生物反应器论文

植物生物反应器的研究进展及应用 摘要:随着生物技术的快速发展,以及人们对各种特殊蛋白质,脂质,糖类的需要,将植物体作为生物反应器生产有用的生化产物是当今生命科学技术研究中最热门的领域。本文主要介绍了植物生物反应器的研究现状,应用及展望。 关键字:植物生物反应器研究进展转基因植物 植物生物反应器是现代农业生物技术发展中备受关注的研究领域, 它是以常见的农作物作为制造工厂, 通过植物基因工程途径, 生产医用蛋白、工农业用酶、人体或者动物疫苗、特殊碳水化合物、脂类及其他一些次生代谢产物等生物制剂的高新技术。与煤炭、石油不可再生资源相比, 植物具有种类多样化、低成本、可再生等优势。通过自身光合作用积累的各类生物大分子(碳水化合物、蛋白质和脂肪等), 不仅为人类和动物提供了赖以生存所需要的各种食物, 同时还提供了大量非食用性的化工产品。国外采用植物生物反应器的方法, 已经成功地生产出多种高新生物产品, 包括特殊的饱和或不饱和脂肪酸、改性淀粉、环糊精、糖醇及药用蛋白多肽, 一些研究机构和公司已经开始从这些产品生产中获得巨大的经济效益。生物技术的快速发展使人类进一步拓宽了植物应用的范围, 尤其是农作物作为生物反应器的应用潜力巨大,利用转基因作物作为生物反应器来生产相关产品是一个备受关注的研究领域。随着新功能基因的分离、克隆以及各种农作物高效转化和达技术平台的逐步建立, 人类未来将会有相当数量的通过植物生物反应器生产的农业生物技术产品问世, 同时创造意想不到的产业体系和商业价值【1】。 1 植物生物反应器特点 最近10年, 许多研究证实植物系统具有表达活性哺乳动物蛋白的能力, 在产品质量、成本和安全方面已显现出优势,并很快得到科学家和生物制药业的认可。科学家预测,不久的未来, 植物生物反应器很可能成为生物化学药物及多种有用蛋白的重要生产系统。植物作为生产药用蛋白的生物反应器, 为人类提供了一个更加安全和廉价的生产体系, 与微生物发酵、动物细胞和转基因动物等生产系统相比, 它具有许多潜在的优势。以生物学生产要求很高的疫苗为例, 它的优点有: (1)技术较成熟, 成本低廉, 使用方便, 易于推广; (2)植物具有完整的真核细胞表达系统, 能准确地进行翻译后加工;(3)无须提取纯化过程, 可直接食用免疫; (4) 比传统的免疫途径更有效, 植物细胞中的疫苗抗原通过胃内的酸性环境时可受到细胞壁的保护, 直接到达肠内黏膜诱导部位, 刺激黏膜和全身免疫反应; (5)安全性好, 不需要注射器和针头之类的设备, 避免了某些血液传播疾病; (6)到目前为止还没有植物病原物感染人类或动物的报道, 因此植物生物反应器避免了人或动物潜在病原物的污染; (7)易于贮存和分发, 不需要冷藏设备, 适于大范围给药【2】。 2 植物反应器的应用 2.1利用植物生物反应器生产要用蛋白 随着各种药用蛋白质需求的不断增加,从动植物中直接提炼的蛋白质药物已经无法满足人们的需求。转基因蛋白质药物的出现,使现状得以缓解。1983年世界首例转基因植物的诞生,标志着人类用转基因技术改良农作物的开始。接着出现第一个植物来源的药用蛋白——人血清白蛋白。近二十年来,转基因植物作为生物反应器,成功表达了大量有价值的药用蛋白质,使得转基因药用蛋白质的工业化生产成为了可能,并呈现出极大的市场前景及商业价值,促进了医药领域的快速发展。目前,利用转基因植物生产药用蛋白质越来越受到关注,但重组蛋白质的表达量低一直制约着工业化的生产【3】。 2.1.1植物反应器表达系统及其宿主的选择 植物反应器是利用植物悬浮细胞培养或以整株植物作为工厂,大量生产具有重要功能的蛋白质,相比于细菌发酵和动物细胞培养具有更加优越的条件。目前能够在植物体内表达的 药用蛋白质种类很多,不同的宿主植物各有优缺点。如生产疫苗,可以选择直接食用的植株、果实或种子,减小下游分离纯化蛋白质带来的成本。利用番茄表达Norwalk病毒衣壳蛋白,经口服能引起免疫反应。苜蓿叶片能正确表达具有活性的糖蛋白,可为某些疾病提供口服疫苗。虽然植物叶片能够大量表达药用蛋白质,但表达的药用蛋白质具有一定的不稳定性,易受到破坏。种子能提供一个保存外源蛋白质的天然环境。用苔藓作为生物反应器能减少培养成本和对环境的污染。德国的Greenovation公司就是用苔藓作为生物反应器生产抗体、LSD-酶(LSD-enzymes)、疫苗等各种药用蛋白质而发展起来的公司。不同的植物宿主具有各自独特的特点,需根据重组蛋白质的性质及用途选择高效的宿主植物【3】。 2.2利用植物生物反应器生产转基因植物可食疫苗 利用转基因植物作为生物反应器规模化生产可食疫苗是一个新兴的研究领域。随着生物技术的不断发展,植物生物反应器将会成为疫苗生产的有效途径。 2.2.1转基因植物可食疫苗的植物表达系统 外源性目的基因通过植物表达系统在植物细胞中稳定表达和正确组装,是生产转基因植物可食疫苗成功的关键。目前的植物表达系统主要有以下两大类。 2.2.2植物细胞基因组表达系统:该系统的特点是操作简便,重组蛋白产物置于种子或块茎中易于保存,尤其适合多价疫苗和多聚重组抗体的生产。Guerrero-Andrade 等将鸡新城疫病毒融合蛋白基因转入玉米中,使其在ubiquitin 启动子的调控下表达,饲喂雏鸡后,发现雏鸡体内有抗体产生。由于外源性目的基因整合入植物基因组中,因此可用传统的育种技术来培育转基因种子,容易稳定储存,扩大栽种。 而且还可通过不同转基因植物的杂交,将多个外源基因储存在同一植株中。 2.2.3植物病毒表达载体:该表达系统是应用植物病毒感染植物,使其在植物细胞中独立复制、转录、翻译生产重组蛋白质。其技术路线更为快捷,产量更高,且对植物栽种面积需求量较小。外源性基因通过改良植物病毒,既可被表达为可溶性蛋白而分布于宿主植物细胞胞浆内,也可与植物病毒衣壳蛋白基因融合,随着感染态重组病毒的复制、装配而持续在病毒颗粒中表达。目前已有数种改良植物表达载体 问世,其中最成功的是烟草花叶病毒(Tobacco mosaicvirus,TMV)和豇豆花叶病毒(Cowpea mosaic virus,CPMV)。Kohl 等【4】以TMV 作为载体,在烟草中瞬时表达白尾棕色兔乳头状瘤病毒L1 衣壳蛋白基因,L1蛋白在TMV 侵染植株中的表达量达0. 4 mg / kg。将烟草的蛋白提取物注射到家兔体内,能产生免疫应答。Dalsgaard 等【5】采用CPMV 表达载体构建了编码水貂肠炎病毒衣壳蛋白的一段含l7 个氨基酸的表位嵌合病毒,将其感染黑眼豆(Vigna ungceiculata),每10 g 鲜豆能生产重组肽1 ~ 1. 2 mg。Langeveld等【6】利用CPMV 研制出保护狗免受致死性犬细小病毒侵害的疫苗。另外,还有一些可用作表达载体的植物病毒,如番茄丛矮病毒(Tomato bushy stunt virus,TBSV)和紫花苜蓿花叶病毒(Alfalfa mosaic virus,AIMV)等。 2.3转基因植物可食疫苗的研究现状 目前在植物中成功表达的动物和人类疫苗有几十种。迄今为止,在转基因植物中表达的用于疫苗研究的病原基因主要有乙型肝炎表面抗原(HBsAg)基因、大肠杆菌热敏肠毒素B 亚单位(LT-B)基因、狂犬病病毒糖蛋白(G 蛋白)基因、口蹄疫病毒VP1 基因、轮状病毒基因等。 2.4转基因植物可食疫苗研究中存在的问题 目前,利用转基因植物生产植物可食疫苗的研究已取得了重大进展,许多技术问题已得到解决,但仍存在以下问题:食用安全性问题口服时少量抗原消化降解受体植物种类的选择外源蛋白表达量低【7】 3我国植物生物反应器研究展望 我国对现代植物生物反应器的研究时间虽短, 但是发展迅速, 部分已达到国际先进水平。如20世纪90年代初, 我国开始用番茄或马铃薯表达乙肝疫苗的研究, 目前已经获得成功。 尽管我国在构建高效植物表达载体和培育转基因植物等主要技术环节上与国外相差无几, 但在基础理论、自主知识产权和综合技术平台等环节与发达国家相比却存在很大差距。因此, 我国植物生物反应器领域的研究需要加强基础和原创性研究, 同时还需要政府资金及政策的大力支持。我国 五 五 划以及863 项中, 与转基因植物生物反应器相关的项目很多, 也取得了很大成绩。例如用TMV载体大量表达与TMV外壳蛋白融合的多个口蹄疫病毒表面抗原小肽, 获得了表达乙肝病毒包膜蛋白的马铃薯和番茄基因工程植株, 并开始进入环境释放阶段, 以及用植物生物反应器表达降钙素和人乳铁蛋白等功能蛋白等。 国家应从宏观方面加强植物生物反应器的研究与产业化步伐, 根据市场对当前和长远产品需求, 进行合理布局, 有选择地重点突破。要重点资助发展拥有自主知识产权的生物物质基因及生产技术, 从研究方面要发掘更多有价值的基因, 并为它们构建合理、高产、有市场前景的转基因生物反应器, 建立高效表达的技术平台及转基因载体系统; 从生产应用方面要重视多种有价值的产品, 还要考虑在如何提高产量的同时降低成本、如何纯化所需生物活性产物、如何提高商业化程度以大范围推广等问题; 还特别要注意的是, 作为转基因植物,研究和生产时必须密切注意生物安全性与管理, 避免转基因植物对生态环境造成不利影响。 参考文献 【1】庞俊峰1, 3 黄东光2 吴燕民1 植物生物反应器研究进展生物技术通报 2011年第1期 【2】陈瑞栋植物生物反应器研究现状和展望江苏农业科学 2009年第6期 【3】李文荣郑克勤利用植物生物反应器生产药用蛋白质《生命的化学》2012 年32 卷2 期 【4】Kohl T, Hitzeroth II, Stewart D, et al. Plant-produced cottontailrabbit papillomavirus L1 protein protects against tumor challenge: aproof-of-concept study. Clin Vaccine Immunol, 2006, 13 (8):845-853. 【5】Dalsgaard K, Uttenthal A, Jones TD, et al. Plant-derived vaccineprotects target animals against a viral disease. Nat Biotechnol,1997,15(3):248-252. 【6】Langeveld JP, Brennan FR, Martinez-Torrecuadrada JL, et al. Inactivatedrecombinant plant virus protects dogs from a lethal challengewith canine parvovirus.Vaccine, 2001, 19(27): 3661-3670. 【7】曲静1 王丕武2 范玉广3植物生物反应器生产转基因植物可食疫苗的研究进展中国生物制品学杂志2010 年1 月第23 卷第1 期