刺激隐核虫幼虫诱导的斜带石斑鱼体液免疫应答

摘    要 刺激隐核虫是一种纤毛类寄生虫，对水产养殖和观赏鱼类造成了极大危害，在短时间内就会引发严重感染和高死亡率，对经济生产造成了很大的损失。本文就刺激隐核虫的幼虫阶段所引起的体液免疫应答过程进行研究，以期能找到具有最高免疫原性和免疫保护性的免疫原，为以后疫苗的研制与开发奠定基础。 刺激隐核虫的生活周期的四个阶段（见图示），我们采用的是Colorni和Burgess(1997)的术语：滋养体(trophont)、胞囊前体(protomont)、胞囊(tomont)和幼虫(theront)。腹腔注射刺激隐核虫幼虫能使斜带石斑鱼的血清和皮肤培养液产生阻动隐核虫幼虫的特异性抗体，并能使免疫鱼获得很好的免疫保护，刺激隐核虫生活史的三个发育阶段中，只有幼虫期具有较好的免疫原性，而其它两个阶段免疫原性较差。可以将幼虫期作为首选来研制灭活疫苗，为防御和治疗刺激隐核虫病奠定了基础。所以，从我们的研究结果来看，刺激隐核虫病的预防和防治应该从幼虫期为出发，进行灭活疫苗疫苗或者基因疫苗的研究。 在本实验中，相同的免疫方法所引发的血清抗体和皮肤抗体的变化规律存在很大的差别，两类抗体的最初生成时间、达到峰值的时间以及阻动效价等都不一致，这说明鱼类的系统免疫应答和皮肤粘膜免疫应答是相互独立的。 关键词：刺激隐核虫 幼虫 免疫 活疫苗 鱼类 目    录 1 前言    1 1.1 关于刺激隐核虫的研究    1 1.2 关于斜带石斑鱼的研究    2 1.3 刺激隐核虫各生活阶段的研究    2 1.4 本实验的目的与意义    3 2 材料和方法    3 2.1 实验鱼的来源、检测及驯养    3 2.2 刺激隐核虫幼虫的来源    4 2.3 实验分组    5 2.4 免疫方法    5 2.5 抗血清的制备方法    5 2.6 皮肤培养液的制备方法    5 2.7 血清抗体和皮肤培养液阻动效价的测定    6 2.8 幼虫对实验鱼致死剂量的测定    6 2.9 攻毒    6 2.10 数据统计方法    6 3 结果    6 3.1 抗体对幼虫的阻动过程    6 3.2 抗血清阻动效价的变化规律    9 3.2  皮肤培养液阻动效价的变化规律    10 3.3 抗血清和皮肤培养液阻动效价的变化差异    11 3.4 致死剂量幼虫攻毒后各实验组鱼的死亡率    11 4 讨论    12 1 前言 1.1 关于刺激隐核虫的研究 刺激隐核虫是一种纤毛类寄生虫，对水产养殖和观赏鱼类造成了极大危害，在短时间内就会引发严重感染和高死亡率，对经济生产造成了很大的损失。刺激隐核虫的危害随着海水养殖业的发展，其危害性也日益增大。特别是近年来海水养殖业发展迅猛，养殖规模迅速扩大，海水观赏鱼类的养殖也越来越多，这些高密度养殖的海水鱼为刺激隐核虫的传播和该病的爆发提供了良好的条件。迄今为止，报道刺激隐核虫病的地区包括印度太平地区、波斯湾、以色列的红海、大西洋和加勒比海地区(Colorni and Burgess, 1997; Yambot et al.,2003)。Diggles和Adlard (1997)的研究表明刺激隐核虫存在种内变异, 而且一些虫株有可能发生进化。Yambot等人(2003)在海鲷(Sparus sarba)上发现了一株生活在低盐度海水里的刺激隐核虫变株，引起很高的死亡率。这一发现扩大了该寄生虫的栖息地和宿主范围。而且，该种寄生虫在海水中具有广泛的宿主范围。Wilkie(1969)年曾报道了刺激隐核虫感染96种水族馆养殖的海水鱼。Diggles(1996)调查了澳大利亚的14种野生海水鱼，在13种鱼体上发现了刺激隐核虫(Diggles and Lester，1996a)。罗等人对中国华南地区六个科的十种海水养殖鱼类的调查发现，十种海水鱼类都被刺激隐核虫感染。所有这些研究结果表明，刺激隐核虫具有广泛的宿主范围。 Burgess(1995)曾报道过感染过刺激隐核虫的鲻鱼引起其获得性免疫，并保护其免受该虫的再次感染。Yoshinaga(1997)发现免疫过的鳉鱼能得到很好的保护，并且其血清能阻动刺激隐核虫的幼虫。近几年来，关于鱼类对对刺激隐核虫的免疫应答引起了研究者的重视，刺激隐核虫幼虫免疫的石斑鱼血清和粘液中都发现了特异性抗体，并具有很好的免疫保护性(Yoshinaga and Nakazoe, 1997; Luo et al., 2007; Yambot and Song, 2006)。目前采用的物理或化学的方法对该病很难取得好的疗效(Hirazawa et al., 2001a; Hirazawa et al., 2001b; Hirazawa et al., 2003; Kakuta and Kurokura, 1995; Yoshinaga, 2001)，淡水浸泡对海水鱼的伤害较大，而且费时费力。化学治疗也受到很多方面的限制，许多化学药品是致癌物质，这就不能用于食用鱼的治疗。而且，化学药品要经过很多处理才能达到使用效果，否则只会对自由生活的时期有作用，而对于寄生于宿主的阶段就不会有作用。因此，在感染后治疗过程中，相对于化学治疗来说，免疫接种的方法是一种更为安全和有效的措施。 1.2 关于斜带石斑鱼的研究 本文中采用的实验鱼是斜带石斑鱼，石斑鱼( Epinephelus )属鲈形目(Perciformes)、鲈亚目(Percoidei)、鮨科(Serra nidae)。石斑鱼具有许多优良性状,如肉质鲜美、体色好、适合活体运输等，一些种类因生长速度快、对环境的适应能力相对强，适合人工养殖。斜带石斑鱼是我国最近几年大力发展养殖的海产鱼类，其生长速度快，易养殖。随着石斑鱼自然资源减少，人工养殖石斑鱼越来越受到重视。近10多年来,我国南方沿海的石斑鱼养殖发展很快。石斑鱼类是我国重要的海水网箱养殖优质鱼类,销售市场稳定、价格昂贵，对石斑鱼的研究国外已有许多报道。日本最早于20 世纪60 年代开始对赤点石斑鱼( E. akaara)以及其它一些石斑鱼的人工繁殖进行了试验。 20世纪70年代以后,东南亚许多国家、科威特及我国大陆、香港、台湾也相继开展石斑鱼人工繁殖的研究。最近几年，国内许多科研单位先后对斜带石斑鱼(E. coiodes)(刘付永忠等, 2001; 周仁杰等, 2002; 王云新等, 2003; 史海东等, 2004)、点带石斑鱼(陈国华a, 陈国华b, 2001; 邹记兴等; 2003; 全汉锋等, 2004)、赤点石斑鱼(王涵生, 1996; 刘付永忠等, 2001; 毛国民等, 2004)和鞍带石斑鱼龙胆石斑鱼, E. lanceolatus) (龚孟忠等, 2004) 等的人工繁殖和育苗技术进行了研究，推动了石斑鱼养殖业的快速发展。国外开展斜带石斑鱼人工育苗研究主要是泰国和菲律宾，在我国台湾已可以批量生产。 1.3 刺激隐核虫各生活阶段的研究 寄生于淡水鱼的多子小瓜虫和刺激隐核虫具有很多相似的生活史、感染模式、病理特征等(Colorni and Burgess, 1997; Dickerson and Clark, 1998)。多子小瓜虫的各个生活阶段都具有免疫保护性，包括幼虫期、滋养体期和胞囊期(McCallum, 1986; Burkart et al., 1990; Lin and Dickerson, 1992; Sigh et al.,2004; Xu et al., 2004)。刺激隐核虫的生活周期的四个阶段（见图示），我们采用的是Colorni和Burgess(1997)的术语：滋养体(trophont)、胞囊前体(protomont)、胞囊(tomont)和幼虫(theront)。 图1 刺激隐核虫的生活史 相对于多子小瓜虫细致而深入的免疫学研究(Buchmann et al., 2001; Dickerson and Clark, 1998; Dickerson et al., 1993; Lin and Dickerson, 1992; Maki and Dickerson, 2003; Xu and Klesius, 2002) ，对刺激隐核虫的免疫学研究工作才刚刚开始。刺激隐核虫与多子小瓜虫具有很多相似的生活史、感染模式、病理特征等(Colorni and Burgess, 1997; Dickerson and Clark, 1998)，鱼类可能对这两种纤毛虫的免疫防御机制也有很多相似之处，因此我们可以借鉴多子小瓜虫的免疫研究方法来对刺激隐核虫加以研究。 1.4 本实验的目的与意义 迄今为止，对刺激隐核虫生活史中各个阶段的免疫应答研究尚未见报道。本文就刺激隐核虫的幼虫阶段所引起的体液免疫应答过程进行研究，以期能找到具有最高免疫原性和免疫保护性的免疫原，为以后疫苗的研制与开发奠定基础。 2 材料和方法 2.1 实验鱼的来源、检测及驯养 实验所用的斜带石斑鱼5月龄，购自广东省大亚湾水产试验中心，重17.8±0.7 g，长9.5±0.6 cm，无刺激隐核虫感染记录。实验前，检查鱼鳃及体表皮肤，未见刺激隐核虫。为确认实验用鱼是否曾被刺激隐核虫感染过，随机抽取20尾鱼，检测其血清和皮肤培养液的阻动效价（方法见1.7），结果显示其血清阻动效价均不高于4，皮肤培养液的阻动效价为0，证实没有被刺激隐核虫感染过。实验开始前2周对实验鱼进行驯养。 2.2 刺激隐核虫幼虫的来源 实验所用的刺激隐核虫幼虫来自于本实验室的刺激隐核虫GD1株传代系统，该虫株最初是从广东省惠州市大亚湾网箱养殖的卵形鲳鲹身上获得，在本实验室被成功传代。在刺激隐核虫的传代过程中，幼虫脱包时，收集虫液，加100 µl.l-1的福尔马林杀死幼虫，混匀后吸取5份（每份50 µl），在显微镜下计数（图1，2），记算出幼虫的浓度，然后用离心机（KUBOTA 5100）3500 rpm离心10 min，收集在1.5 ml离心管里－80 ℃保存。 图2 收集到的幼虫 图3 收集到的幼虫 2.3 实验分组 实验分为2组，即对照组和感染组，每组各120尾鱼。整个实验过程水温均维持在27±0.5 ℃。养殖用海水均由600目筛绢网过滤，盐度29~32‰，溶氧＞5.0 mg/l，pH 7.9~8.3，亚硝酸盐<0.1 mg N/l。 2.4 免疫方法 分别于实验开始后的第0周和第2周分2次免疫实验鱼，免疫前先将幼虫解冻，加入适量的0.15 M PBS重悬，再与等量的福氏佐剂混合（Sigma），初次免疫用福氏完全佐剂，加强免疫用福氏不完全佐剂。用振荡器把混合液振荡至乳液状，然后腹腔注射，每尾鱼腹腔注射0.2 ml，含有20000个幼虫。 2.5 抗血清的制备方法 从第0周开始，每2周采样一次。采样时每个实验组随机抽取10尾鱼，用100 μl.l-1的丁香酚把鱼麻醉，每条鱼从尾静脉采血2 ml，分装于1.5 ml离心管中，做好标记，4 ℃过夜，然后10,000 rpm离心10 min (Eppendorf 5804R)，收集上层血清，56 ℃灭活30 min，按每管100 µl等份分装，－80 ℃保存, 二个月之内测定其阻动效价。 2.6 皮肤培养液的制备方法 每尾鱼采集血样后，在从体侧取500 mg完全皮肤组织（包括表皮层和真皮层），清除脂肪和肌肉，切成5×5 mm的小片，用Hank’s平衡盐溶液(Sigma)和Medium 199(Sigma)冲洗三次，将皮肤创面贴底平放于24孔组织培养板(Greiner bio-one)的板孔中，加入1 ml 组织培养液（95% Medium 199，5%的热灭菌胎牛血清，100 IU.ml-1的青霉素，100 µg.ml-1的链霉素），在培养箱中25 ℃静置培养24 h，收集培养液，2000 rpm离心10 min，取上清液，按每管100 µl等份分装，－80 ℃保存，二个月之内测定其阻动效价。 2.7 血清抗体和皮肤培养液阻动效价的测定 阻动试验在96孔组织培养板中进行。每孔先加入100 µl灭菌海水，然后第一孔加入100 µl抗血清或皮肤培养液，混匀，再从中吸取100 µl加入第2孔，混匀后再从中吸取加入第3孔，依此类推，以2倍数连续稀释抗血清或皮肤培养液。最后每孔同时加入100 µl幼虫液（含200个活跃的幼虫），室温孵育1 h后，用倒置显微镜（Olympus IX70）观察，使全部幼虫阻动的最高稀释倍数即为阻动效价，如果幼虫在第1孔（稀释倍数1:4）中都不能被全部阻动，则该样品的阻动效价记为0。 2.8 幼虫对实验鱼致死剂量的测定 幼虫对实验鱼致死剂量的测定在实验第13周进行，此时实验鱼平均重量达到了151.4±10.1 g (n=30)。从对照组随机抽取30尾鱼，分别用10×103、12×103、15×103、18×103、20×103、25×103幼虫.鱼-1的剂量感染卵形鲳鲹，每个剂量组感染5尾鱼，感染时海水用量为5 l.鱼-1，然后统计各组鱼的死亡率，能使全部实验鱼死亡的最低感染剂量即为致死剂量。 2.9 攻毒 实验第14周，分别从每个实验组随机抽取20尾鱼，作好标记后一起放入装有300 l水的饲养缸中，同时用致死剂量的幼虫（20×103幼虫.鱼-1）攻毒，然后统计各组实验鱼的死亡率。 2.10 数据统计方法 实验中的数据用SPSS11.0(SPSS Inc.)和Microsoft Excel (Microsoft Corp.)软件分析处理。 3 结果 3.1 抗体对幼虫的阻动过程 在阻动实验中，当幼虫加入含有抗体的抗血清或皮肤培养液中，一开始幼虫自由游动，慢慢地其纤毛相互交联，游动速度逐渐变缓，当它们游动过程中碰在一起时，彼此的纤毛粘在一起，造成虫体凝集，失去自由运动能力（图3-7），然后幼虫死亡，纤毛停止摆动，最后胞膜破裂，原生质外流。 图4 自由游泳的幼虫 图5 被阻动后凝聚成团的幼虫 图6 被阻动后凝聚成团的幼虫 图7 被阻动后死亡的幼虫 图8 被阻动后破裂解体的幼虫 3.2 抗血清阻动效价的变化规律 表1和图8的结果显示，在整个实验过程中对照组鱼的抗血清阻动效价水平都保持稳定，维持在0~1.2之间，该组实验鱼在实验中没有被刺激隐核虫感染过；幼虫注射组的实验鱼在接受初次免疫2周后血清抗体阻动效价就稍微上升，再次免疫2周后，血清抗体阻动效价急速上升，在第6周达到峰值，然后开始略微下降，第8~14周保持在一个较稳定的水平。 表1 经刺激隐核虫幼虫腹腔注射免疫后斜带石斑鱼抗血清的阻动效价 时 间 血清阻动效价（平均值±标准偏差） 对照组 幼虫免疫组 第0周 0.4±1.3 0.8±1.7 第2周 0.4±1.3 16.0±9.2 第4周 0.0±0.0 89.6±42.1 第6周 0.4±1.3 113.0±65.2 第8周 0.8±1.7 92.8±38.3 第10周 0.4±1.3 92.8±46.4 第12周 0.8±1.7 83.2±40.5 第14周 1.2±1.9 86.8±77.6 图9 经刺激隐核虫幼虫腹腔注射免疫后斜带石斑鱼抗血清的阻动效价 3.2  皮肤培养液阻动效价的变化规律 表2和图9的结果显示，在整个实验过程中对照组鱼的皮肤培养液阻动效价水平都维持在0~0.8之间，证明该组实验鱼在实验中没有被刺激隐核虫感染过；体表感染组的实验鱼在接受初次免疫2周后皮肤培养液阻动效价略有上升，再次免疫2周后，阻动效价显著上升，在第14周达到峰值。 表2经刺激隐核虫幼虫腹腔注射免疫后斜带石斑鱼皮肤培养液的阻动效价 时 间 皮肤培养液阻动效价（平均值±标准偏差） 对照组 幼虫免疫组 第0周 0.0±0.0 0.8±1.7 第2周 0.4±1.3 2.0±2.1 第4周 0.0±0.0 12.8±8.4 第6周 0.4±1.3 13.6±10.5 第8周 0.4±1.3 18.0±18.0 第10周 0.4±1.3 18.4±17.7 第12周 0.4±1.3 18.0±19.4 第14周 0.8±1.7 20.6±22.2 注：表中每个数据为10个样本的平均值。 图10 经刺激隐核虫幼虫腹腔注射免疫后斜带石斑鱼皮肤培养液的阻动效价 3.3 抗血清和皮肤培养液阻动效价的变化差异 图10显示，腹腔注射幼虫后，实验鱼的抗血清和皮肤培养液的阻动效价存在明显的差异：两者的最初生成时间、达到峰值的时间、变化规律等都不一致，并且在实验过程中，皮肤培养液的阻动效价一直显著低于抗血清的阻动效价。 图11 经刺激隐核虫幼虫免疫后斜带石斑鱼抗血清和皮肤培养液阻动效价的差异 3.4 致死剂量幼虫攻毒后各实验组鱼的死亡率 在确定幼虫对卵形鲳鲹的致死剂量实验中，我们发现幼虫感染剂量达到20×103个幼虫.鱼-1时就可以让全部的鱼死亡，因此把致死剂量定为20×103个幼虫.鱼-1。经致死剂量幼虫感染后各组实验鱼的死亡情况如表3所示。结果显示，对照组的实验鱼在5 d之内全部死亡，而腹腔注射幼虫后最终死亡率为60%，降低了40%。 表3 各组实验鱼经致死剂量幼虫（20×103个幼虫.鱼-1）攻毒后的死亡情况 实验组 实验鱼的死亡率(%) 实验鱼的存活率(%) 对照组 100 0 腹腔注射组 10 90 4 讨论 本研究的结果显示，腹腔注射刺激隐核虫幼虫能使斜带石斑鱼的血清和皮肤培养液产生阻动隐核虫幼虫的特异性抗体，并能使免疫鱼获得很好的免疫保护，这意味着刺激隐核虫的全虫疫苗可以成为防治海水白点病的一个有效途径。 与腹腔注射刺激隐核虫滋养体和包囊相比较，幼虫引发的系统免疫应答强度（即抗血清的阻动效价）和皮肤粘膜免疫应答强度（即皮肤培养液的阻动效价）都显著增高，这说明幼虫的免疫抗原性要比滋养体和包囊强得多。刺激隐核虫生活史的三个发育阶段中，只有幼虫期具有较好的免疫原性，而其它两个阶段免疫原性较差。可以将幼虫期作为首选来研制灭活疫苗，为防御和治疗刺激隐核虫病奠定了基础。所以，从我们的研究结果来看，刺激隐核虫病的预防和防治应该从幼虫期为出发，进行灭活疫苗疫苗或者基因工程疫苗的研究。 在本实验中，相同的免疫方法所引发的血清抗体和皮肤抗体的变化规律存在很大的差别，两类抗体的最初生成时间、达到峰值的时间以及阻动效价等都不一致，这说明鱼类的系统免疫应答和皮肤粘膜免疫应答是相互独立的。本研究中采用的就是他们的方法，在采样时，已经将皮下组织和体表粘液洗脱，培养液中的抗体只能由皮肤的淋巴细胞产生，排除了从血清中渗透到皮肤粘液中的可能性。这些实验都证实了血清抗体的产生与皮肤抗体的产生是相互独立的。很多实验都证实鱼类存在单独的粘膜免疫系统（Ainsworth et al., 1995; Cobb et al., 1998; Fletcher et al., 1969; Fletcher et al.,1973; Lobb et al.,1981; Lobb, 1987），但是皮肤抗体的诱导机制、分泌位置、产生过程以及怎样到达肠、鳃和皮肤表皮的，还有待进一步的研究。 致    谢     参 考 文 献 [1]  Colorni A, Burgess P. 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