【doc】 静脉免疫球蛋白对新生儿脐带血单核巨噬细胞吞噬功能的影响

【doc】 静脉免疫球蛋白对新生儿脐带血单核巨噬细胞吞噬功能的影响 静脉免疫球蛋白对新生儿脐带血单核巨噬 细胞吞噬功能的影响 ?630?临床儿科杂志2005年第23卷第 论着 静脉免疫球蛋白对新生儿脐带血单核巨噬细胞吞噬功能的影响 上海第二医科大学附属新华医院上海市儿科医学研究所免疫/月中瘤研究室(上海200092) 王美红陈同辛朱亚忠李庆生 【摘要】目的通过研究静脉免疫球蛋白(IVIG)对脐带血单核巨噬细胞吞噬功能的影响,探讨IVIG对新 生儿的免疫抑制作用.方法将分离培养后新生儿脐带血和成人外周血单核巨噬细胞与异硫氰酸荧光素标记的葡 dextran)孵育,利用流式细胞技术检测单核巨噬细胞的 聚糖(FITC— FITC—dextran阳性细胞比率和相对荧光密 度.结果加入IVIG处理培养的新生儿脐带血和成人外周血单核巨噬细胞的FITC—dextran阳性细胞比率和相对 荧光密度均明显降低,但是新生儿脐带血降低更明显.结论WIG可以明显抑制脐带血单核巨噬细胞的吞噬功 能,此种抑制作用?丁能与IVIG抑制脐带血单核巨噬细胞面的某些受体有关. 【关键词】新生儿静脉免疫球蛋白单核巨噬细胞吞噬功能 【中图分类号】R722【文献标识符】A【文章编号】 3606(2005)09—630—04 1000— StudyontheefflectofintraVan0usimmunoglobulinonthephag0cyt0sisofneonatalumbilical cordbloodmonocytes/macrophagesWa,fgMong,C 『7Tongx.,z/MYazho,fg,LiQing— sheng.Imunology/O~tcologgDepame?f,Sha?ghaiInstitttte.t’o7PediafricResearch,XhtzaHospi— tal,ShanghaiSecondMedical【,,t’ersity,Shahghai200092 【Abstracts】 ObjectivesItwaspresumedthatimmuneinhibitoryfunctionofintravenousimmunoglo— bulin(IVIG)wasproducedbychangingphagocytosisofthemonocyte/macrophages.Inordertoexplorethe inhibitorymechanismofWIGonneonatalimmunefunction,weinvestigatethephagocytosisofumbilicalcord bloodmonocyte/macrophages(Mo/M0).Methodseightfull—termneonate swithnormalApgarscorewere selectedrandomlyfromthedeliveryroomofXinhuaHospitalassubjects(averageagewas40weeks),their Mo/MOintheumbilicalcordbloodwerestudied.And8healthyadultsweresel ected.theirMo/M0inthe peripheralbloodwerestudiedascontro1.TheMo/MOwasseparated.andDMEMculturemediumwasadded intothecontrolgroup,andeachml0fDMEMculturemediumwasaddedbyfreezinghumanimmunoglobulin tothesubjects.Afterbeingculturedfor72hour.theMo/M0wereincubatedwithfluoresceinisothio— cyanate—dextran(FITC—dextran).TheexpressionofFITC—dextranandt hepercentageofpositivecellwere testedwithflowcytometry.Theresultswerecomparedwiththoseofadults.ResultsThepercentageof positivecellintheumbilicalcordbloodwithoutIVIGstimulatingwas94.17?1.56.andtheexpressionof FITC—dextranwas546.28?17.29.Whereas.thepercentageofpositivecellandFITC—dextranrelativefluo— rescenceintensityintheumbilicalcordbloodcultureswithIVIGsignificantlydecreasedin56.04?5.07and 345.86?24.00,respectively.Thedifferenceswerestatisticallysignificant(P<0.01).Thepercentageofpos— itivecellandFITC—dextranrelativefluorescenceintensityintheperipheralbloodinadultswerealsoobvi— ouslydecreased.Whereas,thepercentageofpositivecellinumbilicalcordblo odwas0.63,and().78inthe peripheralbloodwithsignificantdifferencebetweentwogroups(P<0.01). dextranrelativefluores— FITC— cenceintensityintheumbilicalcordbloodwas0.60,butwas0.86intheperipheralbloodofadultsalsowith significantdifferencebetweentwogroups(P<0.01).ConclusionsIVIGcaninhibitthephagocytosisof umbilicalcordbloodmonocyte/macrophagesanditmightberelatedtotheinhibitoryeffectofWIGonsome receptorsofmonocytes/macrophages. 【Keywords】 neonateintravenousimmun0gl0bulinm0n0cyte/macr0phagephagocytosis *本课系国家自然科学基金(39600158)和上海市高等学 校科学技术发展基金(03BKl1)资助项目 通讯作者:陈同辛E—mail:tongxinc@yahoo.corn 由于单核巨噬细胞(monocyte/macrophage, Mo/M0)是体内专职的吞噬细胞,其在全身组织分 布广泛,可在第一时间接触和识别进人机体的病原 体,发挥先天性免疫作用(即吞噬作用),并可通过其 儿科杂志2005,第鲞星 特有的高效抗原提呈能力启动T淋巴细胞和B淋 巴细胞介导的获得性免疫,因此近年来受到了免疫 学界的重视.静脉免疫球蛋白(intravenousim— munoglobulin,IVIG)可抑制新生儿的T淋巴细胞 和B淋巴细胞的功能】,并且在围产期和新生儿 期应用较为广泛,本研究从新生儿脐带血Mo/M0 的吞噬功能角度探讨了IVIG的免疫抑制作用. 材料与方法 一 ,研究对象随机选择本院产房足月顺产,平 均胎龄40周,Apgar评分正常的8例新生儿作为研 究对象,其母孕期健康,无特殊疾病史.同时选择8 例平均年龄26岁的健康成年志愿者作为研究对照, 其采血前4周无明显感染史,并且未用过血制品和 免疫调节剂. 二,实验方法 1.Mo/MO的分离和培养:取新生儿脐带血或 成人外周血,乙二胺四乙酸二钠抗凝,用DMEM培 养液(美国Gibco公司产品)稀释1倍,再用淋巴细 胞分离液密度梯度离心分离单个核细胞,然后用 DMEM培养液洗涤3次后调成2×106/ml细胞浓 度,并接种于塑料6孑L培养板中,3TC,5%C0.培养 条件下孵育2h,最后用DMEM培养液轻轻洗涤3 次,以祛除非贴壁细胞,并用橡胶细胞刮刀刮取贴壁 的Mo/MO备用. 2.细胞处理培养:将分离得到的新生儿脐带血 单核巨噬细胞(cordbloodmonocyte/macrophage, CBMo/MO),或成人外周血单核巨噬细胞(periphe— ralbloodmonocyte/macrophage,PBMo/Mo)分别 接种于6孑L培养板中,并分成对照组和实验组,对照 组单独加入DMEM培养液,而实验组每毫升 DMEM培养液中加入10mg冻干的人IVIG(上海 生物制品研究所产品).细胞加入IVIG后,在37?, 5%C0z培养条件下处理72h,然后离心收集细胞, 并且在流式细胞仪上证实CD14阳性细胞比率不少 于80%. 3.细胞计数和活力检测:用吸管轻轻吹打上 述处理培养过的Mo/MO,使之悬浮并分散,并做 相应的稀释,然后取稀释后的细胞悬液10l,加入 细胞计数板内,在光学显微镜下计数四角大方格 中的细胞数,并按下列公式计算出细胞浓度,即细 胞数/ml=(4大方格内细胞总数/4)×10×相应 的稀释倍数.将处理培养过的Mo/MO悬浮,并调成 l06/ml细胞悬液,再取9滴细胞悬液移入试管中, ? 631? 加入1滴0.4%的台盼蓝溶液并混匀,然后在计数 板上分别计数被台盼蓝染成淡蓝色的细胞(即死细 胞)和拒染的细胞(即活细胞)总数.最后按下列公 式计算细胞活力,即细胞活力(%)=活细胞总数/ (活细胞总数+死细胞总数)×100.每份标本均重复 3次计数. 4.吞噬功能的测定:将上述处理培养过的Mo/ M0,分别用PBS缓冲液洗涤,悬浮计数后,调整细 胞浓度为1×106/ml.然后分别取150l细胞悬液, 加入150l异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖(fluore— sceinisothiocyanate,dextran,FITC—dextran;分 子量为40000,浓度为lmg/ml;美国Sigma公司产 品),同时另取150l细胞悬液,加入150lPBS缓 冲液作为阴性对照.最后将这些细胞悬液置于 37?,5%C02培养条件下孵育1h,用PBS液洗涤4 次,并在流式细胞仪(FACSCalibur,美国Becton Dickinson公司产品)上进行分析.每个标本检测 10个细胞以确定F1TC—dextran阳性的细胞比率 和相对荧光密度(relativefluorescenceintensity, RFI).阳性细胞比率和相对荧光密度经CellQuest 软件计算所得. 三,统计学处理全部数据以均数?差 (?8)表示,并用SPSS11.5软件进行统计学处理 分析.两样本均数比较采用t检验,以P<0.05为 差异有显着性. 结果 一 , IVIG对新生儿CBM0/M数量和活力的影 响在未加入IVIG处理时,CBMo/M0的数量为 (7.02?0.50)×105/ml,而成人PBMo/MO的数量 为(6.66?0.32)×105/ml,两者相比差异无显着性 (t=1.69,P>0.05).加入IVIG处理后,CBM0/ MO的数量为(6.72?0.37)×105/ml,与未加入 IVIG处理的对照组相比,数量略有减少,但差异仍 无显着性(t=1.38,P>0.05);与IVIG处理后的 成人PBMo/M0数量[(6.45?0.26)×105/m1]相比 差异也无显着性(t=1.62,P>0.05). IVIG对CBM0/Me和成人PBMo/M0的活力 均无影响,在未加入IVIG处理时和加入血单核巨噬细胞吞噬功能的 影响及 与成人外周血的比较 注:图中数据为单核巨噬细胞FITC—dextran相对荧光密度 (阳性细胞百分比) MO相比差异无显着性(P>0.05),但是CBMo/ Me的FITC.dextran相对荧光密度却明显低于成人 PBMo/Me,两者相比差异存在非常显着性(P <0.01).加入IVIG处理后,CBMo/Me中 FITC—dextran阳性细胞比率和相对荧光密度均明显 降低,与未加入IVIG处理的对照组相比,两者差异均 有非常显着性(P<0.u1).同样加入IVIG处理后, 成人PBMo/Me中FITC—dextran阳性细胞比率和 相对荧光密度也明显降低.结果不同的是CBMo/ Me中FITC—dextran阳性细胞比率(IVIG组/对照 组)为0.63,成人PBM0/M0为0.78,两者相比差异 存在着非常显着性(t=5.31,P<0.01);CBMo/M FITC—dextran相对荧光密度(IVIG组/对照组)为 0.60,成人PBMo/Me为0.86,两者相比差异存在 非常显着性(=9.59,P<0.01). 讨论 有关IVIG可抑制新生儿和成人免疫功能的 研究已有较多报道.过去我们的研究提示,IVIG 可以抑制新生儿脐带血B淋巴细胞的免疫球蛋白 释放,其机制可能与抑制了T淋巴细胞的细胞因 子分泌和B淋巴细胞表面的CD40分子表达不足有 关昭?;并且IVIG也可以抑制新生儿脐带血单个核 细胞的增殖瞄最近我们的研究又进一步提示,虽然 IVIG可以通过抑制PHA诱导的CD25分子和 CD45RO分子的表达,直接抑制脐带血T淋巴细胞 的活化,但是这种抑制作用的程度远远不如对脐带 血单个核细胞明显.由此可以推测,IVIG对脐带血 T淋巴细胞的活化抑制,除了直接作用于T淋巴细 胞外,还可能通过其他免疫细胞或免疫分子间接介 导_6].鉴于目前已有研究表明,IVIG可以通过抑制 成人外周血树突状细胞的分化,成熟以及细胞因子 的释放,间接抑制T淋巴细胞的活化和增殖_7],并且 抑制成人Mo/Me的吞噬功能旧】,为此我们从IVIG 对CBMo/Me吞噬功能的影响进行了研究. 本研究结果表明:IVIG浓度在10mg/ml时不 能降低CBMo/qVl~的总数,也不能诱导其死亡,因为 CBMo/M0台盼蓝的拒染率达到95%以上.但是国 外有研究表明IVIG在治疗浓度(5,10mg/m1)时 也不会引起细胞的凋亡旧】.为了进一步探讨IVIG对 新生儿CBMo/Me作用的机制,我们还从IVIG对 CBMo/M~吞噬功能的影响进行了研究,结果发现: IVIG可以明显抑制CBMo/Me的吞噬功能,表现 为使具有吞噬能力的CBMo/Me数量降低(即 FITC—dextran阳性细胞比率降低)和吞噬能力下降 (即FITC—dextran相对荧光密度下降).此种抑制 作用可能与IVIG抑制了CBMo/Me表面的某些 受体有关,因为Mo/Me表面具有某些能够识别病 原体和异物的受体分子,这些受体分子被称为模式 识别受体(patternrecognitionreceptor,PRR), Mo/Me主要依靠这些受体分子发挥其吞噬作用, 与吞噬作用有关的PRR主要有甘露糖受体 (mannitolreceptor,MR)和Fc受体(Fcrecep— tor,FcR)等”目前有文献报道IVIG抑制成人 Mo/Me吞噬功能的可能机制是:IVIG可以抑制 FcTR工和FcTRIl1分子的表达,阻断FcTR与抗原 临床儿科杂志2005年第23卷第9期 的结合,并促进抑制性受体FcTR?b的表达,从而 抑制免疫球蛋白IgG的Fc段与MoAVIo的结合,进 而抑制受体介导的吞噬及杀伤功能.另外,在未加 入WIG处理时,具有吞噬能力的CBMo/Me在数 量上不低于成人PBMo/Me,但是在功能上可能低 于成人PBMo/Me,因为其表达FITC—dextran相对 荧光密度较低,并且在加入WIG处理后,具有吞噬 能力的CBMo/Me在数量和功能上均明显低于成人 PBMo/M0,显示IVIG对CBMo/M0的吞噬功能的 抑制作用更明显.此种现象是否与新生儿CBMo/ Me功能的不成熟有关尚需进一步研究. 综上所述,IVIG可以直接抑制新生儿CBMo/ MO的吞噬功能,但是其对后续激发获得性T淋巴 细胞和B淋巴细胞的免疫反应的能力(如组织相容 性抗原和共刺激分子的表达)还需进一步研究.(致 谢:本课题的完成得到了香港大学儿童及青少年科 学系罗嘉慧博士的帮助,在此表示感谢.) 参考文献 1.BeelenRHI,NibberingPH,LeenenPJI,eta1.Thema— crophage:basicandclinicalaspects.Immunobiology, 1996,195(4—5):401—406. 2.李庆生,吴圣楣,应大明,等.静脉免疫球蛋白对脐血B细 胞免疫球蛋白释放的凋节.中华医学杂志,1998,78(11): 837—838. 3.李庆生,吴圣楣,应大明,等.静脉免疫球蛋白对新生儿单 个核细胞IL一2,IL-4mRNA表达的调节.中华微生物学 ? 633? 和免疫学杂志,1998,18(5):378—381. 4.李庆生.吴圣楣,应大明,等.静脉免疫球蛋白对新生儿淋 巴细胞CD40与CD40配体表达调节的研究.中华儿科 杂志,1998,36(8):467—470. 5.李庆生,吴圣楣,应大明,等.静脉注射免疫球蛋白对新生 儿脐血单个核细胞活化增值的影响.中华微生物学和免 疫学杂志,1999,19(1):55—57. 6.郝轶群,陈同辛,朱亚忠,等.静脉免疫球蛋白对新生儿脐 带血淋巴细胞免疫抑制机制的研究.中华儿科学杂志, 2005,43(6):438—443. 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(收稿日期:2004—12—23) 足月剖宫产儿急性呼吸窘迫综合征临床分析 天津市人民医院儿科(天津300121)曹凤玲陈崇义刘莹 【中图分类号】R722【文献标识码】A【文章编号】1000—3606(2005)09—633—03 新生儿急性呼吸窘迫综合征(acuterespira torydistresssyndrom,ARDS)是新生儿期较为严 重的呼吸系统疾病,死亡率高,国外报道达60%.过 去认为新生儿呼吸窘迫综合征仅发生于早产儿,90 年代后,人们发现足月新生儿也可发生,尤其是没有 试产的选择性剖宫产儿,而且有相似的病理改变和 临床特点,人们将其命名为ARDS.随着剖宫产率的 上升,ARDS发生率逐渐升高n,已引起人们的高度 重视.现对我院符合ARDS诊断标准的足月剖宫产 儿的临床资料,进行回顾性分析如下. 资料与方法 一 ,临床资料我院2001年12月至2004年9 月期间共收治8例需要机械通气治疗的足月剖宫产 儿,男5例,女3例;平均胎龄38雩周;出生体重 <2500g1例,>2500g7例;日龄最小5min,最大 24h;羊水清亮5例,?度混浊3例;有胎儿宫内窘 迫史4例,羊水吸人史3例,胎粪吸人1例.1分钟