木质素降解菌株产木质素降解酶的研究

木质素降解菌株产木质素降解酶的研究 1，2，3 1 1，， 红 张晓甜刘 明 燕 ( 1, ，15004;0 2, ，哈尔滨理工大学 化学与环境学院哈尔滨 黑龙江省农业科学院 博士后科研工作站哈尔滨 15008; 6 3, ，150040)东北林业大学 生物学博士后科研流动站哈尔滨 : ，15 , 1 14 , 7摘 要采用液体静止培养通过对分离筛选获得的两株高效木质素降解菌株 和 ，: ，， 的发酵产木质素酶条件进行优化得出结论两株菌的最佳碳源均为稻草最佳氮源均为尿素最佳 30 ? 。，14 , 7 温度均为 在最佳培养条件下进行发酵产酶测得 的木素过氧化物酶和锰过氧化物酶 , 1 , 1 0. 350U mL 0. 080U mL ; 15 , 1 ??活力分别为 和 而 的木素过氧化物酶和锰过氧化物酶活力 , 1 , 1 0. 300U mL 0. 072U mL 。??分别为 和 : ; ; ; ; ; 关键词木质素降解菌木质素酶优化木素过氧化物酶锰过氧化物酶漆酶 1001 , 7011( 2011) 06, 0845 , 03:Q939, 9::A中图分类号文献标志码文章编号 0 前言 ，，，木质纤维素作为一种潜在的可再生资源具有很大的利用空间但其生物降解比较困难纤维素的降解 。，。、关键就在于木质素的降解大量研究明白腐菌对木质素有良好的降解效果但从自然界分离筛选出的 ，，天然菌株往往产酶能力较弱因此有必要对其发酵产酶条件进行优化通过改变培养条件来提高酶的产量在 。，实际应用中仍是一种普遍采用的本实验室前期分离筛选获得了两株可降解木质素的真菌菌株本文 ，、、。采用液体静止培养对菌株发酵的碳源氮源温度条件进行研究 1材料与方法 试验菌株 1. 1 14 , 7 15 , 1 。，，、 菌株 和 由本实验室分离筛选获得试验器材为恒温培养箱分光光度计恒温水浴锅高 、。压蒸汽灭菌锅离心机等 1. 2培养基及培养条件 1. 2. 1( PDA) 斜面保存和扩增培养基 g200 g 1 L，30 min ，。20 g 3，，取 土豆加入蒸馏水 文火煮 后冷却挤出汁液在汁液中加入 葡萄糖 KHPO，1. 5 g MgS，O15 g VB，，1 000 mL，pH 6。琼脂 和微量 加热溶解定容至 调 值为 2 4 4 1 ,1,( KirK ) 1. 2. 2液体发酵产酶培养基培养基 , 1 , 1 , 1 g ? L KH PO ，0. 05 g ? L MgSO ?7H O，0. 01g ? L CaCl ，( Basal medium) ? 0. 2基本培养基 2 4422 1, 0 mL，0. 5 mL 。无机溶液维生素溶液 , 1 , 1 , 1 ( Mnera souton) ? 1. 5 gL 3. 0 gL MgSO 7H O，0. 5g L illi，????无机溶液氨基三乙酸酯424 , 1, 1, 1 MnSO ， 1. 0 gN aCl，0. 1 g FeSO7HO，0. 1 g CoS，O0. 082g L CaCl，0. 1 gL ZnSO，0. 01g L CuSO????? 4 2 4 2 4 4 , 1 5HO，0. 01g L KA( SO) ，0. 01 gH BO，0. 01 g NMaoO。l?2 4 2 3 3 2 4 , 1 , 1 , 1 , 1 ( Vitamin solution) ? 2 mgL 2 mgL mgL VB ，5 mgL VB ，10 mg?，?，5 ???维生素溶液生物素叶酸 12 , 1 , 1 , 1 , 1 , 1 , 1 L VB ，0. 1 mgL VB ，5 mgL mgL DL , 5 mgL 5 mgL ，5 ，，?????烟酸泛酸钙对氨基苯甲酸硫 612 2010 , 04 , 20: 收稿日期 : 2008 ( 11531045)基金项目年度黑龙江省教育厅科学技术面上项目 : ( 1976 ,) ，，，，: 作者简介燕 红女副教授博士主要研究方向环境微生物与生物化学 。辛酸 , 1 , 1 1. 2 omlL ; 1% ( ) ; : 20 mmolL DMS; pH :??氮源为 酒石酸铵碳源为 质量浓度葡萄糖缓冲成分的 值 4. 5。 1. 3发酵产酶试验 PDA ，28? 。1, 0 cm 150 mL 挑取菌株斜面培养物于 平板上培养至产生成熟孢子取 直径的菌塞接入 三 角( 30 mL KirK ) 。28 ? 7 d，( 瓶装有 培养基中于 静止培养 测定发酵液中的各木质素酶组分的活性平行操 作 3 ) 。，。，次然后取平均值根据研究需要具体参数的变动将在文中指出 1. 4粗酶液的制备 , 1 3 000 ?rmin 15 min ，。 发酵液于 下离心 后取上清液即为粗酶液 1. 5 各种木质素酶活力的测定 ( LiP) 1. 5. 1木素过氧化物酶活力的测定 , 1 , 1 1, 0 mL 0. 125mo lL pH 3. 0 0. 160 ommlL AzureB L?，500 L ?，500 的 值 的柠檬酸缓冲液μ的 溶液μ , 1 ，30 ? 500 2 mmolL 651 nm 3 min OD L ?H O ，粗酶液于 加入 μ的 溶液启动反应于 处测定反应最初 内 值 2 2 ,1 , 3,0. 1 OD 1 。，的变化量以每分钟每毫升反应体系降低 个 值定义为 个酶活力单位 1. 5. 2 ( MnP) 锰过氧化物酶活力的测定 , 1 , 1 3. 4 mL 0. 05mo lL pH 4. 5 0. 1 mL 1. 6mm olL MnSO 0. 4 mL ?，?，的 值 的醋酸缓冲液的 溶液的粗 4 , 1 37 ? 0. 1 mL 1. mm6 olL 240 nm 3 min OD ，?H O ，酶液于 加入 的 溶液启动反应于 处测反应最初 内 值的 2 2 ,4, 0. 1 OD1 ，。变化量以每分钟增加 的 值表示 个酶活力单位 240 1. 5. 3( Lac) 漆酶活性的测定 , 1 pH 5. 0 0. 1 omlL ABTS 2 mL，1 mL ，OD ?用 值 的 醋酸缓冲液配制的 加入 酶液后启动反应测 的变 420 ,5,1 mol ABTS 1 。，化以每分钟转化 μ的 所需的酶量来表示 个酶活力单位 2结果与讨论 2. 1 不同氮源对产酶的影响 ，、、、，14 , 7、15 , 1 在固定碳源为葡萄糖氮源分别为尿素蛋白胨硝酸铵酒石酸的情况下将菌株 分别接 Kirk 28 ? 7 d，、，，种于 培养基于 静置培养 然后分别测定其木素过氧化物酶锰过氧化物酶及漆酶活性其结 1。果见表 ) 1 UmL )1 (?表 不同氮源条件下两菌株所产木质素酶活 ) 1 Table 1 Ligninase activities of two strains under different nitrogen source(UmL ) ? 菌株氮源( LiP)( MnP)( Lac)木素过氧化物酶锰过氧化物酶漆酶 0. 330 00. 577 00. 000 3尿素 蛋白胨0. 133 00. 183 00. 009 7 14 , 7 硝酸铵0. 006 00. 067 00. 000 0 0. 320 00. 567 00. 004 9酒石酸铵 尿素0. 300 00. 067 00. 000 0 蛋白胨0. 180 00. 037 00. 009 8 15 , 1 0. 090 00. 000 00. 019 8硝酸铵 2. 2 不同碳源对产酶的影响 ，、、，14 ,7 、15 ,1 irk K在固定氮源为尿素碳源分别为葡萄糖麸皮稻草的情况下将菌株 分别接种于 28 ? 7 d，、，，培养基中于 条件下静置培养 分别测定其木素过氧化物酶锰过氧化物酶及漆酶活性其结果 2 。见表 2 14 , 7 ，表 中的实验数据表明菌株 碳源为葡萄糖时其产锰过氧化物的能力大于其产木素过氧化物酶 ，，的能力而碳源为稻草时其产木素过氧化物酶的能力却大于其产锰过氧化物酶的能力碳源为稻草时其产漆 。15 , 1 ，酶的能力大于碳源为葡萄糖时产漆酶的能力菌株 碳源为麸皮时其产木素过氧化物酶的能力较强 、。而碳源为稻草时其产锰过氧化物酶的能力和产漆酶的能力均大于碳源为葡萄糖麸皮时的产酶能力当碳 ，14 , 7 15 , 1。源为稻草时菌株 产木素过氧化物酶和产漆酶的能力均大于菌株 且两株菌在碳源不同时产 。，。漆酶的能力都较弱综合分析选择稻草作为这两株菌的碳源 2. 3不同温度对产酶的影响 ，14 ,7 、15 ,1 Kirk 28 ? 、在碳源和氮源分别为稻草和尿素的条件下将 两株菌在 培养基中分别置于 30 ? 、32 ? 7 d，、，3。下培养 然后分别测定其木素过氧化物酶锰过氧化物酶及漆酶活性其结果见表 ) 1 ) 1 UmL )UmL )2 (3 (??表 不同碳源条件下两菌株所产木质素酶活表 不同发酵温度下两菌株所产木质素酶活 Table 2 Ligninase activities of two strains under Table 3 Ligninase activities of two strains under ) 1 ) 1 different carbon source(UmL ) different temperature(UmL ) ?? ( LiP)( MnP)( Lac)( ? )( LiP)( MnP)菌株碳源菌株木素过氧化物酶锰过氧化物酶漆酶温度木素过氧化物酶锰过氧化物酶 0. 347 00. 770 00. 000 3280. 3470. 080葡萄糖 14 , 70. 047 00. 000 00. 015 214 , 7300. 3500. 080麸皮 0. 550 00. 000 00. 042 3320. 3000. 097稻草 0. 247 00. 070 00. 000 0280. 2000. 070葡萄糖 麸皮15 , 10. 480 00. 193 00. 000 015 , 1300. 3000. 072 稻草0. 100 00. 237 00. 008 0320. 2300. 050 3 14 , 7 30 ? ，培养条件下产木素过氧化物酶的能力大于其在其他温度下表 中的实验数据表明菌株 在 ，30 ? 32 ? 培养时的产酶能力但其在 培养条件下产锰过氧化物酶的能力却小于其在 培养条件下的产酶能 。15 , 1 30 ? 力菌株 在 培养条件下产木素过氧化酶和产锰过氧化物酶的能力均大于其在其他温度条件下 。14 , 7 30 ? 15 ,的产酶能力且菌株 培养条件下产木素过氧化酶和产锰过氧化物酶的能力均大于菌株 在 1 30 ? 。。的产酶能力由此可以说明适宜菌株生长的温度宜选 3结论 1, ，，30 ? 。两菌株产木质素酶的最适碳源为稻草最佳氮源为尿素最佳温度为 , 1 2, ，14 , 7 0. 350U mL ，?在最佳培养条件下进行发酵产酶测得 的木素过氧化物酶活力为 锰过氧化物酶 , 1 , 1 , 1 0. 080U mL ; 15 , 1 0. 300U mL ，0. 072U mL 。???活力为 的木素过氧化物酶活力为 锰过氧化物酶活力为 参考文献 ,1,, ,M,, : ，2005: 106 , 108,李慧蓉白腐真菌生物学和生物技术北京化学工业出版社 ,2,，，, ,J,, ，1990( 3) :189 , 190, 季立才王光辉胡培植漆树漆酶的新底物自然杂志 ,3,TIEN M，KIRK T K, Lignin ,d egrading enzyme from Phanerochaechtety sosporium: purificatin characterization and catalytic properties of a unique HO,r equrng oxygenase,J,, Proceedng of theN atona Academy ofc Sences，1984，81( 8) : 2280 , 2284,iiiili 2 2 ,4,李越中，高培基，王祖农, 黄胞原毛平革菌合成木素过氧化物酶的营养调控,J,, 微生物学报，1994( 1) :29 , 36, ,5,GLENN J K，GOLD M H, Effect ofv arious media and supplements on production by some hwite rot fungi,J,, Bioresour Technol，2001，77( 1) : 89 , 91, (852 )下转第 页 ,9, 王玉婷, 甜菜 BvM14 )M ADS box基因启动子的克隆及瞬时表达分 析,D,, 哈尔滨: 黑龙江大学，2009, ,10, , ,D,, : ，2006,周 静外源基因在转基番茄后代中遗传和表达特性的研究哈尔滨哈尔滨师范大学 ,11, JEFFERSON RA，KAVANAGH TA，BEVAN M W, GUS fusions: b )g lucuronidase as a snesitive and versatile gene markeinr higher plants ,J,,Eu ropeanM olecular Biology Organization Journal，1987，6: 3901 ) 3907, ssuespecc expesson of Bv14ADS box gene pomoe Ti-ifiriM-Mrtr 1 1 1 1 1，2 ZHAO Chen-xi， LI Pei-jin， WU Chuan， WANG Yu-guang， LI Hai-ying( 1, Key Laboratory Moof ecuar Boogy，Coege of Heongang Provnce，Coege of Lfe Scences，Heongang Unversty，Harbn 150080，Chna; llillliljiilliiiljiiiii2,En gineering Research Center Aogfr icultural Microbiology Technology，Ministry of Education，Heilongjiang University，Harbin 150500，China) Abstract: The members MofA DSbox family have idfferent spatial and temporal expression patternsin flower meri- - stem，fora organs and av arety of vegetatve organs，and ayp dfferent functons, n prevous study，theB vM14lliiliiIi- MADS boxpro moter Pbm wcason ed and madeit transent expresson，but ddnt verfed ts expresson patterni n liiiiiii’ dfferent tssues of thet ransgenc tobacco, The tobacco thw the engneeed grobacterum tumefacens EHA105 was iiiiiAiitransformed thatcon tained the recombinant plasmid pBI121-Pbm-GUS with the promoter Pbmrepl aced the 35Sp ro- moter, Followed selecting the positive plants，the expression of GUS in different tissues of transgenic tobaccow as tested, The result showed that theGU Sgene o nly can be expressiedn s epal，but not in leaf，stem andr oot，indica- ting that theB vM14-MADS box promoter Pbm hadsp eac ial activity in floral organ, Key wods: BvM14MADS box gene; promotegr; en etic transformation; tissue-specific expressionr- 檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪 (847 )上接第 页 Studies on Ligninase poduction by Lignindegading fungus r-r 1，2 2 2 YAN Hong， ZHANG ao-tan， LIU MngXiii ( 1, College of Chemistry andE nvironmental Engineering，Harbin University of Sicence and Technology，Harbin 150040，China; 2, Heilongjiang Acamedyo f Agricultural Sciences Postdoctoral Programme，Harbin 150086，China; 3, Northeast ForesUtrnyi versity Postdoctoral Programme，Harbin 150040，China) Abstract: Optimal culture condition for production of ligninase using two high ligninolytic activity strains ( termed 14 ) 7 and15 )1 ，respectvey) are nvestgated, gnnase actvtes of statc liquid cuture ftrates were meas- iliiLiiiiiilil ured, The results showed thatric e straw was the best carbon source，and urea wasni ttrheoge nbe sourcest for 14) 7 and 15) 1, Optimal culture temperature lofign inase production was30 ? ,I n the optimal culture condition，the ) 1 lignin peroxidase activity and manganeseer opxidase activity of strain 14 ) 7 were 0.350 U?mL and 0.080 U? ) 1 ) 1 ) 1 mL ，respectively, The strain 15 ) 1 was bale to accumulate an average of 0. 300U? mL and 0. 072U ?mL ， respectively, ey wods: gnn )d egradng fungus; gnnase; optmum condton; gnn peroxdase; manganesee rpoxdase; Krliiiliiiiiliiiilaccase