免疫胶体金实验报告

免疫胶体金#实验# 免疫胶体金技术常见影响因素分析 免疫胶体金技术常见影响因素分析 自胶体金作为特殊标记物进行研究以来,建立的各种免疫胶体金技术以其特异性强、灵敏度高、操作简捷等特点,在医学、农牧业、环境及食品检测等领域被广泛应用。免疫胶体金技术的反应过程是一个由金颗粒、抗原与抗体动态结合的反应过程,在这个过程中每个环节的好坏都直接影响试验的成败。而试验过程中每个环节又受到很多因素的影响和制约,下面将影响免疫胶体金技术的因素作一分析,为成功制备胶体金检测产品提供参考。 1耗材的选择 1.1不同型号膜的筛选。硝酸纤维素膜的型号在试验中至关重要,作为反应载体影响到整个试验的成败。不同的生产厂家生产硝酸纤维素膜时使用的聚合物和表面活性剂的来源、类型和数量均大不 相同,对生产出的膜的性能产生较大影响——膜的孔径和分布结构不同。膜孔径减小,膜的实际可用表面积递增,膜结合蛋白的量也递增;膜孔径越小,层析速度也越慢,金标复合物通过T线的时间就越长,反应也就越充分;因此膜孔径越小灵敏度越高,但是同时也减慢了跑板速度,增加了非特异性结合的机会,也就是假阳性越高。用于金标免疫快速试验的膜多为硝酸纤维素膜或硝酸纤维素/醋酸纤维素混合膜,不同的包被蛋白对膜有特定要求,试验者应根据蛋 白质的性质选择适合孔径大小和分布结构的膜,找到合适的平衡点,使胶体金的标记物在膜上的流动速率为最佳。 1.2结合垫的选择。结合垫位于层析系统的中间,一般要求结合垫的网格均一且非特异性吸附低,能很好地负载胶体金标记物和待检测样品,而不被吸附;玻璃纤维素膜具备以上优点,同时具有一定的硬度,为试验中常用。 1.3样品垫及吸水纸的选择。样品垫和吸水纸位于胶体金免疫层析系统的两端,对于胶体金层析系统功能的实现起着举足轻重的作用。试验中应根据试纸条检测样品的性质选择合适的样品垫和吸水纸,保证样品在样品垫形成的通道中快速地流动而不被非特异性地吸附或者改变样品的性质。如检测样品为血清,则可选择网格较疏松的玻璃纤维素膜即可;如果检测样品为毒素,则可选择质量好的吸水纸和样品垫。吸水纸则要有很好的蓄水能力,保证样品中所用的液体都经过膜的反应区而被样品垫吸收和蓄积。 2关于胶体金的制备 制备颗粒均匀、分散度好的胶体金在金标免疫快速试验中非常关键,如果金颗粒直径的变异范围太大就会影响到试验的稳定性和重复性,如果金颗粒的形状不规则或粒径不均一,使得胶体金标记物容易解离和沉淀而产生金标扩散不完全、反应区底色过深和假阳性现象;而且胶体金质量不好,胶体 金结合物就不能快速而完整的从玻璃纤维上解离,从而影响试验结果。 胶体金的制备除了保证药品的质量外,制备过程中的细节关乎胶体金制备的成败。首先是操作环境和所用容器的清洁度。所有进入溶胶内的污物都会干扰胶体金颗粒的生成或使生成的胶体金出现聚堆现象,容器最好经酸洗和硅化处理。操作环境应保持清洁无尘粒,最好有专用工作区。其次,配制溶液均需使用双蒸水或三蒸去离子水配制,烧制胶体金最好用去离子水。再者是不同的还原剂对胶体金质量的影响。胶体金制备基于还原法,改变还原剂的性质和浓度,可制备粒径不同的胶体金悬液。根据试验目的选择胶体金的粒径,根据选择的粒径确定还原剂,如制备金颗粒直径在5,12nm的胶体金溶液用白磷或抗坏血酸还原氯金酸;如制备大于12nm直径的金颗粒的胶体金则用柠檬酸三钠还原氯金酸。此外不同的烧制、胶体金的制备量、还原剂的加入方式、加热容器的大小及加热的时间等也影响胶体金颗粒的大小和均一性。根据所需胶体金的粒径和数量,结合自身试验条件选择合适的胶体金制备方法。 3标记蛋白与相关抗原、抗体的制备 标记蛋白、T线和C线的抗原或者抗体的纯度和浓度直接影响金标探针的质量。获得纯度高、浓度适中的抗原、抗体,关键在于制备和纯化方法的选择及条件的优化。试验前须采用高速离心去杂质,应用饱和硫酸铵沉淀、亲和层析、透析除盐等一系列处理方法,尽可能去除单克隆抗体、二抗和相关蛋白溶液中的高浓度的杂质和多余离子,避免其干扰目的蛋白与胶体金的吸附结合,或导致 胶体金粒子的凝聚;特别是硼酸盐和磷酸盐不利于胶体金和蛋白的结合,应尽量避免接触。同时,充分处理各种大分子蛋白,使其尽量分散为单体和具有适当的分子质量,提高胶体金与蛋白质的结合比,便于与胶体金充分而稳定的结合。 4胶体金的标记 胶体金标记的两个关键环节是标记时的pH和最佳蛋白质标记量的确定。根据胶体金标记的原理,只有在pH接近和稍高于蛋白质的等电点时,胶体金蛋白质的吸附力最强;pH过高过低都不利于两者的结合,因此标记时选择精密的酸碱度测定仪器或者试纸条,采用不同方法重复校正,并进行梯度试验找到最佳的标记pH。溶胶与被标蛋白质的用量比例是否合适是影响标记成功的一个重要因素。过多蛋白质标记,造成浪费的同时引起试纸的拖带现象;过少蛋白质标记,导致胶体金标记不完全,从而降低试纸的灵敏度及假阳性现象的出现。也需要在试验中进行梯度试验,反复比较不同标记量的标记物在破坏试验中的稳定性,确定最佳的标记量。 5膜包被条件的优化处理 膜的包被条件,包括膜的封闭、环境的湿度、T线和C线上抗原或抗体的浓度、点膜条件、温度、 包被时间等,需要结合试验实际情况进行反复调整。包被过程中需要特别注意以下两点:?膜上T线和C线抗原或抗体的包被量要相对饱和;?包被后的膜一定要在适宜的温度下彻底干燥,否则会造成拖带、显色不清晰,灵敏度也大受影响。 5.1封闭对使用的膜进行处理。特别是进行封闭是一个十分有争议的问题,理论上来说购买回的膜基本上都是已经优化处理好的,直接点膜就可使用。如果点膜前将膜浸泡在封闭液内进行封闭处理,必然扰乱了膜内正常的物质分布,由此引发了许多不必要的麻烦。但是如果在实际的试验操作过程中,发现没有进行封闭的膜出现非特异性条带或者出现拖带现象,或遇到膜不封闭就无法将蛋白质或抗体包被在膜上的问题,就应考虑封闭问题。建议在制作试纸条过程中根据各自标记物的性质及其在膜上的显色情况来选择封闭与否,如果标记效果比较好且在膜上显色清晰而无拖带及假阳性现象出现,则完全没有必要进行膜的封闭。反之,可进行膜的封闭,查找不理想现象出现的原因。用来对膜进行封闭的物质很多,多选用大分子蛋白质如牛血清白蛋白(BSA)、聚乙二醇(PEGMW20000)等。常用的封闭方法有流动封闭和膜上定点封闭,前者将封闭物处理在样品垫上,后者将作用物质配成溶液喷涂在膜的特定位置上。 5.2环境湿度环境湿度对点膜过程非常重要。最佳湿度一般在45%,65%。湿度过低,膜上容易聚集静电荷,点膜容易出现散点,导致测试时出现疏水斑;湿度过高,膜上毛细作用加强,点膜容易引起T线、C线变宽甚至扩散。为了保证点样时膜湿度的均一性,一般在点样前把膜放到该湿度条件下平衡一段时间。 5.3T线和C线上抗原或抗体的浓度。T线和C线上抗原或抗体的包被浓度直接影响其与金标记物的结合比例,最终影响试纸条条 带的显色效果。包被浓度过低,膜上的条带显色不清晰或出现条带中空现象;包被浓度过高,会导致C线不显色或者出现拖带现象。若要获得反应稳定、显色清晰的试纸条,须对2条线上抗原或抗体的配合浓度及两者与金标记物的结合比进行调整和比对,以期得到最佳的组合。 5.4点样位置。不同的T线、C线点样位置将带来不同的灵敏度,点样位置上移,金标复合物通过T线位置时速度变慢,反应时间增加,灵敏度升高;反之灵敏度降低。可采用这个方法来改变灵敏度和消除假阳性。 5.5点样仪器。目前有2种点样方式,划膜式和非接触点膜式。非接触点膜式优于划膜式,划膜式需用软管将抗体划到膜表面,而膜本身的物理性质较为软脆,划管会在其表面留下印痕。划痕容易对层析的金标复合物形成阻力,导致假阳性,同时容易出现跑板时在T线位置出现若有若无一条细线,影响结果的判定。点样仪器不仅可以控制T线、C线点样位置,也可通过点膜仪器各种参数的调整控 制T线与C线宽度及喷膜速度等细节,达到最好显色效果。需要在试验过程反复调整各项参数做比对试验,观察试纸条的显色情况来决定。 6缓冲液 缓冲液构成胶体金免疫层析技术的液相载体,在不影响胶体金与蛋白质、抗原与抗体、硝酸纤维素膜与T线及C线蛋白结合的前提下,并为它们的结合反应提供最佳的酸碱环境。缓冲液并不是 通用的,不同的反应体系需要不同的缓冲液来支持,这就需要试验者结合自己的试验尝试不同的缓冲液,确定适合自己的缓冲液配方。常用的缓冲体系是在选用的缓冲液(磷酸盐、硼酸盐等)中添加相应的作用物质配制而成,所谓作用物质是解决反应体系出现的某一特定问题而添加的相应物质。比如通过在缓冲液中添加适量的表面活性剂,可起到增加亲水力、增色和避免线条中空现象;也可同时添 加几种物质,通过它们之间的相互协同作用共同解决相关的问题,如少量NaCl,减少信号强度,消除假阳性;糖和聚乙二醇作为保护剂,能减缓老化速度,也可以增加亲水力,但也要注意作用物质的添加宜简不宜繁。试纸条制备过程中的很多处理液都是在选择的缓冲液的基础上添加相应的作用物质配置而成的(如封闭液、结合垫处理液等)。 7样品的处理与结果的判定 7.1样品的处理方法和加样量。临床送检标本(如全血、血清、血浆),不同的单位和检测人员采用的处理方法不统一,也会对结果判定造成影响。如血浆内大量的纤维蛋白原,影响到层析的速度及均一性,直接影响到抗原抗体结合,处理不当甚至出现一种非特异性结合。检测时样品的添加量要相对充足,使膜上的反应充分进行,以便得到清晰的结果。加样量过低,会导致样品在试纸条上层析不充分而出现假阴性。 7.2结果的判定。由于使用胶体金产品的工作人员分布在不同的 层次、不同的部门,判定结果时有很大的随意性,判定时间不统一,特别是在工作环境、温度、湿度的影响下,根据标志线的显色时间随意判定结果,而忽略了厂家制定的有效时间。因此在检测时要求工作人员能及时分辨出试验结果出现的假阳性、假阴性现象及异常条带,能在查找原因后复检 或结合相关的检测方法重新检测进行比对和确认,避免漏检和错检。 8产品的保存和验证 8.1产品的储存。刚生产出的试纸条或检测卡一般含有5%,10%的水分,储存过程中环境过干过湿都不利于产品的储存。环境过干膜上的水分蒸发,会使膜变得疏水、带电荷并变脆;环境过湿影响金标记物的质量及T线、C线的显色效果;因此成品的试纸条和检测卡应进行防潮,存放时间过长时一般要求避光、密封保存。环境的温度也影响标记物、抗原、抗体的生物活性,在低温条件下可 有效延长产品的储存时间。 8.2成品验证试验。验证试验包括特异性试验、线性灵敏度试验、稳定性试验、样品检测、干扰试验、批间批内重复性试验等10个试验,综合评定产品的质量。成品验证试验需要的时间比较长,特别是产品的稳定性试验需要在很长的时间内定期抽样检测。应结合自己的试验,参照相应的国家或行业,制定针对性的试验检测成品的特异性、稳定性、重复性及灵敏度等指标,为进一步的优化和最终制成优质的检测试纸条或检测卡提供数据支持。 综上所述,胶体金免疫层析技术的各个环节受到种种因素的影响,也使得以免疫胶体金技术建立的检测方法在实际应用过程中也存在着一些问题,如胶体溶液的稳定性较差、存放时间相对较短及灵敏度受到多种因素的影响而下降等,导致免疫胶体金技术的应用受到一定限制。随着科技的进步,这些问题将在今后的研究中被逐步改善,免疫胶体金技术也将更进一步显示其巨大的优越性,实现半定量或定量检测及多元化检测,拓宽其在光镜、电镜、流式细胞仪、免疫印迹技术、生物芯片等领域内中的应用。 篇二:胶体金免疫层析试验 创新助手报告 ——主题分析报告 创新助手平台提供 北京万方软件股份有限公司 2014-07-01 报告目录 报告核心要 素...................................................................................................... ... I 一、主题简 介...................................................................................................... .. 1 二、主题相关科研产出总体分 析........................................................................ 1 2.1 文献总体产出统 计 ................................................................................ 1 2.2 学术关注趋势分 析 ................................................................................ 2 三、主题相关科技产出分 析........................................................................ 2 3.1 中文期刊论 文 ........................................................................................ 2 3.1.1 近十年中文期刊论文分布列 表 ................................................. 2 3.1.2 中文期刊论文增长趋 势 ............................................................. 3 3.1.3 发文较多期 刊 ............................................................................. 4 3.1.4 发文较多的机 构 ......................................................................... 4 3.1.5 发文较多的人 物 ......................................................................... 6 3.1.6 核心期刊分布数量对 比 ............................................................. 6 3.1.7最近相关中文期刊论 文 .............................................................. 9 3.1.8被引较多的相关期刊论 文 ........................................................ 12 3.2 学位论 文 .............................................................................................. 16 3.2.1 近十年学位论文年代分布列 表 ............................................... 16 3.2.2 学位论文增长趋 势 ................................................................... 17 3.2.3 硕博学位论文数量对 比 ........................................................... 17 3.2.4 发文较多的机 构 ....................................................................... 18 3.2.5 发文较多的人 物 ....................................................................... 18 3.2.6 最近相关学位论 文 ................................................................... 18 3.3 中文会议论 文 ...................................................................................... 19 3.3.1 近十年中文会议论文年代分布列 表 ....................................... 19 3.3.2 中文会议论文增长趋 势 ........................................................... 20 3.3.3 中文会议论文主办单位分 布 ................................................... 20 3.3.4 发文较多的机 构 ....................................................................... 21 3.3.5发文较多的人 物 ........................................................................ 21 3.3.6最近相关中文会议论 文 ............................................................ 21 3.4 外文期刊论 文 ...................................................................................... 21 3.4.1 近十年外文期刊论文年代分布列 表 ....................................... 21 3.4.2 外文期刊论文增长趋 势 ........................................................... 22 3.4.3 最近相关外文期刊论 文 ........................................................... 22 3.5 外文会议论 文....................................................................................... 22 I 篇三:免疫胶体金 第六节 免疫胶体金技术 (Immune colloidal gold technique) 一、概况 (一) 原理 免疫胶体金技术是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。胶体金是由氯金酸(HAuCl4)在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。 胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合，如SPA、PHA、ConA等。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。 (二) 胶体金的制备 根据不同的还原剂可以制备大小不同的胶体金颗粒。常用来制备胶体金颗粒的方法如下。 1(枸橼酸三钠还原法 (1)10nm胶体金粒的制备:取0.01,HAuCl4水溶液100ml，加入1,枸橼酸三钠水溶液3ml，加热煮沸30min，冷却至4?，溶液呈红色。 (2)15nm胶体金颗粒的制备:取0.01,HAuCl4水溶液100ml，加入1,枸橼酸三钠水溶液2ml，加热煮沸15min,30min，直至 颜色变红。冷却后加入0.1Mol/L K2CO30.5ml，混匀即可。 (3)15nm、18nm,20nm、30nm或50nm胶体金颗粒的制备:取0.01,HAuCl4水溶液100ml，加热煮沸。根据需要迅速加入1,枸橼酸三钠水溶液4ml、2.5ml、1ml或0.75ml，继续煮沸约5min，出现橙红色。这样制成的胶体金颗粒则分别为 ? 1 ? 15nm、18,20nm、30nm和50nm。 2(鞣酸—枸橼酸钠还原法 A液:1,HAuCl4水溶液1ml加入79ml双馏水中混匀。 B液:1,枸橼酸三钠4ml，1,鞣酸0.7ml，0.1Mol/L K2CO3液0.2ml，混合，加入双馏水至20ml。 将A液、B液分别加热至60?，在电磁搅拌下迅速将B液加入A液中，溶液变蓝，继续加热搅拌至溶液变成亮红色。此法制得的金颗粒的直径为5nm。如需要制备其它直径的金颗粒，则按表15-1所列的数字调整鞣酸及K2CO3的用量。 表15-1鞣酸—枸橼酸钠还原法试剂配制表 金粒直径 (nm) 5 10 A液 1,HAuCl4 1 1 双馏水 79 79 1,枸橼酸三钠 4 4 B液 0.1Mol/L K2CO3 0.20 0.025 1,鞣酸 0.70 0.10 双馏水 15.10 15.875 (1)玻璃器皿必须彻底清洗，最好是经过硅化处理的玻 璃器皿，或用第一次配制的胶体金稳定的玻璃器皿，再用双馏水冲洗后使用。否则影响生物大分子与金颗粒结合和活化后金颗粒的稳定性，不能获得预期大小的金颗粒。 (2)试剂配制必须保持严格的纯净，所有试剂都必须使用双馏水或三馏水并去离子后配制，或者在临用前将配好的试剂经超滤或微孔滤膜(0.45μm)过滤，以除去其中的聚合物和其它可能混入的杂质。 (3)配制胶体金溶液的pH以中性(pH7.2)较好。 (4)氯金酸的质量要求上乘，杂质少。最好是进口的。 (5)氯金酸配成1,水溶液在4?可保持数月稳定，由于氯金酸易潮解，因此在配制时，最好将整个小包装一次性溶解。 (三) 胶体金标记蛋白的制备 胶体金对蛋白的吸附主要取决于pH值，在接近蛋白质的等电点或偏碱的条件下，二者容易形成牢固的结合物。如果胶体金的pH值低于蛋白质的等电点时，则会聚集而失去结合能力。除此以外胶体金颗粒的大小、离子强度、蛋白质的分子量等都影响胶体金与蛋白质的结合。 1(待标记蛋白溶液的制备 将待标记蛋白预先对0.005Mol/L pH7.0 NaCl溶液中4?透析过夜，以除去多余的盐离子，然后100 000g4?离心1h，去除聚合物。 ? 2 ? 2(待标胶体金溶液的准备 以0.1Mol/L K2CO3或0.1Mol/L HCl 调胶体金液的pH值。标记IgG时，调至9.0;标记McAb时,调至8.2;标记亲和层析抗体时，调至7.6;标记SPA时，调至5.9,6.2;标记ConA时，调至8.0;标记亲和素时，调至9,10。 由于胶体金溶液可能损坏pH计的电板，因此，在调节pH时，采用精密pH试纸测定为宜。 3(胶体金与标记蛋白用量之比的确定 (1)根据待标记蛋白的要求，将胶体金调好pH之后，分装10管，每管1ml。 (2)将标记蛋白(以IgG为例)以0.005Mol/L pH9.0硼酸盐缓冲液做系列稀释为5μg/ml,50μg/ml，分别取1ml，加入上列金胶溶液中，混匀。对照管只加1ml稀释液。 (3)5min后，在上述各管中加入0.1ml 10,NaCl溶液，混匀后静置2h，观察结果。 (4)结果观察，对照管(未加蛋白质)和加入蛋白质的量不足以稳定胶体金的各管，均呈现出由红变蓝的聚沉现象;而加入蛋白量达到或超过最低稳定量的各管仍保持红色不变。以稳定1ml胶体金溶液红色不变的最低蛋白质用量，即为该标记蛋白质的最低用量，在实际工作中，可适当增加10,,20,。 4(胶体金与蛋白质(IgG)的结合 将胶体金和IgG溶液分别以0.1Mol/L K2CO3调pH至9.0，电磁搅拌IgG溶液，加入胶体金溶液，继续搅拌10min，加入一定量的稳定剂以防止抗体蛋白与胶体金聚合发生沉淀。常用稳定剂是5,胎牛血清(BSA)和1,聚 乙二醇(分子量20KD)。加入的量:5,BSA使溶液终浓度为1,;1,聚乙二醇加至总溶液的1,10。 5(胶体金标记蛋白的纯化 (1)超速离心法:根据胶体金颗粒的大小，标记蛋白的种类及稳定剂的不同选用不同的离心速度和离心时间。 用BSA做稳定剂的胶体金—羊抗兔IgG结合物可先低速离心(20nm金胶粒用1 200r/min，5nm金胶粒用1 800r/min)20min，弃去凝聚的沉淀。然后将5nm胶体金结合物用6 000g，4?离心1h;20nm,40nm胶体金结合物，14 000g，4?离心1h。仔细吸出上清，沉淀物用含1,BSA的PB液(含0.02,NaN3)，将沉淀重悬为原体积的1,10，4?保存。如在结合物内加50,甘油可贮存于-18?保存一年以上。 为了得到颗粒均一的免疫金试剂，可将上述初步纯化的结合物再进一步用10,,30,蔗糖或甘油进行密度梯度离心,分带收集不同梯度的胶体金与蛋白的结合物。 ? 3 ? (2)凝胶过滤法:此法只适用于以BSA作稳定剂的胶体金蛋白结合物的纯化。将胶体金蛋白结合物装入透析袋，在硅胶中脱水浓缩至原体积的1,5,1,10。再经1 500r/min离心20min。取上清加至Sephacryl S-400(丙烯葡聚糖凝胶S-400)层析柱分别纯化。层析柱为0.8 cm×20cm，加样量为床体积的1,10，以0.02Mol/L PBS液洗脱(内含0.1,BSA，0.05,NaN3，pH8.2者用IgG标记物)， 流速为8ml/h。按红色深浅分管收集洗脱液。一般先滤出的液体为微黄色，有时略混浊，内含大颗粒聚合物等杂质。继之为纯化的胶体金蛋白结合物，随浓度的增加而红色逐渐加深，清亮透明，最后洗脱出略带黄色的为标记的蛋白组分。将纯化的胶体金蛋白结合物过滤除菌、分装,4?保存。最终可得到70,,80,的产量。 6(胶体金蛋白结合物的质量鉴定 (1)胶体金颗粒平均直径的测量:用支持膜的镍网(铜网也可)蘸取金标蛋白试剂，自然干燥后直接在透射电镜下观察。或用醋酸铀复染后观察。计算100个金颗粒的平均直径。 (2)胶体金溶液的OD520nm值测定:胶体金颗粒在波长510nm,550nm之间出现最大吸收值峰。用0.02Mol/L pH8.2 PBS 液(含1,BSA，0.02,NaN3)将胶体金蛋白试剂作1:20稀释，OD520,0.25左右。一般应用液的OD520应为0.2,0.4。 (3)金标记蛋白的特异性与敏感性测定:采用微孔滤膜免疫金银染色法(MF,IGSSA)。将可溶性抗原(或抗体)吸附于载体上(滤纸、硝酸纤维膜、微孔滤膜)，用胶体金标记的抗体(或抗原)以直接或间接染色法并经银显影来检测相应的抗原或抗体，对金标记蛋白的特异性和敏感性进行鉴定。 (四) 胶体金标记技术在免疫学中的应用 胶体金标记技术由于标记物的制备简便，方法敏感、特异，不需要使用放射性同位素，或有潜在致癌物质的酶显色底物，也不要荧光显微镜，它的应用范围广，除应用于光镜或电镜的免疫组 化法外，更广泛地应用于各种液相免疫测定和固相免疫分析以及流式细胞术等。 1(液相免疫测定:将胶体金与抗体结合，建立微量凝集试验检测相应的抗原，如间接血凝一样，用肉眼可直接观察到凝集颗粒。利用免疫学反应时金颗粒凝聚导致颜色减退的原理，建立均相溶胶颗粒免疫测定法(Sol particle immunoassay ,SPIA)已成功地应用于PCG的检测，直接应用分光光度计进行定量分析。 2(金标记流式细胞术:胶体金可以明显改变红色激光的散射角，利用胶体金标记的羊抗鼠Ig抗体应用于流式细胞术，分析不同类型细胞的表面抗原，结果胶体金标记的细胞在波长632nm时，90度散射角可放大10倍以上，同时不影响细胞活性。而且与荧光素共同标记，彼此互不干扰。 3(胶体金固相免疫测定法 ? 4 ? (1)斑点免疫金银染色法(Dot,IGS,IGSS)是将斑点ELISA与免疫胶体金结合起来的一种方法。将蛋白质抗原直接点样在硝酸纤维膜上，与特异性抗体反应后，再滴加胶体金标记的第二抗体，结果在抗原抗体反应处发生金颗粒聚集，形成肉眼可见的红色斑点，此称为斑点免疫金染色法(Dot,IGS)。此反应可通过银显影液增强，即斑点金银染色法(Dot,IGS,IGSS)。 (2)斑点金免疫渗滤测定法(dot immuno,gold filtration assay,DIGFA)此法原理完全同斑点免疫金染色法，只是在硝酸纤 维膜下垫有吸水性强的垫料，即为渗滤装置。在加抗原(抗体)后，迅速加抗体(抗原)，再加金标记第二抗体，由于有渗滤装置，反应很快，在数分钟内即可显出颜色反应。此方法已成功地应用于人的免疫缺陷病病毒(HIV)的检查和人血清中甲胎蛋白的检测。 二、Dot,IGSS检测牛结核血清抗体 (一)材料与试剂 1(抗原 牛结核PPD。 2(血清 待检血清、标准结核阳性血清和结核阴性血清。 3(硝酸纤维膜 孔径0.45μm。 4(氯化金(优质) 5(0.2Mol/L PB液 6(0.05Mol/L Tris—HCl缓冲液 7(硝酸银显影液(现用现配) 明胶(20g/L)6.00ml 对苯二酚(57.90g/L)3.00ml 硝酸银(25g/L) 0.20ml pH3.5柠檬酸盐缓冲液1.00ml 对苯二酚和硝酸银溶液需避光保存，临用前将明胶加热溶解后，按上述比例依次混合。 pH3.5柠檬酸盐缓冲液的配制: 柠檬酸(C6H8O7?H2O) 25.50g 柠檬酸三钠(C6H5Na3?2H2O) 3.50g 去离子水 加至100.00ml ? 5 ?