照自i睾丸切片及 原忙杂交阴性对照均无杂交m性信号出现 3小鼠精于顶体反应与膜功能改变:凼实验组 小鼠窜丸均感染MCMV.救所有杯本精于功能检测 结果均刮为统计范围小鼠睾丸在感染MCMV后 第2天第4天时,精子顶体反应率及尾部膜肿胀率 与平行对照组相比.均显着下降,差异具有统计学意 义(在I,2) 表l哺组小鼠睾九MCMV感染后不同时可的 成熟精顶体反应率f%) 组别鼠散1d 丑=验组873?9 照577?4 麒纽较,…2902,P=0014.t=2888.P= 00I5 表2两组小鼠睾丸MCMV感染后不同时间的 成熟精于尾肯I5膜肿胀串(%) 别Id 38?8空验组842?7 :纽较,…2654.P=0022一3149P=n?9 1,鼠睾丸MCMV感染模型的建谨投方法在 f究中的意义:目前探对人类疾病的发病机制及防 冶的研究主要建立在整体动物模型的实验基础 ;成功的动物模型必须遵守卡爿似,可控经济,易行 等原则,使人类疾病能在动物实验研究中得以良好 的再现由于MCMV与HCMV具有80%的同源 基因结构以及感染普遍,致病低,感染受机体免疫 功能的影响等类似的致病过程,许多学者应用 MCMV感染宾验动物模型研究HCMV感染".因 CMV感染对精子功能影响厦感染与男性生殖疾病 的相关性研究国内外报道较少.意见不一,所 应用动物模型进行此类课题的研究十分必要.本 文选用免疫力较低的雄性BALB/c小鼠,将种属特 异性MCMV直接接种小鼠睾丸,于感染的不同连续 州段榆测其附睾尾部成熟精子顶体反应与膜功能的 - .o 目lz组睾组织生精胞?庸细胞排.MCMVM83mHAg性表达啄侍杂交x40目2接MCMV后 第1.小嗥闻质细胞生精小世曾月肌样监血管MCMVM83mRNA日l性表原恃杂交~40目3接种McMV第 2,4.小睾丸生精小营基膜坏死.管月肌样细晦性损害生精胞内MCM~M83mJ~NA性表达开始出现庳位杂x100 目4接MCMV第6.小鼠睾丸病理损眚加重.?精胞排列豪乱,问质淋B细胞增?,MCMVM83mRNA性表选范围扩 原f杂xl岫目5接种MCMv9天,小丸生情小骨盐问峨胞中MCMVMg3n~dqA性丧然程度谜高蟑原 位杂交x100砸6接补MCMv第14*,小睾MCMVM83mRNA睾丸组中性表达运新碱位杂×100 2005年6月29日第85卷第24期NatlMedJChina,June29,20o,,丝 改变.模型的建立将为今后系统研究MCMV感染 对雄性生殖功能的影响及感染机制打下坚实的基 础.另外,因CMV晚期基因转录产物mRNA的出 现是病毒复制完成的标志,为病毒活动性感染的最 可靠指标,所以本研究选用MCMV晚期基因 M83(HCMVUL83homolog)中的一段序列了寡 核苷酸探针,采用地高辛标记,针对小鼠睾丸组织, 从病毒基因转录水平进行原位杂交检测,不仅准确, 灵敏地检测出睾丸MCMVM83mRNA的存在,快速 判断出睾丸组织MCMV活动感染率状况,还对病毒 在睾丸组织中的定位及其易感细胞进行了初步探 讨,为雄性生殖器官MCMV感染模型研究提供了新 的实验手段. 2.小鼠睾丸MCMV急性感染对精子功能的影 响:精子在体内只有经过获能,顶体反应,才能穿人 卵细胞与其融合,完成受精;同时,精子膜的功能与 精子获能,顶体反应及精卵融合密切相关.因此,检 测精子的顶体反应功能及精子膜功能的完整性可准 确地反映精子功能,并预测精子的潜在受精能力. 1999年,WHO规定可将精子顶体反应率,精子膜功 能完整性作为评价精子受精功能的重要指标. 本实验在建立小鼠睾丸MCMV感染模型的同时,检 测附睾尾部成熟精子顶体反应率及膜功能的完整性 (精子膜尾部低渗肿胀率),以探讨MCMV急性感染 对精子功能的影响.研究发现,在睾丸MCMV感染 的不同时段,对照组各时期及实验组各时期小鼠精 子的顶体反应率与尾部膜肿胀率的波动范围较大, 并未呈现出一规律曲线,但两组率在平行对照时段 的波动趋势较为一致,因此考虑实验中组间的数据 波动可能是因为不同笼的小鼠存在的一些个体差异 所致.另外,MCMV感染后第2天,第4天时,精子 顶体反应率,精子膜尾部低渗肿胀率均低于平行对 照组,而随着感染时间的延长,精子的顶体反应率及 精子膜尾部低渗肿胀率不受影响.这提示,MCMV 急性感染可能导致精子功能的低下,CMV为引起男 性生育障碍的可能病原微生物之一;至于此后精子 顶体反应,膜功能的恢复及MCMV急性感染导致精 子功能下降的机制研究,有待于进一步深入.此外, 从原位杂交结果分析,MCMVM83mRNA在不同的 感染时段,不同程度病理损害的组织中有不同的表 达,说明MCMVmRNA在感染部位表达水平的高低 与受染细胞病变的程度及精子功能可能具有相关 性;而关于睾丸组织对MCMVmRNA负荷量的多少 与精子功能的相关性研究仍有待今后研究的进一步 深入和完善. 参考文献 lXiongCL.WuMZ,LiuJH,eds.Humanspermatozoa.Wuhan: HuboiScieneeandTechnologyPress.2002.198-199. 熊承良,吴明章,刘继红,主编.人类精子学.武汉:湖北科学 技术出版社,2002.198-199. 2Xiong删.ChenSH,WenLz,eta1.Valueofthenest-polymerase chainreactiondetectingintheGPCMVcongenitalinfectionofa guineapigmode1.ChinJBirthHealthHeredity,2004,12:18-20. 熊锦文,陈素华,闻良珍,等.套式聚合酶链反应在豚鼠巨细胞 病毒官内感染模型中的应用价值.中国优生与遗传学杂志, 2004.12:l8.2O. 3TebourbiL.CourtotAM,DuehateanR.eta1.Experimental inoculationofmalemicewithmurineeytomegalovirusandeffecton offspring.HumanReproduction,2001,16:2041-2049. 4T,LiJ.Effects0fcalciumionconcentrationonspontaneous aCl'osonlereaction0fratspermatozoa.JClinRes.2003.加:581.585. 曾涛,李洁.钙离子浓度对大鼠精子自发性顶体反应的影响. 医学临床研究,2003,20:581-585. 5Ch0iYH.Landim-AlvarengaFL,SeidelGEJr,e,a1.Effectof eapacitationofstallionspermwithpelyvinylaleoholorbovineseIum albuminonpenetrationofbovinezona.freeorpartiallygona.remov0d equineoocytes.JAniSei,2003,81:2082-2087. 6ZhangXC,XiaoH,ZhangL,eta1.Effectoffenvalemteonsperm acrosomereactioninmiceanditsmechanism.ChinJPhannaco Toxieo,2002,16:21. 张习春,肖杭,张莉,等.氰戊菊酯对小鼠精子顶体反应影响及 作用机理.中国药理学与毒理学杂志,2002,16:21. 7LuHY,LuJC,HuYA,eta1.Detectionofhumansperm morphologyandacrosomereactionwithcoon1毒Lssiebrilliantblue staining.NatlJAndro1.2002.8:204-206. 陆海一,陆金春,胡毓安,等.考马斯亮蓝染色法检测人精子形 态和顶体反应.中华男科学杂志,2002,8:204-206. 8SatoY,SonJH,MeiselS.The?l0Ilsesp(~lngtycinereceptor/ehlaride channel:cellularlocalizationandinvolvementintheacn~6Ol'lletitivation initiatedbyglycine.JAn&ol.2OO0,21:99-106. 9ShiXY,ed.Modenmedicalexperimentsinanimals.Beijing: PeoplesArmedHospitalPublishingHouse.2oo0.335-339. 施新猷,主编.现代医学实验动物学.北京:人民军医出版社, 2oo0.335-339. 10RappM.MessefleM.BuhlerB.eta1.Identmcationoftheroutine eytomegalovirusglyeoproteinBgeneanditsexpressionby recombinantvaciniavirus.JVirol.1992.66:4399-4406. 11PallierC,TebourbiL,Chopineau?ProustS.eta1.Herpesvirus, eytomegalovirus.humanspermandassistedfertilization.Hum Reprod.2002.17:1281.1287. 12KapranosN,PetralconE,AnastasiadouC.eta1.Detectionofherps simplexvirus,eytomegalovirus,andepstein-barrvirusinthesemen ofmenattendingallinfertilityclinic.FertilSteril.2003,79:1566? l570. 13MegowanMP.HayesK.KovacsGT.eta1.Prevalenceof cytomegalovirusandherpessimplexvirusinhumansemen.IntJ Androl,1983,6:33l-336. 14LiuKZ,ChenZ,eds.Humanviraldiseases.Beijing:People,s MedicalPublishingHouse.2002.427-428. 刘克洲,陈智,主编.人类病毒性疾病.北京:人民卫生出版 社.2002.427-428. 15WorldHealthOrganization.Laboratorymanualfortheexaminationof humansemenandspermcervicalmucusinteraction.Beijing:Beijing SciencePublishingHouse.1999.17-42. (收稿日期:2004.11-29) (本文编辑:吕小东)