HPLC法同时测定心复康口服液中丹参素和原儿茶醛的含量

HPLC法同时测定心复康口服液中丹参素和原儿茶醛的含量 HPLC法同时测定心复康口服液中丹参素 和原儿茶醛的含量 西北药学杂志2010年8月第25卷第4期267 普通的CTAB法提取DNA步骤简单,成本低, 在植物DNA的提取中应用比较广泛,但其主要用于 不含酚类或酚类较少的植物的DNA提取,加预处理 液能除去大部分可溶性蛋白,糖类,多酚,DNA酶等, 将细胞核质基本分离,使在前期能得到高纯度的 DNA,且不易断裂[1,对后期的PCR实验影响较小. 退火温度是影响PCR特异性的重要因素,它取 决于引物的长度,碱基组成及其浓度.本实验进行退 火温度的考察时在45?到60?之间共设置了12个 梯度,并对每个引物都分别进行了探索. 利用正交设计优化PCR反应体系能迅速得到最 佳的实验条件组合,但不能很好地估计实验误差,对 结果的评价带有一定的主观成分n,使各因素最佳 反应水平的确定缺乏一定的可靠性.笔者在初始优 化反应体系阶段还采用了单因素PCR优化对各个影 响因素逐一进行研究,并综合分析优化反应体系.其 中9,7,8号谱带依次增强,其原因是由于酶的增加. 2,6,7r酶量相同,谱带随Mg和dNTP的浓度增加 而增加,当Mg抖浓度过高时出现模糊的边缘,产生 背景使条带混连.3号条带较弱可能是Mg浓度相 对于dNTP浓度过低,由于dNTP能与Mg抖结合使 得游离的Mg进一步减少,从而影响了酶的活性. 第8泳道较清晰,背景较小.以主带清晰,副带明显 为原则,即采用模板30ng,Mg3.5mmol?L_., dNTP0.6mmol?L一,弓I物0.4肛mo1?L一,Taq酶 1U的25L反应体系. ISSR—PCR反应堆模板浓度的要求范围较宽. 冯富娟等[1]在进行红松ISSR—PCR反应体系优化时 证实模板浓度不会影响扩增结果,模板浓度在1O, 200ng?L扩增结果相同.但是笔者通过实验结 果表明,九眼独活的扩增体系对模板用量要求较严 格.在30~80ng扩增条带较清晰,超过120ng会 出现非特异性扩增,产生模糊的小片段,且通过紫外 测量DNA浓度表明,在大致相同质量的原料,采用 相同的提取方法的条件下,DNA浓度差别也非常大, 作者认为是提取过程中反复离心取上清过程及最后 的洗涤DNA过程中对DNA造成的损失量不同.因 此在进行PCR条件探索及优化过程中,非常有必要 对DNA模板的含量进行测定并进行不同浓度梯度 的结果比较. 本实验在确定了最佳组合后,对不同的模板用量 又单独进行了比较研究,结果表明3O和60ng都可 以扩增出比较清晰的条带.考虑到原料较稀少,最终 决定用3Ong作为模板用量. 由于九眼独活的来源比较混乱,因此十分有必要 对其主流品种进行遗传学研究,本实验为九眼独活进 行ISSR分子标记奠定了基础. 参考文献: [1]王忠壮,苏中武,郑汉臣,等.中药独活,九眼独活及羌 活的本草考证和资源调查[J].中国中药杂志,1995,20 (9):515. [2]陈珂,陈国娟.ISSR技术及其在植物遗传多样性研究 中的应用[J].安徽农学通报,2009,15(16):28. [3]侯大斌.乌头基因组DNA提取和RAPD反应体系的 优化[J].西南科技大学,2005,20(2):70—74. [4]唐玉海,郭春芳,张木清.一种提取茶树基因组DNA的 方法——改良的CTAB法[J].福建教育学院, 2007,(1):99-101. [5]王忠壮,汤海峰,苏中武,等.中药九眼独活的显微鉴定 及化学成分分析EJ].第二军医大学,1997,18(4): 153—156. 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(收稿日期:2010-04—01) HPLC法同时测定心复康口服液中 丹参素和原儿茶醛的含量 黄敬群,宋扬(1.第四军医大学药学系药物研究所, 陕西西安710032;2.保定市药品检验所,河北保定 071051) 摘要:目的采用HPLC法同时测定心复康口服液中丹参素 和原儿茶醛的含量.方法以C18柱(250mm×4.6mm,5 "m)为色谱柱,以乙腈一0.5冰醋酸水溶液(14:86)为流动 相;流速为1.0mL?rain,,波长为280nm,柱温为25 ?.结果丹参素在25,200mg?L_1范围内与峰面积呈良 好的线性关系,回归方程为Yl=8.155×10Xl—1.341×10, r1—0.9998;平均回收率为99.0,RSD为1.1;原儿茶醛 在2.5,20mg?L范围内与峰面积呈良好的线性关系,回 归方程为Y2—5.353×10X2—9.460×10,r2—0.9999,平 均回收率为97.9,RSD为1.3(一5).结论该方法简 便,精确,专属性强,可用于心复康口服液的质量控制. 关键词:HPLC法;心复康口服液;丹参素;原儿茶醛 doi:10.3969/j.issn.1004—2407.2010.04.015 中图分类号:R927.2文献标志码:A 2010)04—0267—03 文章编号:1004-2407《 268西北药学杂志2010年8月第25卷第4期 心复康口服液是由丹参,黄芪,附子,淫羊藿,灵 芝等9味中药材经提取,精制而成的中药复方制剂, 具有活血化瘀,益气温阳的功效,临床上对冠心病,心 绞痛具有较好的治疗作用,并且没有硝酸酯类药物所 致头胀痛等不良反应.丹参为制剂的君药,其水溶性 成分丹参素和原儿茶醛在扩张心脑血管,抗血小板聚 集,清除氧自由基等方面较二萜醌类作用强,而且是 抗心脑缺血的主要成分n].为了控制产品质量,笔者 建立了HPLC法同时测定丹参素和原儿茶醛的含 量,具有专属性好,灵敏度高,简便易行的特点. 1仪器与试药 1.1仪器岛津LC一10ATvp高效液相色谱仪:包 括SPD-10Avp紫外可见检测器,CLSS-VP色谱工作 站,CTO一10ASvp柱温箱,7725i手动进样器(日本岛 津公司);KS-1500超声波清洗机(宁波科电仪器厂). 1.2试药丹参素对照品(中国药品生物制品检定 所,批号110855—200809);原儿茶醛对照品(中国药 品生物制品检定所,批号110810—200506);心复康口 服液(北制字(2009)F17008,解放军第252医院药剂 科,批号20090128,20090526,20090806,20091110, 2O091218);甲醇,乙腈(色谱纯,天津市科密欧化学试 剂有限公司);冰醋酸为分析纯(天津市耀华化工厂); 水为三蒸水(自制). 2方法与结果 2.1色谱条件与系统适用性实验色谱柱采用岛津 VP-ODSC18(250mmX4.6mrn,5m)色谱柱;流动相为 乙腈一0.5冰醋酸溶液(14:86);流速1.0mL?min,; 检测波长280am;柱温25?,进样量2OL.在此色 谱条件下,丹参素和原儿茶醛与其它峰能达到较好的分 离,理论板数按丹参素计算不低于4000,按原儿茶醛计 算不低于5500. 2.2对照品溶液的制备精密称取丹参素对照品 5.01mg,置于10mL量瓶中,加0.5冰醋酸溶解并 稀释至刻度,得质量浓度为0.501g?L的丹参素 对照品溶液. 精密称取原儿茶醛对照品5.03mg,置于100 mL量瓶中,加0.5冰醋酸溶解并稀释至刻度,得质 量浓度为0.0503g?L-1的原儿茶醛对照品溶液. 2.3供试品溶液的制备精密量取心复康口服液 1.0mL,置于25mL量瓶中,加0.5冰醋酸溶液稀 释至刻度,充分混匀,0.45m微孔滤膜过滤,即得. 2.4阴性对照实验取不含丹参药材的阴性样品, 按2.3项下方法制备阴性对照溶液并测定,记录色谱 图.结果在丹参素和原儿茶醛相对应的位置上未见 色谱峰.对照品溶液,供试品溶液与阴性对照色谱图 见.图1. Ii ^^^ 02468l0l214 t/min C 圈1HPLC圈 A一丹参素和原儿茶醛对照品;B-心复康口服液样品; C_阴性对照;1-丹参素;2-原儿茶醛 2.5线性关系考察分别精密吸取质量浓度为0.501 g?L的丹参素对照品溶液和质量浓度为0.0503 g?L的原儿茶醛对照品溶液0.5,1.0,1.5,2.0和 4.0mL置10mL棕色量瓶中,加0.5冰醋酸稀释 至刻度,分别进样2OL,测定峰面积,以峰面积(y) 为纵坐标,以对照品溶液质量浓度(x)为横坐标,绘 制曲线,丹参素与原儿茶醛的回归方程分别为: Y1===8.155×10X1—1.341×10,l一0.9998 Y2==:5.353×10X2—9.460×10.,z一0.9999. 结果表明,丹参素质量浓度在25200rng?L『 内与峰面积呈良好的线性关系,原儿茶醛质量浓度在 2.5,2Omg?Lr1内与峰面积呈良好的线性关系. 2.6精密度实验取质量浓度为0.075g?L丹 参素和质量浓度为0.0075g?L原儿茶醛的混合 对照品溶液,重复进样5次,丹参素峰面积的RSD为 1.15,原儿茶醛峰面积的RSD为1.35. 2.7稳定性实验取同一份供试品溶液,分别在0, 2,4,6,8,12和24h进样测定,记录峰面积,结果丹 参素峰面积的RSD为1.O6,原儿茶醛峰面积的 RSD为0.62%,表明样品溶液24h内稳定. 2.8重现性实验分别精密称取同一批次样品 (20090526)5份,按2.3项下方法平行制备5份样 品,按2.1项下色谱条件进行测定.测得丹参素含量 的平均值为1.201g?L_.,RSD为0.47;原儿茶 醛含量的平均值为0.104g?L_.,RSD为1.47. 结果表明测定方法的重现性良好. 2.9加样回收率实验精密量取同一批次(20080526) 已知含量心复康溶液0.5mL,按大约样品含量的 80,100和120分别加入不同浓度的丹参素和 原儿茶醛对照品溶液适量,按2.3项下方法制备供试 品溶液,按2.1项下色谱条件进样分析,由测得量与加 入量计算回收率,结果见表1,表明方法回收率良好. ln?B 4 4 B n O 西北药学杂志2010年8月第25卷第4期 表1丹参素和原儿茶醛加样回收率测定结果(n=6) 2.1O样品含量测定取5批样品,按2.3项下方法 制备供试液,测定,计算丹参素和原儿茶醛的含量,结 果见表2. 表2丹参素和原儿茶醛含量测定结果(,l=5) 3讨论 ?含量测定成分的确定中药复方是多种化学 成分共同作用而发挥药效,单一成分含量的高低不能 全面反映中药复方的药效.心复康口服液是丹参等 药材经过水提醇沉制备而成,故将君药丹参中的水溶 性成分丹参素和原儿茶醛作为含量考察指标之一,用 HPLC法测定其含量,可用于本品的质量控制. ?流动相的选择丹参水溶性成分主要是酚酸 类化合物,在中性流动相中易发生离解,使含量偏低 且拖尾严重口].因此,一般情况下,HPLC法测定药 材或制剂中丹参素或原儿茶醛的含量多采用甲醇一冰 醋酸一水系统[1,或乙腈一磷酸一水系统口],以反相离 子抑制技术,在流动相中加入少量冰醋酸或磷酸,抑 制其解离并改善峰形和分离度,二者均能够满足多数 样品的分离要求.但实验中发现,甲醇与水混合,压 力明显增高,而乙腈与水混合并不如此.与甲醇相 比,乙腈的洗脱能力强,且黏度较小,柱压大小比较合 适,可以满足色谱系统流速在1.0mL?min条件下 检测的要求,并且系统分离效果较好,峰形对称,柱效 高,保留时间适宜.因此,综合来看,乙腈一冰醋酸水 系统要优于甲醇一冰醋酸水系统.而且,实验中考察 了冰醋酸的浓度从0.5,1.0范围内对峰形的影 响,发现在此范围内随着冰醋酸浓度的增高,峰形的 改善并不明显,从保护色谱柱的角度考虑,决定采用 乙腈一0.5冰醋酸溶液作为流动相. ?检测波长的选择经过紫外光谱扫描,丹参素 和原儿茶醛最大吸收波长分别为280和279nm,考 虑到这2种成分的吸收波长相近,所以选取280nm 为检测波长,同时测定丹参素和原儿茶醛的含量. ?供试品溶液制备条件的选择为保证丹参素 和原儿茶醛这2种成分都能提取完全,实验中比较了 心复康口服液分别和甲醇,0.5~/I冰醋酸溶液各以1: 14的体积比例混合,超声30min,过滤进样,以及同 比例混合,不经过超声,充分混匀稀释后直接过滤进 样.实验发现,上述4种制备条件下,丹参素和原儿 茶醛的峰面积积分值无明显差异.又通过与加热回 流进行比较,甲醇热回流2h提取与用0.5冰醋酸 溶液稀释后直接进样结果相近,而稀释方法操作更为 简便易行.因此,本实验选择最简便的2.3项下的供 试品溶液制备方法. ?对照品溶液制备条件的选择笔者曾经比较 了用甲醇和0.5冰醋酸水溶液分别配制的丹参素和 原儿茶醛对照品溶液进样后的色谱峰,发现0.5冰 醋酸水溶液的峰形明显好于甲醇.分析原因如下:(1) 据报道丹参素在高浓度醇性溶液中极不稳定,溶解度 偏低.而且丹参素具有一定的酸性,醋酸能抑制酸性 物质离解[5].(2)很多实验中用流动相溶液溶解对照 品,所得的色谱峰峰形比较理想.本实验流动相中 0.5%冰醋酸的比例占86,更近似于流动相溶液成 分,故本实验用0.5冰醋酸水溶液配制丹参素和原 儿茶醛对照品溶液. 参考文献: E1]王玉团,彭艳丽,李勇.HPLC法测定注射用丹香冠心中 丹参素钠和原儿茶醛的含量[J].食品与药品,2007,9 (5):21—23. 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