药物人血清白蛋白相互作用的毛细管电泳法研究

药物人血清白蛋白相互作用的毛细管电泳法研究 河北大学 博士学位论文 药物-人血清白蛋白相互作用的毛细管电泳法研究 姓名:何攀 申请学位级别:博士 专业:分析化学 指导教师:孙汉文 20090601摘要 摘 要 药物发现与发展过程中一个重要的任务就是研究药物与血清白蛋白的相互作用。本 文将毛细管电泳应用于药物一蛋白结合的研究中,建立了强力霉素、种氟喹诺酮药物以 及.氟尿嘧啶与人血清白蛋白相互作用的研究方法。采用毛细管电泳一前沿分 析法进行热力学参数测定的结果明,该法可用于药物一蛋白结合的热力学参数 的测定,并可由此推断药物一蛋白结合的作用力。这一研究扩展了毛细管电泳一前沿分析 法研究药物一蛋白相互作用的内容。本论文主要研究内容如下: 第章综述。介绍了药物一蛋白相互作用的研究方法、人血清白蛋白的结构特点、 毛细管电泳法定量测定药物一蛋白结合参数的方法、毛细管电泳法在药物一蛋白相互作用 研究中的模式及各自应用进展。 第章强力霉素与的相互作用。采用法研究了模拟人体生理环境下 ., 磷酸盐缓冲溶液,.,州强力霉素,浓度最大为州,. ?强力霉素与的相互作用,得到二者相互作用的结合位点数,结合常数,药物蛋 白结合比分别为.,. .以及.%。实验还测定了不同温度下的焓变??, 熵变心和吉布斯自由能变化?等热力学参数,,并由此得出二者之间主要为静 电结合。此外,为了更好地理解强力霉素与的结合性质以及获得与其他药物相互作 用的更进一步的信息,进行了药物置换实验。结果表明强力霉素在上的结合部位位 于“位点”。 第章氟喹诺酮类药物与及人血浆的相互作用。在模拟生理条件下,采用 法研究了种氟喹诺酮类药物环丙沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星、诺氟沙星、 加替沙星、氟罗沙星、依诺沙星和洛美沙星与的相互作用。亦采用超滤毛细管 电泳法测定了这些药物与人血浆的结合。不同浓度下的自由药物浓度】由电泳图 .软 的平台峰峰高及校准曲线测得。氟喹诺酮药物与的结合常数的估算采用 件进行非线性拟合得到。结果表明,氟喹诺酮药物与具有较低的亲和性,结合常数 为. .盯。氟喹诺酮药物与的结合比在..%之间,而与人 血浆的结合比在..%之间。可以看出,氟喹诺酮与的结合比略低于人血浆,摘要 表明是氟喹诺酮在人血浆中最主要的结合蛋白。此外,由法测得了氟喹诺酮 药物与结合的热力学参数,并由此得出结合反应为一个吸热过程,疏水相互作用为 氟喹诺酮与结合的主要作用力。 第章.氟尿嘧啶与的相互作用。首先采用法研究了.氟尿嘧啶与 的相互作用。由于具有相似的电泳淌度,二者在模拟人体生理环境的缓冲溶液中 ., 磷酸盐缓冲溶液,.无法完全分离,得不到药物的平台峰。因此, 研究了直链淀粉、糊精、葡聚糖、.环糊精.、甲基..环糊精..、羟丙 基..环糊精..以及磺丁基醚..环糊精..对两峰分离的影响。结 果表明,当加入 ..或大于 的..时,两峰虽未能完全分离, 但是平台峰比较平,游离的.氟尿嘧啶的浓度可准确定量。选用 ..作运 行缓冲溶液添加剂,研究了.氟尿嘧啶与的结合,实验结果表明.氟尿嘧啶与 的亲和性较低,采用法无法得者的结合位点数和结合常数。然后采用亲和 ~. 毛细管电泳法研究了二者的相互作用,得到的结合常数为.× ?。为描述.氟尿嘧啶和之间的相互作用力,测定了反应的热力学参数,包括焓 变肼,熵变丛和吉布斯自由能变化?,推者之间主要为疏水作用。此 外,为了更好地理解.氟尿嘧啶与的结合性质以及获得与其他药物相互作用的更 进一步的信息,进行了药物置换实验。结果表明.氟尿嘧啶在分子上的结合部位 为“位点”。 第章结论与展望。总结毛细管电泳法在强力霉素、氟喹诺酮及.氟尿嘧啶药物 与相互作用研究中的应用。 关键词:毛细管电泳;人血清白蛋白;相互作用;强力霉素;氟喹诺酮;.氟尿嘧啶. , .. .弱: , :., , . : . ,., ,,.州, 州,.?., . .,. .%,. , 蚴, 四 ?回 ., , “ . ”.. :. . 】.. . .. 竹. , . .%,. .%. . .. , . : .,.., ,.,.?.,, , ?,?一. ??., . ...., , . . . ~.?. ? 蚴, . ,, .皿 .“ ”. :.,, . : ; ;;; ; 河北大学 学位论文独创性声明 本人郑重声明: 所呈交的学位论文,是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。尽我所知, 除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文 中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果,也不包含为获得河北大学或其他教 育机构的学位或证所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何 贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了致谢。 作者签名: 垒勇鏊 日期:盟年』月上日 学位论文使用授权声明 本人完全了解河北大学有关保留、使用学位论文的规定,即:学校有权保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和借阅。 学校可以公布论文的全部或部分内容,可以采用影印、缩印或其他复制手段保存 论文。 本学位论文属于 、保密口,在??年??月??日解密后适用本授权声明。 、不保密凹。 请在以上相应方格内打“保护知识产权声明 本肭精洲畎铧位服她题目削锡四彰嘲 的学位论文,是我个人在导师翻识主蝴旨导并与导师合作下取得的研究成果, 研究工作及取得的研究成果是在河北大学所提供的研究经费及导师的研究经费 资助下完成的。本人完全了解并严格遵守中华人民共和国为保护知识产权所制定 的各项法律、行政法规以及河北大学的相关规定。 本人声明如下:本论文的成果归河北大学所有,未经征得指导教师和河北大 学的书面同意和授权,本人保证不以任何形式公开和传播科研成果和科研工作内 容。如果违反本声明,本人愿意承担相应法律责任。 声明人: 兰亟鏊 日期:吐年上月土日 作者签名: 日期:茸年?月?生日 导师签名: 日期:至 年??生月上日第章绪论 第章绪论 .引言 药物经吸收进入血液后,能够与血浆蛋白产生不同程度的结合。这个过程是快速、 可逆的,并且结合型药物与游离型药物之间保持一种动态平衡。游离药物能自由通过毛 细血管壁、血脑屏障及肾小球等多种生物膜到达靶器官发挥药理作用,而与血浆蛋白结 合的药物则难以通过这些生物膜,因而不具有药理活性。当游离药物代谢或被组织清除 后,部分结合的药物能够从结合部位解离出来,从而补充游离药物的浓度。结合率和结 合能力不同的两种药物合用时可能会竞争血浆蛋白的同一结合部位,血液中其中一种游 离型药物浓度突然增高,疗效和毒性增强,导致病人发生意外危险。此外,临床上使用 的手性药物几乎一半是消旋体,药物对映体间也能够竞争结合蛋白上相同的结合位点。 因此,药物与血浆蛋白的结合对药代动力学,药效以及药物毒理性质都起着重要作用。 探索药物与血浆蛋白之间的结合特性,对新药开发、指导临床合理用药以及探索生命体 系的化学和生物物理过程都具有非常重要的意义,已成为一个重要的应用领域。 药物一血浆蛋白相互作用的研究包括结合常数、药物一蛋白结合比、结合位置、结合 位点数以及作用力类型等内容。结合常数的测定提供了药物一蛋白结合的强度,数值的大 小直接影响药物的分布与消除,因而影响药物作用的强度和时间。药物一蛋白结合比直 接影响血液中游离型药物的浓度。结合位置的研究有助于了解结合机制以及药物间相互 取代的机理,可预测药物间相互取代的可能性,以及在某些疾病所致白蛋白急剧变化的 情况下药物与蛋白质的结合,对调整药物剂量,防止毒性产生具有重大意义。这些参数 的测定对研制活性和耐受性都更好的新药非常重要。 .药物一蛋白相互作用的研究方法 研究药物一血浆蛋白结合常用的方法有:超滤、平衡透析等常规方法、光谱法、色 谱法以及毛细管电泳法等。研究药物一血浆蛋白结合的方法可以归为两类:一类 是直接或间接地测定药物的游离浓度或结合浓度。另一类是研究结合前后物质发生的物 理化学性质的改变。需要指出的是,由于蛋白质溶液所处的环境和其体内环境存在一定河北人学理学博十学位论文 的差别,无论用何种方法对他们之间的相互作用进行研究,得到的仅仅是一种大致近似 的结果。 ..常规方法 研究药物一血浆蛋白结合所用的常规的分析方法有:平衡透析【】、超滤【州、超离 心【、微透析【等。这些方法均需要和其它的检测方法相联用。 平衡透析是测定药物游离浓度最常使用的方法。它的测定过程如下:半透膜将透析 池一分为二,两边分别放血浆与缓冲溶液,整个系统在?下温育,达到平衡后,分 别取半透膜两边的液体测定药物的浓度。这个方法的优点是在生理环境下进行,且整个 过程处于平衡状态。缺点是费时通常需要几十个小时,且存在很多影响结果准确度 的因素,如塘南效应,体积迁移,游离药物通道的阻滞,蛋白泄漏以及药物在透析设备 表面存在的非特异性吸附等。 超滤法是临床上用于监测游离药物浓度的方法。超滤容器由一过滤器一分为二,水 和低分子量物质可以通过,而截留蛋白等大分子量的物质。超滤容器内放入已平衡的含 有药物的血浆,使用真空减压、高压或离心等手段将含有药物的血浆过滤。其优点为分 析时间短,没有稀释效应和体积迁移,且现在商品化的超滤离心管使得超滤实验的完成 非常方便。但是,这个方法仍然具有膜效应,并且可能存在分离过程使得结合平衡受到 影响的问题。超离心不存在膜吸附的问题,但是它和超滤法一样,仍然存在分离过程中 结合平衡发生改变的问题。 微透析是近年发展起来的唯一一个直接测定体内血浆、组织液和其它体液如脑脊 液中游离药物浓度的方法。将一个含透析膜的微透析探针植于血管或组织间隙,透析 缓冲液经探针泵入,血液或组织液中的游离药物通过浓度梯度扩散经透析膜进入探针。 透析液收集一段时间即可测定药物的游离浓度。微透析法的优点是可保持结合平衡在较 , 宽的药物浓度范围和蛋白结合范围内操作,样品的取样时间短通常可控制在~ 因此可在生理条件下连续研究体内药物与蛋白的结合作用。但是,此方法只能够得到游 离药物的浓度,而无法得到其总浓度或结合型药物浓度。微透析得到的样品通常采用高 效液相色谱或毛细管电泳进行检测。 ..光谱法 生物大分子最重要的特征之~就是具有特定的构象,如多肽和蛋白质的螺旋、折叠 第章绪论 等。这些特定的构象是它们表达生物功能的结构基础,要深入理解蛋白的生物活性,就 必须了解它们的构象及其相关变化。利用药物与蛋白结合前后的光谱变化,能够得到蛋 白质结构和构象信息。研究药物一蛋白结合所用的光学分析法有:紫外一可见分光光度法 】,荧光光谱澍,,核磁共振光谱法【】,圆二色光谱四以及红外光 谱法【】等。 利用药物与蛋白结合前后紫外可见吸收光谱的变化,可以计算药物与蛋白作用的结 合常数和结合位点剡,。 荧光光谱法能够提供激发光谱、发射光谱以及荧光强度、量子产率、荧光寿命、荧 光偏振等荧光参数,这些参数从各个角度反映了分子的成键和结构情况以及发光特性。 通过对这些参数的测定,可得到许多关于蛋白质与药物作用的信息如结合常数、结合位 点数、结合位置、作用力类型以及蛋白质分子在相互作用中结构的变化等有用的信息, 从而阐明蛋白质结构与功能的关系。 核磁共振能获得接近生理状态下生物大分子溶液的三维结构信息及其动力学行为。 但由于准确度差、效率低得到的实验数据通常需要约一个月的时间来解析,此法不 适宜定量研究结合参数。此外,核磁共振法能测出溶液状态下分子量较小的蛋白质构象, 可是对分子量较大的蛋白质的计算处理非常复杂。相比之下,圆二色光谱是研究稀溶液 中蛋白质构象的一种快速、简单、较准确的方法。 红外光谱适用于不同状态、不同浓度及不同环境中蛋白的测定。蛋白质二级结构的 形成主要靠肽链中的?和酰氨上的?..之间形成特定的氢键,而红外光谱对氢 键非常敏感,因此成为研究蛋白质二级结构变化的有力手段之一【埔,。此外, 红外光谱 还具有以下优点:样品用量较少,蛋白质分子的大小对于实验测定几乎没有影响,没有 光散射和荧光的影响等。 ..色谱法 高效液相色谱法主要包括高效亲和色谱法【,和高效体积排阻色谱澍是研究 药物一蛋白结合的有力工具。与常规方法相比,高效液相色谱法得到的结合数据具有更 高的准确度与精密度,并且能够研究药物对映体与蛋白的选择性结合。不足是非生理实 验条件值的调节,有机改性剂的存在等可能改变蛋白质的构象和本来的结合行河北大学理学博十学位论文 为,且需要的样品量比较大。 ..毛细管电泳法 由于具有操作简单,分析时间短,分离效率高,需样量少,以及研究在近生理环境 中进行等优势,已经成为研究药物一蛋白结合的有效技术【。 根据操作模式及数据提取方法的不同,研究药物一蛋白结合可以采取几种不同的 模式,如亲和毛细管电泳】,毛细管电泳一前沿分析法【,,空峰 法】,法以及空亲和毛细管电泳法 【等。表.所列为种常用模式的比较。 表. 研究药物一蛋白相互作用的模式 亲和毛细管电泳法分两种:一种为运行缓冲溶液中含有变化浓度的药物, 样品为确定浓度的蛋白,根据蛋白峰迁移时间的变化得到结合信息。另一种为运行缓冲 溶液中含有变化浓度的蛋白,样品为确定浓度的药物。根据药物峰迁移时间的变化得到 结合信息。 《、嚣?? / 图.亲和毛细管电泳原理示意图 在毛细管电泳一前沿分析法中,向毛细管中引入较大体积约~ 的平衡样品混合物药物、蛋白及药物一蛋白复合物,由于迁移率不同,游离药物离开 蛋白区带,而与蛋白结合的药物保留在蛋白区带。在结合型药物的解离过程中,区带重 叠区内维持结合平衡,游离药物的浓度保持恒定,经检测器检测形成平台峰。根据平台 峰高可以求得游离药物的浓度。 蛋白.蛋白一药物.药物 进样??二二二二 蛋白蛋白一药物药物 蛋白 药物 二二圜匿二 二】覆二瓯 检捌信号 以 厂厂 连续的平台峰 升高的平台峰 闰.毛细管泳?前沿分析原理示意图河北火学理学博十学位论文 空峰法?及空亲和毛细管电泳法的操作方法相同:将药物和蛋 白加入缓冲溶液充满毛细管,其中一种组分的浓度确定,变化另一个组分的浓度。当其 通过检测器时会产生较高的背景吸收。将空白缓冲液作为样品进样,则产生两个负峰, 一个是游离药物的峰,另一个是结合物的峰。根据游离峰的峰面积可以计算游离药物的 浓度,以此计算结合常数的方法为空峰法。两个负峰的迁移时间反映了结合物与游离药 物的分数比,据此计算结合常数的方法为空亲和毛细管电泳法【。 法中毛细管充满含有不同浓度的药物做添加剂的运行缓 冲液,样品为含有处于结合平衡的不同浓度药物的蛋白溶液。在分离过程中药物和蛋白 不断迁移出样品区带,并使样品区带中的药物浓度不断减少,在电泳谱图上将产生一个 结合物的正峰和一个药物负峰,通过测定负峰的面积求出游离药物的浓度,从而计算结 合常数。 应用毛细管电泳法研究药物一蛋白相互作用时要注意的一个主要问题是蛋白在毛细 管壁的吸附。由于蛋白和毛细管内壁之间存在库仑和疏水相互作用,经常出现蛋白峰的 显著拖尾和蛋白质与毛细管内壁之间的不可逆吸附,这会影响分离效率和测定的准确性 和重现性。目前有效的解决方法是对毛细管进行修饰,如毛细管内壁的物理涂层或永久 共价键合,此外,采用合适的毛细管冲洗程序也会有效减小蛋白吸附。另一个问题是毛 细管电泳的灵敏度不够高。但是随着与激光诱导荧光、化学发光、电化 学和质谱等检测技术的联用,可望在药物一蛋白相互作用的研究方面 发挥更重要的作用。 ..其他方法 除了前面介绍的方法外,还有很多方法也能够用于药物一蛋白相互作用研究。具有 电化学活性的药物分子与蛋白质作用后,药物分子的特征氧化还原峰电流会发生变化, 同时峰电位也有所移动。因此电化学分析法可以作为其他方法的有益补充,获得其他方 法得不得的信息【】。激光散射法可以测定蛋白和药物分子形成的复合物的分子量以及体 系的扩散系数和粒径分布信息【】。表面基元等离子体共振传感器【、石英晶体共振传感 器【】等技术可以通过药物小分子对蛋白质大分子在传感器中不同性质的响应,来研究二 者相互作用。此外,研究药物一蛋白相互作用常用的方法还有质谱法【、热量测定法【】 等。随着科技的发展,一些新的技术和方法也将应用到该研究领域。 第章绪论 .人血清白蛋白简介 人血清白蛋白 ,是目前研究最早、最多的蛋白之一,长期 以来它的浓度一直是检验健康和疾病的指标。与其它蛋白相比,它的分子量小、水溶性 好、稳定性高、且易提纯制备,在临床药物研究中一直作为模型蛋白,也是研究高分子 蛋白物理化学性质、结构与功能、临床应用以及变异方面的理想蛋自,因此,在药理学、 临床医学和分子生物学等方面有重要的应用价值。 :星循环系统中最丰富的可溶性蛋白‘“,约占血浆总蛋白的%。在肝脏内 合成,是一种单肽链心形蛋白质,由个氨基酸残基组成,分子量约为 ,等 电点为.。具有很多生理功能,如:维持血浆胶体渗透压,将各种物质诸如离子、 色素、一部分水溶性维生素、机体蛋白质、胆红索、类剧醇激素、游离脂肪 酸和药物等, 以结合的形态进行运输,以及做为组织的氨基酸供给源等。此外,它还能够协助许多药 物通过有机体?循环系统的交界面如:肝、肠、肾、脑进行转运.。 .射线衍射法测定的分子为明显不对称的心形.分子里含有重复的三个结构同 源的结构域表示为?和,每个结构域又由两个更小的棚有共同基元的螺旋构象于结 构域和组成,子结构域与分别含有个和个小螺旋结构‘“埘】。其晶体结构如图 .所示。 图.人血清白强白的晶体结构四河北人学理学博十学位论文 等【删通过重组技术,基于亲和色谱法建立的纯化结果表明三个结构同 源的结构域各含有一个特殊的蛋白结合位点。诱导圆二色光谱法测定了三个相应的药 物:氯化血红素结构域、华法林结构域和地西泮结构域,结 果与基于竞争抑制和光谱研究所预期的位置一致。早期重金属原子的衍生物筛选及初步 的药物结合研究:的重要结合区域位于子结构域的认和的疏水空腔里。这 两个最主要的药物结合位点,被分别称为“位点和“位点”。其中,子结 构域中的结合空腔最活跃,而且适应能力最强。研究发现许多药物首先在这 里结合, 例如:地高辛、布洛芬和色氨酸等。与子结构域结合的药物通常有华法林,水杨酸等。 而有些药物几乎均匀分布于子结构域和,如阿斯匹林和碘代阿斯匹林等。晶体结 构的解析还发现子结构域和子结构域共享一个相同的界面,因此,子结构域 结合药物后可影响子结构域的构象及结合亲和势。等】推断,的对映体 选择性结合即存在于子结构域和共享的这一界面上。 .毛细管电泳法估算药物一蛋白结合参数 ..结合常数测定 结合常数是评价药物一蛋白结合作用最重要的参数之一。假设每个蛋白分子上存在 类独立结合位点,且药物在这些位点上为:结合。以每分子蛋白所结合的药物分子数 ,.作为游离药物浓度的函数作图可以得到结合曲线。通过方程对实验数据 进行非线性拟合可以得到结合参数。 ,.:堕:争竺墨幽』 【】 智】, 其中,,.为每分子蛋白所结合的药物分子数,】为游离药物浓度,为与蛋白结 合的药物浓度,尸为总蛋白浓度,是蛋白分子中与药物结合的结合位点总类数,是 第类与药物结合的位点数,墨为第类结合位点的结合常数。 ...依据峰面积或峰高计算 对于法和法,被分析物的浓度与其峰面积成正比,对法,游 离药物浓度与其平台峰峰高成正比。因此,可以分别根据峰面积或峰高得到关于游离药 物浓度阳总蛋白浓度用间的函数。 假设只有一类结合位点垅时,方程可以变形得至方程】第章绪论 或方程【引。. 佃勋 ? , ”赳】/ 一一牟一 根据方程以川对厂作图或根据方程以居对/作图分别得到一条 直线,根据直线的斜率和截距可以求出结合常数以及结合位点数。当结合位点不止一 类时,结合曲线不成线性,此时可以根据每段直线的斜率和截距来求相应种类结合位点 的结合常数以及结合位点数。 然而,利用方程和进行线性回归分析时,横、纵坐标中的通过实验 测定得到,而,值由测得的】艟通过计算得到。因此,横、纵坐标均存在实验误差,这 可能会得到某些无法解释的实验结果,并对结合参数做出错误的估算。 等【,】提出了一个克服这个问题的方法。假设只存在一类结合位点 所,并且只有一个结合位点力时,可以用方程来估算结合常数: 。:×堕盥坐逝叠些型堂兰堕五一 % 。 ?% 其中,为总药物浓度,为总蛋白浓度,为结合常数。药物结合比可以通过实 验测得的游离药物的浓度得 ?? % 对作图,通过非线性拟合可以得到结合常数 根据方程,以% 。用这个方程进行非线性回归,只有轴为实验测得的变量,而轴为已知量,与 原来 的拟合方程相比,有效地减少了实验误差。 但是,方程中限定药物与蛋白间只有一类结合位点聊且结合位点数为 刀,这大大影响了这个方程的应用。等【】认为在药物治疗浓度时,药物与 在生理条件下的二级结合常数恐可以忽略。因此,建立了一个估算主要结合 位点结 合参数的方程: 河北大学理学博十学侍论文 肾型盟避避孝拦丝盟 其中,】为游离药物浓度,岛为总药物浓度,为总蛋白浓度,是药物与蛋白的结 合位点数,为结合常数。这个方程是关于游离药物浓度】占总药物浓度或总 蛋白 浓度间的函数。用这个方程进行非线性回归,轴为已知量,轴为实验测得的变 量, 有效地减少了实验误差,并且取消了方程和的限制。 ...依据电泳迁移率计算 对于法和法,结合常数可以由被分析物的电泳迁移率的变化来计算。 当药物与蛋白为:结合时: :【型 / 假定被分析物为药物,则药物的表观电泳迁移率‖可由方程计算【】: 鸬鼎矿器以 舻面前面纷商鬲面以 五 五 其中,胛‖。分别为游离药物和药物一蛋白复合物的电泳迁移率。由方程和 方程 可得: 舻锩铲 五 将式变形可得: ‖,一‖, :一‖。 一?????????一???????一 ‖,一‖。用, 』坠;竺』 ‖,一以一‖。 ‖,一‖。????:?一?????:????一 百..,./比/一竹一一肛 方程、 和分别称为双倒数法、.倒数法和倒数法【】。采用以上 种方法作图,即可求得结合常数。 这三种方法都是假设药物与蛋白为:结合,当药物与蛋白不是:结合时,用这 第章绪论 三个方程作图得到的将不是一条直线。此时,结合常数的测定应根据方程来考虑【。 已有相关论文研究药物与蛋白多位点结合等更复杂情况下结合常数的计算【蹦】。 ..热力学参数计算 药物与生物分子间的作用力主要有四种:疏水作用,静电作用,范德华力以及氢键 作用。根据蛋白结合过程中热力学参数的值能够判断它们二者之间作用力的种类【】。结 合过程中的焓变胡,熵变?以及吉布斯自由能的变化?等热力学参数可以 由下面的方程来计算: 一?硎丁/ ? 其中,凰为相应温度下的结合常数,为气体常数。实验温度下,应保证不会发 生 结构变化。结合研究在不同温度下进行,得到各温度下得结合常数。以凰对/ 作 图得到一条直线,与丛可分别由直线的斜率和截距求得。然后将求得的数据 代入 方程,即可求出各个温度下的。 .毛细管电泳法在药物一蛋白相互作用研究中的应用 ..亲和毛细管电泳法 亲和毛细管电泳发是研究分子间相互作用最常用的方法。表.中所列为法研 究药物一蛋白结合的文献。 表. 法在药物一蛋白结合中的应用 . 蛋白 药物 备注 参考文献 肽 万古霉素 【】 乙酰化的二肽 万古霉素 多步配体进样 【】 碳酸酐酶 个苯磺酰胺类衍生物 碳酸酐酶 苯磺酰胺衍生物 【卅】 碳酸酐酶 个苯磺酰胺衍生物 多重进样技术 【】 亚叶酸 对映体分离 【,】河北大学理学博十学何论文 烯丙洛尔,安息香,环磷氮芥,异环 对映体分离 【】 磷酰胺,氧烯洛尔,戊巴比妥 布洛芬.亚叶酸 对映体分离 【】 色氨酸,安息香,吲哚洛尔,异丙嗪, 对映体分离 【】 华法林 、 卟啉类化合物 对映体分离 【】 纤维素酶 部分填充技术 受体阻断剂 【】 、 布洛芬,氟比洛芬,酮洛芬 【】 、 吩噻嗪衍生物 【】 华法林 对映体分离 【】 圭.氧氟沙星及其衍生物,刚. 、 【】 华法林 、 异搏定 【】 修饰的及其它来源 对映体选择性结合,置换 士.氧氟沙星,.色氨酸 【】 的白蛋白 相互作用 氧氟沙星 对映体分离 【 依匹斯汀,高氯环嗪,羟苄利明,曲 对映体分离 【 美布汀,氯丙那林 亚叶酸,扁桃酸,.苯甲酰丙氨酸 对映体分离 【】 替马西泮,丙酰马嚷 对映体分离 , 醋丁洛尔,阿罗洛尔,阿托品,布比卡 因,地诺帕明,乙哌立松,依匹斯汀,依 替福林,非诺特罗,后马托品,氯胺酮, 变肾上腺素,美西律,尼卡地平,奥昔 克利平,异丙嗪,吲哚洛尔,伯氨喹,异 对映体分离 【】 丙嗪,舒必利,特布他林,甲苯哌丙酮,苯 海索,曲美布汀,特美奎诺,曲米帕明, 氯丙那林,美托洛尔,丙吡胺,心得 安和异博定 丙吡胺,心得安和异博定 【】 第章绪论 心得安和异博定 】 .色氨酸 对映体选择性结合 【】 部分填充技术,对映体选 丙吡胺、瑞莫必利 【】 择性结合 万古霉素 部分填充技术 碳酸酐酶 【, 、 氧氟沙星.心得安和异博定 药物置换作用 【】 、 卟啉 对映体选择性结合 【】 胆红素 】 卟啉 【】 转甲状腺素蛋白 氟芬那酸、氟比洛芬 】 卟啉类化合物 【】 酮洛芬,布洛芬,奎尼丁,萘普生, 近红外激光诱导荧光检测 【,】 米帕明,心血安 舒拉明钠 院.微球蛋白 【】 华法林。布洛芬,噻酮布洛芬及氟比 色氨酸修饰的 研究结合位点 【】 洛芬 卟啉类化合物 多位点结合 】 人血清转铁蛋白 色氨酸衍生物及多种药物 对映体选择性结合 【】 转甲状腺素 氟比洛芬 【】 部分填充技术,对映体选 布比卡因 【】 择性结合 心得安 对映体分离 】 抗组胺剂 对映体选择性结合 【】 、 部分填充技术 三种类醇激素及两种类似物 【】 种氟喹诺酮药物 【】 缩写:,牛血清白蛋白.,酸性糖蛋白 当蛋白和药物一蛋白复合物的电泳迁移速度不同时,可将药物作为添加剂,以蛋白 河北大学理学博十学位论文 质作为样品进行测定【,。这种方法优势在于只需要很少量的蛋白,可用于较为稀有、 昂贵的蛋白与药物的结合研究【。如,苯磺酰胺衍生物与碳酸酐酶的结合可以应用 此法进行研究【卅】。此外,由于具有很高的分离效能,因此对蛋白的纯度要求不高, 只要求待测的蛋白能够与其它物质分开即可。还可以将几种蛋白混合物作为样品,同时 测定一种药物与几种蛋白的结合【,,。等【以万古霉素作为缓冲液添加剂,同 时测定了万古霉素与多个肽的结合常数,并通过与文献值和以万古霉素为样品、肽为添 加剂所测得的结合常数相比较,证实了同时测定多个蛋白质与药物的结合常数的可行 性。 当蛋白与药物结合后迁移速度无明显变化时,无法以药物为缓冲液添加剂进行测 定,这时可以将蛋白作为缓冲溶液添加剂,以药物作为样品来测定。这种方法 优势在于 可以测定含杂质较多的样品与蛋白的结合【或同时测定多种药物与一种蛋白的结合 。等【删以不同浓度的转甲状腺素为缓冲液添加剂,氟比洛芬为样品,测定 了氟比洛芬与转甲状腺素的结合。等【】用此方法同时测定了种氟喹诺酮药物与 的相互作用。 将不同浓度的蛋白加入运行缓冲液,会引起缓冲液粘度的较大变化,则毛细管中的 电渗流发生明显改变,使得样品区带中各物质的表观淌度发生变化,导致溶质分子的迁 移时间的重现性差。为了提高毛细管电泳的重现性,更有效地扣除由于粘度变化而带来 的对电渗流的影响,可以采用淌度比来计算。淌度比定义为分析物的表观淌度与电 渗流淌度之比。淌度比不受溶液粘度的影响,并与分离电压和毛细管长度无关。采用淌 度比运用于结合常数的计算模型中,可以有效扣除由于缓冲液中受体或配体浓度增加而 带来的粘度变化的影响。等晔钡定了个苯磺酰胺衍生物与碳酸酐酶的结 合常数,并通过考察电压、毛细管长度对测定结果的影响,认为以淌度比代替淌度“ 计算更加合理。 蛋白在毛细管壁上存在吸附且在紫外区有强吸收,不仅会对药物的检测造成一定困 难,还会引起较大的基线波动。为解决这些问题,年,等【】提出了部分 填充技术? 。在毛细管中预先加入一个蛋白区段,在此区带后引 入所要研究的药物,在药物电泳速度大于蛋白时,药物可以迁移通过蛋白区段,在蛋白 之前到达检测窗口,从而有效地避免其带来的高背景问题。等【】采用部分填充技 第章绪论 术测定了.酸性糖蛋白与手性药物的结合常数。等【】和等【应用此方法分 别研究了万古霉素和碳酸肝酶的结合常数。.等【 】以为手性选择剂, 应用部分填充技术对布比卡因进行了手性分离。等【叫采用部分填充技术测定 了三种中性内生类固醇激素及两种合成的类似物和及的结合常数。 掣】报道了一种多重进样.技术。将含有受体蛋白、非 特异性作用蛋白和中性内标物的样品区带以一定的间隔连续进样到毛细管中.同时进行 电泳分离。分别测定了个苯磺酰胺衍生物与碳酸酐酶的结合常数,得到的结果与一 般法及常规方法的结果吻合很好,而且分析速度有了很大的提高。另外,等【删 利用改进的多步配体进样. 技术进一步减少了蛋白质的消 耗,测定了个乙酰化的二肽与万古霉素的结合常数以及个苯磺酰胺类衍生物与碳酸 酐酶的结合常数。 由于蛋白质是手性大分子,故以蛋白质为缓冲液添加剂时,可以同时测定各光学异 构体与蛋白质的结合常数【,。许多血清蛋白,如:各类血清白蛋白、糖蛋白、天然 卵类粘蛋白、抗生物素蛋白、核黄素结合蛋白、人血清铁传递蛋白等均可用作手性选择 剂【,。等【】以或作缓冲溶液添加剂,对氧氟沙星、异博定及心得 安进行了手性拆分。.掣】以为缓冲液添加剂,测定了种抗组胺 剂与的立体选择性结合。 目前,法是分子相互作用研究中应用最多的毛细管电泳模式。法在测定药 物和蛋白结合作用较强时的结合常数方面优势明显。当然,目前法应用于测定药 物一蛋白的结合常数也存在一些不足之处:蛋白在毛细管内壁吸附的问题仍没有得到很 好的解决,有时需要采用内壁涂层的毛细管以减少吸附;其次,由于多数药物和蛋白有 紫外吸收,当以它们作为缓冲液添加剂时,为降低背景信号及减小噪声,其浓度不能过 大;而在测定结合常数较小的样品时,在允许的缓冲液添加剂浓度范围内,样 品的淌度 变化较小,导致测定误差较大。此外,用法无法得知药物和蛋白质的结合比例, 结 合常数根据化学计量学假说计算,通常认为:,然而结合位点数常常是大于的, 且光 学异构体之间的结合位点数可能是不同的。河北大学理学博十学位论文 ..毛细管电泳一前沿分析法 .方法出现时间相对较短,第一篇文献报道于年【。表.中所列为 法研究药物一蛋白结合的文献。 表. .法在药物一蛋白结合中的应用幻 .蛋白 药物 备注 参考文献 方法验证;与及法比较;与文献数据作 华法林 【】 比较” 方法验证;评价重现性;与超滤法比较;与文献数据 , 异搏定 【】 平衡透析法作比较’。’ 方法验证;评价法研究蛋白结合的立体选择 性:电动进样与流体动力学进样比较;与超滤法比较 ,血浆 僻.异搏定 【】 方法验证:与,,,法比较; , 华法林 评价重现性:分离电压,进样方式,蛋白浓度;与文 】 献数据作比较 尼趵异搏定,僻和 燃 唾液酸残基对立体选择性的作用。 【】 一心得安 ,, 方法验证;心得安与抗胰蛋白酶及结合珠蛋白结合研 种.肾上腺素受体 】 血清 究。 阻断剂 僻.和..异搏定,似. 糖链结构在立体选择性结合中的的作用。 【】 和回一心得安 异搏定,心得安 方法验证;与文献数据作比较。 【】 ,,氧 脂蛋白结合模式;方法验证” 僻.和回.尼伐地平 【】 化 异搏定,心得安布 置换研究;方法验证。 【】 比卡因,华法林 异搏定,心得安 非线性回归、方程和方程法比较。 【】 异搏定 液相预柱毛细管电泳技术 ,】 第章绪论 吡啶茚胺、四氢萘唑 液相预柱毛细管电泳技术,置换研究,对映体选择性 啉、去甲肾素茶碱和 ,】 结合 异搏定 ,,氧 脂蛋白结合模式;方法验证 僻.和回.异搏定 【】 化 。脐带血 胆红素,水杨酸钠 测定残留胆红素的结合能力;置换研究。 ,】 血清 转甲状腺素蛋 配体识别与定量结合;研究蛋白纤维化;与及超 氟比洛芬,氟芬那酸, 【】 白 甲状腺素.硫磺素 滤法比较 限一和.异搏定,. 糖链结构在立体选择性结合中的的作用。 【】 和固.异丙吡胺 氓一和固异搏定,僻 研究氧化在结合中的作用’ 【】 和固.尼伐地平 脂蛋白结合模式/方法验证”。 僻和回.奥昔布宁 【】 方法验证/月旨蛋白结合模式;与超滤法比较” , 僻一和一心得安 【】 苯妥英,磺胺噻唑, 方法验证;加入环糊精以改善阴离子药物与蛋白的分 ,鼠血浆 保泰松,华法林,双 【】 离,并提高灵敏度;与超滤法比较。 氯芬酸,酮洛芬 种低分子量配体: 方法验证;与文献数据比较;置换研究;评价重现性 保泰松,华法林,布 【】 ? 洛芬,氟比洛芬等 方法验证;压力辅助以缩短分析时间,减小毛 . 种碱性及中性药物 【】 细管壁吸附;与文献数据比较: 评价重现性 方法验证:加入葡聚糖以改善阴离子药物与蛋白的分 氟比洛芬,华法林 【】 离 磷脂脂质体 异搏定,心得安 磷脂的氧化在结合中的作用:用脂质体模拟 【】 多奈哌齐 方法验证 【】 酮洛芬 与法作比较。’ 【】 描物与遗传性变型的立体选择性结合的影 凇 丙吡胺 【】 响 河北大学理学博十学位论文 氨氯地平,左旋氨氯地 , 方法验证。 】 平 方法验证 那格列奈 【】 .人血浆, 氯氮平 方法验证;与超滤法比较。 【】 兔血浆及血清 种碱性,中性及酸 短端进样以增加样品通量,减少分析时间 】 性药物 洛美沙星 与,法比较。 【】 ,人血浆 种药物 质谱检测 【】 士的宁 方法验证。 】 .甲基炔诺酮,酮洛 置换研究;方法验证。’ 】 芬 方法验证”。’;短端进样以增加样品通量,减少分析时 ,, 种肾上腺素受体 【】 阻断剂和种吩噻嗪 间: ,, 种抗组胺剂 方法验证”。’;与文献数据比较。’: 】 甘草次酸,利尿磺胺 置换研究;与荧光方法比较 】 和氢氯噻嗪 ,, 种多酚化合物 方法验证”。 】 芦丁 , 方法验证”?,与文献数据比较? 【】 流动注射与,对映体选择性结合,与平衡透析 氨氯地平 【 法及荧光方法比较 方法验证。;与文献数据比较;估算热力数, 种氟喹诺酮 【】 判断相互作用力 布比卡因,溴苯那敏, 脂蛋白 氯丙嗪,丙咪嗪,和 脂质体一缓冲溶液表观分配系数 【】 罗哌卡因 缩写:,高密度脂蛋白;,低密度脂蛋白; 求得结果为结合参数刀,的; 求得结 果为结合参数为游离药物浓度或药物蛋白结合比;对映体分离 等在研究华法林与的结合时发现,方法比法及 第章绪论 法操作简单,具有更高的精密度,并且能够取得与文献更加一致的结果。等 【】用五种方法,,,以及法比较研究了华法林 与及的结合。他们提出,虽然这些方法互为补充,但是由于法简便易操 作,重复性强,能够研究多平衡以及样品消耗较少而更具优势。 方法的建立及优化非常简单。等】用同样的实验条件研究 与种具有不同物理化学性质的低分子量配体的结合,只有两种化合物不能得到结果。 等九和等【分别应用相似的实验条件研究了种.肾上腺素受体阻断 药物和种阳离子及中性药物与和的结合。小组【,??分别研 究了种抗组胺剂,种碱性、中性及酸性药物,种.肾上腺素受体阻断剂及种 吩噻嗪和种多酚化合物与和的结合。 法研究与阳离子药物结合的报道较多,如:心得型? ,异搏定【? ,,】等。这是因为在生理缓冲溶液值下,带负电,而药物带正电,二者的 电泳迁移率有很大差异。另外,阳离子药物与的结合相对较弱,游离药物浓度较 高,因此法非常适用于与阳离子药物结合的研究。而阴离子药物由于具有 与相似的电泳迁移率,游离药物的平台峰不能与有效分离。另外,由于阴离 子药物与具有高亲和性,低浓度的游离药物受紫外检测器灵敏度的限制而无法检 测。因此,法研究与高亲和的阴离子药物的相互作用成为挑战。一些电泳 改性剂如环糊精、葡聚糖等被加入缓冲溶液中以改善各组分的迁移行为,提高 方法的灵敏度。等向电泳缓冲溶液中加入环糊精以改善法 中阴离子药物与的分离。它的分离机制为环糊精与药物分子形成复合物,改变了 药物的迁移率。另外,环糊精复合物的形成能够增加未与蛋白结合的药物比 例,从而间 接改善方法的灵敏度。这个方法需要药物与环糊精形成复合物,而蛋白与环糊 精不发生相互作用,需要测量环糊精复合物的结合度并且涉及到多平衡。等 【,】将葡聚糖加入电泳缓冲溶液,以改善低分子量阴离子配体与之间的分离。它 的分离机制为聚合体溶液的分子筛效应。这个方法可能比加入环糊精更加通用,因为它 不会形成复合物引入第三个分子,而只与相互作用间物种的大小有关。 置换研究能够提供药物结合所需的结构信息,确定药物在蛋白上的结合位点。若两 种药物与蛋白竞争结合,药物从血浆蛋白中置换出来,会导致游离药物浓度增加而产生 河北大学理学博十学位论文 副作用。.法进行置换实验能够得到药物在上的结合位点【?引。 等【】用置换实验得到了异搏定和布比卡因在上的不同结合位点。为研究 的高亲和性配体胆红素,和掣,】发展了一个测定高胆红素血症婴 儿血清与残留胆红素的结合能力的方法。样品中加入水杨酸,用以置换结合 的胆红素,这个方法有效的解决了检测灵敏度的问题。等【影】以.色氨酸/. 氟比洛芬和/.华法林/保泰松为对象,应用法进行了药物置换研究。置换研究 在低药物/蛋白比下进行,以减小与其它低亲和位点间的相互作用。利用进行置换 研究要求被研究的药物与置换剂具有不同的电泳迁移率,如文献【引,或者在选定的检 测波长下仅有一种能够被检出,如文科。 一些进样技术的运用,提高了法的分析速度,使其更加有利于药物一蛋白的 结合研究。等【】分析了种阳离子,中性粒子以及阴离子药物与在近生理 环境下的相互作用。短端进样技术的应用减小了进样量,将分析时间缩短为原来的五分 之一,并获得了与传统法相似的结果。等【】采用压力援助研究种碱 性及中性药物与及的相互作用,使得分析时间缩短,样品通量增加,并且减小 了毛细管壁吸附,从而得到较高的游离药物的平台峰。等【】采用流动注射与 相结合,测定了氨氯地平对映体与的结合,并与平衡透析法及荧光方法作比较。结 果表明流动注射?法适用于研究药物对映体与蛋白间的结合。 在法中可以估算外消旋体药物中每种对映体与蛋白的结合常数。等【? 采用.法研究了异搏定对映体与的立体选择性结合。未结合的药物与在应 用电压下分离,随后,含有两种游离药物对映体的平台峰被电泳缓冲溶液中的手性选择 剂环糊精所分离,从而得到每种对映体的平台峰。等【】研究了异搏定及心得 安对映体与结合的立体选择性。结果表明异搏定与结合具有立体选择性,而心 得安与结合不具有立体选择性。值得一提的是应用液相预柱毛细管电泳 技术,可进行药物对映体与篚竞争性结合作用研究【地。该技术利用与药物在 生理下的电泳特性差异,使留在预柱内或反向流出,不进入手性拆分区域,从而 消除对药物对映体拆分及浓度检测的干扰。 研究结合主要集中在估算其与碱性药物的结合度‘,,,以及阐明 糖链结构在立体选择性结合中的作用陋。等【研究了不同的值对两种第章绪论 点变异的变型与丙吡胺对映体的选择性结合的影响。这个方法可能会有助于遗 传性变型的功能分析。脂蛋白的制备和保存比较困难【,,样品非常珍贵, 而脚法所需要的样品体积很小,并且不存在平衡透析与超滤法中的膜吸附现象,因 此,一法非常适合研究药物与脂蛋白的结合。?法研究了尼伐地平【,,异 搏定【,,心得安【,】及奥昔布宁【】与脂蛋白的结合。 除了以上几种最主要的药物结合蛋白,应用阱法测定药物与其他蛋白的结合亦 有文献报道。文献【】中作者研究了心得安与抗胰蛋白酶及结合珠蛋白的结合。 等【】研究了药物与转甲状腺素蛋白的结合,测定了硫黄素与转甲状腺素蛋白作用的亲和 常数。另外,药物与鼠血浆【,脐带血清【,扪,兔血浆与血清【及人血裂?】 的结合研究亦有报道。 法的优点是:需要的样品量少,对于稀少或难获得的蛋白结合研究如脱唾液 酸蛋白和脂蛋白特别有用;以含有药物和蛋白的平衡溶液直接进样,能够客观反映药物 在体内与蛋白结合的真实情况。可以同时从药物平台峰的峰高计算出平衡液中游离药物 的浓度,能够进行多平衡分析,获得的信息较全面。测定结果不受离子迁移时间的影响, 由于平台峰的高度不受迁移时间,电渗流,毛细管长度以及应用电压的影响,分析的精 密度高。原理简单,操作简便。但是,由于血浆与血清样品中组份多,常常会干扰药物 峰,并且由于粘度较高,常常会引起堵塞毛细管的问题,法尚不能用于药物与血 浆及血清结合的日常分析。分析通常采用紫外检测器,检测灵敏度较低。等 发展了质谱检测药物与及血浆相互作用的法。他们发现,不论药物浓度 与缓冲溶液类型,紫外和质谱测定血浆蛋白结合都能得到~致的结果,只是质谱检测的 重现性比紫外差。采用质谱检测时,为了不受普通运行缓冲溶液离子抑制的影响,需 要挥发性的缓冲溶液,且存在低度或中度结合的药物在低浓度时随时间损失 的问题,因 此,与质谱检测的联用目前仍然不能用于日常分析。 .. 法及法 等【用包括法和法在内的种法测定了华法林和牛血清白蛋 白的结合常数。等【】用实验证明法能够用于研究几种共用药物与蛋白的竞争 性结合。与毛细管电泳间接检测方法一样,法及法中过大的背景吸收会使 河北大学理学博十学位论文 检测灵敏度降低,因此限制了它们在药物一蛋白结合研究中的应用。 .. 法 等【】和等【】用此方法测定了华法林和牛血清白蛋白的相互作用。还 有作者运用此方法测定、与卡维地洛‘以及与呋塞米、头孢曲松的 结合常数。等【用此法测定了铂抗癌药与及铁传递蛋白的结合常数。通过 与其他方法数据对比,证明了法能够用于慢速动力学的药物一蛋白结合常数的测 定。 .本论文研究的目的和主要研究内容 由于具有仪器简单,分析时间短,分离效率高,需样量少,以及研究在近生理环境 中进行等优势,法已成为研究药物一蛋白结合的有效技术,应用范围正日益 扩大,拥 有极其广阔的发展前景。本课题就是针对在药物一蛋白相互作用研究中的巨大潜力, 研究强力霉素、氟喹诺酮类药物以及与及血浆的相互作用,测定其结合位点数,结 合常数,药物蛋白结合比,结合过程的焓变、熵变、吉布斯自由能等热力学参数,探讨 结合过程的推动力及作用力类型,以及药物在分子上的结合部位,建立高效、快速 以及适用范围更广的药物与蛋白相互作用的研究方法。第章强力霉素与人血清白蛋的相?作用 第章 强力霉素与人血清白蛋白的相互作用 .引言 蛋白结合对药物的分布、代谢以及疗效均具有潜在的重要作用,已被认为是药物 最重要的物理化学性质之一【。药物分子与蛋白的相互作用使之形成一个稳定的药物 一蛋白复合物。当游离药物代谢或被组织清除后,药物一蛋白复合物可以部分解离而补 充游离药物的浓度。血清白蛋白是循环系统中最重要的可溶性蛋白,具有很多生理功 甜。探索白蛋白与分子的结合是必须且非常重要的,已经成为生命科学、化 学及临 床医学中一个重要的研究领域【,。 许多方法能够进行药物一蛋白结合的研究,包括:平衡透析【?一,超滤【?,超离 心【】,凝胶过’滤【,微透析用,圆二色光谱【】,荧光光谱【】,高效液相色谱法,尤其是 高效前沿分析‘和高效亲和色谱法【,以及毛细管电泳法等。由于具有仪器简 单,易于自动化,分析时间短,分离效率高,需样量少以及研究在近生理环境中进行 等优势,毛细管电泳法成为研究药物一蛋白结合的有效技术【。 毛细管电泳法研究药物一蛋白结合有很多模式,如亲和毛细管电泳【,空 峰法】,法】,空亲和毛细管电泳法 【以及前沿分析法【】。与其它毛细管电泳技术相比,毛细管电泳一前沿分析 法更加适合于药物一蛋白结合研究,因为它简单,快速,易于操作,蛋白消耗量少,且 能够用于多平衡研列。 图.强力霉素的化学结构式 . 河北大学理学博学位论文 强力霉素结构式见图.属四环素类广谱抗