2001年12月克隆测序鉴定柯萨奇病毒B3m诱导balb

2001年12月克隆测序鉴定柯萨奇病毒B3m诱导balb 中华儿科杂志2001 年 12 月第 39 卷第 12 期 Chin J Pediatr , December 2001 , Vol 39 , No. 12 7??53 ?? ?? ?? 论著摘要 克隆测序鉴定柯萨奇病毒B3m诱导BALB/ c 小鼠 急性心肌炎模型 王雪峰 王永梅 刘芳 郑菲 魏克伦 小儿病毒性心肌炎发病率的逐年增高 ,越来越受到专家 扩增 :将反转录的 cDNA 进一步扩增 ,扩增参数 :94 ?3 min , 学者的关注。关于病毒性心肌炎的发病机制及药物防治等 94 ?30 s 、56 ?30 s 、72 ?1 min ,30 个循环后 72 ?5 min 。 基础性与应用性研究都需要一个可靠而稳定的动物模型[1 ] 。 ?产物测定 :选取模型组 CVB3m 引物 RTPCR 扩增产物 ,再次 我们以质粒克隆测定 BALB/ c 心肌炎模型小鼠的心肌组织 扩增 , 以蛋白核酸分析仪测吸光度 A 值 曾称光密度 并计 中 CVB3m序列 ,对测序结果与已知 CVB3m cDNA 全序列进行 算 DNA 产量。? RTPCR 产物检测 : 5 V/ cm 电压电泳 了比较 ,并配合病理观察 ,鉴定小鼠心肌炎模型。 45 min ,确定目标DNA , 以天能凝胶分析系统拍摄、分析。 4 材料与方法 RTPCR 扩增产物克隆与测定序列 : ?回收目的 DNA :切取目 1. 材料 : 1 病毒 : CVB 上海第二军医大学沈茜教授 的DNA 片段 ,加入 Nacl 溶液 ,加热融化 ,缓冲液反复洗 ,离 3m - 4 心 ,回收 上清液即得。?连接与转化 :将 DNA 、载体 pMD18 惠赠 ,Hela 细胞传代 ,TCID 为 367 ×10 。 2 动物 :70 只 50 及连接酶 混匀 , 16 ?恒温 1 h ;与JM109 感受态细胞冰浴 1 h ; BALB/ c 小鼠 ,5,6 周龄 ,雄性 ,体重 18 g 左右 中国医科大 μ 加葡萄糖和 SOB ,37 ?摇床 1 h ;取 20 l 涂平板 ,培养过夜。 学动物中心提供 , SPF 级 。 3 仪器 : DNA 测序仪 ABI TM ?质粒扩增与纯化 :将培养的质粒再次扩增 ,并用碱裂解法 PRISM 377X 、蛋白核酸分析仪 美国Beckman DU600 、PCR 提取质粒 ,限制性内切酶切割 ,得到纯化的质粒。 5 序列测 仪 美国 PE9600 ,倒置显微镜 德国 LEICA 、超薄切片机 定与比较 :应用 DNA 测序仪测定克隆序列 ,将测定序列结果 LKBV 、电子显微镜 日本HITACHI H600 、低温高速离心 与已知 CVB cDNA 全序列比较[2 ] 。 机 德国 Heraeus Biofuge 28RS 、电泳仪 上海天能 EPS300 ; 3m 结果 CMIAS 医学图像分析管理系统、天能凝胶分析系统。 4 试 1. RTPCR 扩增产物测序结果与 CVB cDNA 全序列比 剂 :TRIZOL 总 RNA 提取试剂 GIBCO 公司 、RTPCR 试剂盒 3m 较 :除第 2632 、2690 、2881 、3097 、3231 、3243 的 C 、G、T 、A 、G、A 大连宝生物有限公司 、AmpliTaq DNA 聚合酶循环反应 与原序列上相应位置的 T 、A 、C 、G、A 、G 不符外 ,其余 822 bp 试剂盒 PE 公司 。 5 引物 :CVB 特异引物为软件设计所 3m 与原序列碱基完全一致。828 bp 的扩增片段仅错配 6 个碱 得 ,CVB3m上游引物 24582476 为 5’ GTG GAA GAC GCG ATA 基 ,与 CVB cDNA 序列的吻合度 993 % ,高度吻合。 ACA 3’ ,下游引物 32863269 为 5’ CAT TGT AGT GAT GCT 3m 2 组织学检查 :模型组小鼠在接种 3 d 后 ,心肌细胞开 TTG 3’ ,扩增片段计 828 bp ;测序用引物 F M1347 与引物 R RVM ,分别为 5’ CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC 3’ 始出现肿胀及少数淋巴细胞浸润 ,第 5 天到第 7 天坏死及炎 与 5’ GAG CGG ATA ACA ATT TCA CAC AGG 3’ 。引物由宝 性病变逐渐增多 ,第 10 天病变达高峰 ,广泛的坏死、钙化及 淋巴细胞浸润为其主要的病理表现 ,第 14 天炎性改变逐渐 生物工程 大连 有限公司合成。 2. 实验方法 : 1 分组与小鼠 CVB3m 急性心肌炎模型的 恢复 ,病灶内可见不同程度的纤维化。计算机图像分析仪综 合分析小鼠心肌病变结果 , 模型组的病变总面积 3211 建立 :70 只小鼠按体重随机分为对照组 A 组 与模型组 B 2 mm 和病 变总面积/ 所测心肌总面积比 184 % 与对照组相 组 。B 组经腹腔注射接种 02 ml 含 TCID50 的 CVB3m 。A 组 比差异有 非常显著意义 P 001 。 予以等量不含病毒的 Hela 细胞培养上清液。 2 取材 :各组 分别于感染后 3 、5 、7 、10 、14 d 随机活杀 6 只鼠 ,取心肌组织 , 讨论 一个 可靠而稳定的动物模型是心肌炎发病机理及药物 分别用于克隆测序及病理组织学检查。 3 RTPCR : ? 提取 总 RNA : 取心肌组织加 TROZOL 制成匀浆 ,经超声破碎、提 防治研究中必不可少的实验基础 ,其中造模毒株的选择至关 取 ,氯仿、异丙醇等分离、沉淀 ,最后用适量的无 RNase 水溶 重要。实验研究表明 ,不同毒株的造模结果差异很大 [3 ] ,尤 解 RNA 沉淀。?合成 cDNA : 将总 RNA 反转录合成第一条 以 CVB3m株病毒造模成功率高、模型稳定而倍受实验研究者 cDNA 。条件:65 ?1 min 、30 ?5 min 、15,30 min 内匀速升 的关注。目前国内 CVB3 的变异毒株很多 ,至少存在 3 种以 温至 65 ?、65 ?15,30 min 、98 ?5 min 、5 ?5 min 。?PCR 上 的不同毒株 ,其来源各不相同。在毒株鉴定中 ,来源仅供 参考 ,而 针对毒株分子生物学信息的研究不失为一有效而可 基金项目 : 国家自然基金项目 39670869 靠的方法。 作者单位 :110005 沈阳 , 中国医科大学第二临床学院 王雪峰 , DNA 序列测定是从分子遗传学角度对生物大分子物质 魏克伦 ;辽宁中医学院附属医院 王永梅 ,刘芳 ,郑菲 识别与鉴定的有效方法。克隆测序技术是利用核酸分子的 7??54 ?? 中华儿科杂志2001 年 12 月 第 39 卷第 12 期 Chin J Pediatr , December 2001 , Vol 39 , No. 12 可复制性及质粒的高复制性、不相容性 ,采用分子生物学技 机理提供客观依据。 术对极微量的特定 DNA 序列进行鉴定的一种方法[4 ] 。因小 参 考 文 献 鼠心肌组织中CVB3m含量微少 ,直接检测其 DNA 指纹谱十分 1 杨英珍 ,金佩英 ,李李 ,等. 小鼠急慢性柯萨奇 B3 病毒性心肌炎 困难 ,故采用质粒克隆的方法提高样品量 , 以便进一步测序 的病理改变. 中华医学杂志,1991 ,71 :639640. 鉴定该病毒。实验结果表明 ,测定序列与已知 CVB3m cDNA 2 Klump W M , Bergmann I , Muller B C , et al. Complete nucleotide sequence infectious Coxsackievirus B3 cDNA :two 5′uridine residues are 全序列的吻合度 993 % ,而且病理观察也证实毒株感染的 regained during plusstrand RNA synthesis. J Virol , 1990 :15731583. 发病情况符合急性病毒性心肌炎的发病特点及病理表现[5 ] 。 3 崔小岱 ,马连华 ,许峥 ,等. 制造病毒性心肌炎动物模型毒株的比 提示用克隆测序法筛选的造模毒株可以造出稳定而可靠的 较. 中华儿科杂志, 2000 ,38 :8385. 4 萨姆布鲁 克 J ,弗里奇 EF , 曼尼柯蒂斯 T. 分子克隆实验指南. 第 病毒性心肌炎模型。 二版. 北京 :科学出版社 ,1992. 602. CVB3 是病毒性心肌炎的重要病原之一 ,它的心肌毒力 5 刘晶星 ,陆德源 ,王升平 ,等. 柯萨奇B 组病毒致心肌炎的发病机 理初探. 中华微生物和免疫学杂志,1991 ,11 :345347. 强弱与碱基的排列顺序密切相关 ,单个位点的改变可影响病 6 朱莉 ,刘晶星. 柯萨奇B 组病毒的心肌毒力和炎性心肌病的遗传 毒对心肌的毒力[6 ] 。进一步深入研究 CVB 与其他 CVB 变 3m 3 学基础. 国外医学微生物学分册,1997 ,20 4 :1415. 异株之间的序列差异 ,寻找各毒株的变异位点 ,将为筛选造 收稿日期 :20001018 模毒株、确定有效的鉴定位点序列和进一步研究 CVB3 致病 本文编辑 :滕淑英 韧粘素与大鼠野百合碱性肺高压肺血管重建的相关性研究 沈 捷 周爱卿 秦玉明 梁 瑛 李 奋 张文竹 目前已知 ,肺血管重建是不同原因肺高压的共同病理特 保存。产物以 2 %琼脂糖凝胶电泳 ,用凝胶成像仪观测目的 基因产物与 IS 的灰度比值 ,作为 TN mRNA 的相对表达水平。 征。韧粘素 tenascin ,TN 是一种大分子细胞外基质蛋白 ,它 参与血管的重建过程[1 ] 。本研究通过快速竞争性 RTPCR 取右上肺 10 cm ×05 cm 大小组织和肺总动脉及左右 技术及免疫组化和图像分析方法 ,观测野百合碱性肺高压大 分支 ,用多聚甲醛固定 ,梯度乙醇脱水 ,石蜡包埋后连续切片 α 鼠肺组织及肺动脉中 TN mRNA 的动态表达水平和 TN 蛋白 后进行免疫组化。光镜观察 TN 与平滑肌 肌动蛋白 α 的沉积、分布情况及其与血管平滑肌细胞增殖、迁移的关系 , SMA 、细胞增殖核抗原 PCNA 表达的关系 ; 图像分析测 以期阐明 TN 在肺高压肺血管重建中的作用。 量 TN 阳性表达面积和血管壁面积 , 以二者比值作为 TN 的 材料和方法 相对表 达面积 ;血管壁的平均灰度值作为相对表达强度。 雄性 SD 大鼠 72 只 ,随机均分为野百合碱 MCT 组和正 结果 常对照 CON 组。MCT 组大鼠以 2 %野百合碱液按 60 mg/ kg 1 肺动脉平均压的测定情况 :MCT 组大鼠 mPAP 于给药 剂量在背部脊柱旁皮下注射 ,CON 组同法给予等容生理盐 后第 14 天开始升高 , 为 189 ?26 mmHg 1 mmHg 0. 133 水。分别于注射后第 7 、14 、21 、28 d 测肺动脉平均压 kPa ,与同时间点对照组 mPAP[ 143 ?10 mmHg ] 相比差 mPAP 。 异有显著性 P 001 。并随时间的延长而继续上升 ,至第 测压后取右上肺组织约 50 mg 并分离肺总动脉及左右 28 天为 268 ?46 mmHg 趋于稳定。CON 组各时间点间差 分支 , 进行总 RNA 抽提及逆转录。引物序列为 : 上游 : 5′ 异均无显著性 P 均 005 。 CAGAAGCTGAACCGGAAGTTG3′; 下 游 : 5′GGCTGTTGTTG 2TN 在大鼠肺组织及肺动脉中的表达情况 :MCT 处理 CTATGGCACT3′。扩增产物为278 bp 。竞争性内参照 IS 制 后第 7 天 ,TN mRNA 表达水平即显著上调 ,并随时间而增高 , 备参照文献[2 ]进行 ,其上游引物序列同目的基因 ;下游为目 至第 21 ,28 天达到高峰 ;CON 组第 14 天肺组织虽也有 TN 的基因下游引物加上 GGGAGGGTTATTTCTTGTGG3′,产物为 mRNA 水平升高 ,但较其对应的 MCT 组明显降低 P 001 , 178 bp ,其最佳竞争浓度为 5 fg/ 反应体系。PCR 反应条件 : 且不随时间延长而继续增长 P 005 。见表 1 。 94 ?预变性 5 min ,继之 94 ?变性 30 s ,55 ?退火 30 s ,72 ?延 光镜下 TN 阳性染色自第 14 天起明显可见 ,多位于 MCT 伸 30 s ,共 30 个循环 ,最后一个循环后 72 ?再延伸7 min ,4 ? 组大鼠肺动脉的外膜和中层。第 28 天也可见于肺动脉内 膜 ;肺实质中 罕见。CON 组肺实质中未见阳性表达 ,肺动脉 偶见较淡染 色 ,多位于肺动脉外膜。连续切片显示 ,TN 表达 基金项目 :上海市高等学校科学技术发展基金 98B20 α 作者单位 :200092 上海市儿科医学研究所 上海第二医科大学附 阳性的血管中、内膜处 , 多可见 SMA 、PCNA 阳性染色。图 属新华医院 像分析 表明 ,MCT 处理后第 14 天开始 ,TN 蛋白在肺动脉的