植物脱毒技术

植物脱毒技术 第六章 植物脱毒技术 病毒对寄主植物可造成毁灭性危害，导致大幅度减产，甚至全株死亡。潜隐性病毒侵染植物造成症状不明显的慢性危害，不易被发现，尤其危险。国内外解决作物病虫害的有效途径是培育无病毒苗，实施农作物无病毒化栽培。 所谓“无病毒苗”，是指不含该种植物的主要危害病毒，即经检测主要病毒在植物内的存在表现阴性反应的苗木。因此，培育无病毒母株，是获得无病毒苗的根本途径。 一、病毒在植物体内的分布及危害 1、病毒在植物体内的分布 ?向附近细胞转移 ?由表面向韧皮部转移 1943年，White首先发现已感染烟草花叶病毒的烟草植株。1948—1949年，Holmes和Masset等证实了病毒的分布随植株不同部位和年龄而异。 老叶和成熟的组织中病毒含量高，幼嫩和未成熟的组织及器官中病毒含量较低，在根尖、茎尖点约0.1~1mm区域中几乎不含病毒。 病毒是通过筛管组织或胞间连丝传播至其他组织细胞的，而茎尖分生组织无分化，没有维管组织，因此，该区病毒数量很少。 2、病毒的危害 病毒可通过营养体及刀具、土壤传递给后代，而多数作物是经过无性繁殖的，很容易受到病毒的侵染。 已发现的植物病毒超过500种，严重危害着农业的生产。如草莓病毒曾使日本草莓的产量严重下降，品质退化。 病毒危害极大，但不能通过化学杀菌和抗生素进行防治和消除，主要是因为杀毒的同时会伤害植物又不能治愈全株植物。因此，研究脱毒意义重大。 二、植物脱毒的意义 1、能够有效地保持优良品种的特性 任何一种优良品种均需要有一个忠实地保存其遗传性状的繁殖方法。 离体无性繁殖由于繁殖体系是建立在体细胞的基础上，繁殖过程在人工控制的环境下进行，所以既不会造成性状分离，也不会产生退化，同时还避免了病虫害的侵染，从而可以很好的保持品种的优良特性，是异交作物和无性繁殖品种繁育的理想途径。 2、快速繁殖品种，使优良品种迅速应用 离体繁殖因为周期短(1~3个月)，不受季节限制，繁殖系数高(几十~几百倍)，因此其繁殖速度是任何其他方法所不能比的，所以离体繁殖又称之为快繁。 3、生产无病毒种苗，防止品种退化 目前受病毒危害严重影响生产的有: 大田作物:马铃薯、甘薯、甘蔗、烟草; 蔬菜:白菜、大蒜、葱、番茄、箩卜; 果树:柑橘、苹果、草莓、香蕉; 花卉:香石竹、各种菊花、天竺葵、紫罗兰等。 4、节约耕地，提高农产品的商品率 块根、块茎、鳞茎为繁殖器官的作物，每年产品用留作种的比例: 大蒜:留种量占产量的五到八分之一;马铃薯:留种量占产量的十分之一;贝母:留种量占产量的三分之一。 5、便于运输 常规的块根、块茎等，体细胞大、含水量高，包装、运输十分不便，特别是远距离运输损失很大，而离体繁殖的种苗体积小，一般自带容器，很易携带，运输十分方便。 以马铃薯为例子: 按一亩地4000株计算，常规薯4000个重200kg(每个50g)，若用试管薯4000个则只有2kg(每个0.5g)。 三、植物脱毒的原理和方法 (一)热处理脱毒法 1、热处理脱毒原理 病毒DNA分子进入细胞后随植物细胞的DNA一起复制。热处理并不能杀死病毒，只能钝化病毒的活性，使病毒在植物体内增殖减缓或增殖停止，而失去传染能力。 2、热处理方法 (1)愈伤组织热处理 离体培养 愈伤组织 热处理继代 分化培养。 常用处理温度及时间:低温37—38?处理2周、4周或8周;或高温50?处理3—5min。 (2)热空气处理脱毒法 将试验母株放在高温生长室中生长一阶段，使其顶端分生组织比次生分生组织生长迅速，然后切取其茎尖分生组织进行离体培养。生长室温度35—40?。光照3000—10000lx。 3、热处理的局限性 (1)并非所有的病毒都对热处理敏感。一般的热的处理只对等径的、线状的病毒和类菌质体起作用。 (2)延长热处理时间，病毒钝化效果好，同时也可能会钝化植物组织中的抗性因子而降低处理效果。 (3)热处理后只有一小部分植株能够存活。 (二)组织培养脱毒法 包括微茎尖培养脱毒、愈伤组织培养脱毒、珠心组织培养脱毒3种方法。 1、微茎尖培养脱毒法 由于其脱毒效果好，后代遗传稳定，是目前植物无病毒苗培育上使用最广泛的一种方法。 (1)原理及依据 a、病毒在植物体内分布不均匀，越接近顶端分生组织，病毒浓度越稀，因此，可以采用小茎尖的离体培养脱除植物病毒。 b、病毒DNA分子与细胞分裂蛋白质合成竞争，在迅速合成的植物细胞中正常合成的蛋白质占优势。 (2)操作程序 外植体经表面消毒灭菌后，在解剖镜下，经无菌操作切取小茎尖，接种到备用培养基上，放入培养室内进行培养，并及时观察和记录培养结果。 优缺点: 茎尖越小，去病毒机会越大，脱毒效果就越好，但同时因为其含营养及水量太低，故培养时对培养基的要求就越高，对剥离技术要求也越高。 2、愈伤组织培养脱毒法 (1)原理及依据 a、病毒在植物体内不同器官或组织分布不均匀; b、病毒复制的能力衰退或丢失; c、继代培养的愈伤组织产生抗性变异。 (2)技术关键 诱导可再生出植株的愈伤组织。 (3)操作程序 植物各种器官或组织诱导产生出愈伤组织，愈伤组织多次继代，然后从愈伤组织再诱导分化芽，长成植株。 愈伤组织培养脱毒法脱毒效果不定，另外经由愈伤组织产生的植株可能出现一些变异，这些变异往往是人们不希望出现的，这种脱毒的方法使用的不多。 3、珠心组织培养脱毒法 病毒是通过维管组织传播的，而珠心组织和维管束系统无直接联系，故可以通过珠心组织离体培养获得无病毒植株。 缺点:会有20%~30%左右的变异率，同时无毒苗苗期较长。 (三)微体嫁接离体培养脱毒法 这种方法是把极小的茎尖作为接穗嫁接到实生砧木上，然后将嫁接后的砧木接种到新的培养基上培养。接穗在砧木的饲喂下很容易成活。由于微体嫁接的接穗是很小的茎尖，微茎尖的带毒几率很小，故采用微体嫁接的方法可以获得无毒苗。 微嫁接要求的剥离技术很高，嫁接成活率与接穗大小呈正相关，而脱毒率与接穗大小呈负相关。 四、植物脱毒苗的鉴定 1、视觉观察法 看植株的茎叶是否有该病毒所有可见症状。 2、生物鉴定法 利用摩擦接种，把待测的植物液汁接种在敏感植物上，然后视其有无病斑，来判断是否脱除了病毒;也可以采用嫁接鉴定法来鉴定。 3、电子显微镜鉴定法 用电子显微镜直接观察经脱毒培养的叶片，检查是否有病毒粒子存在，还可以测量病毒颗粒的大小、形状和结构。 4、抗血清鉴定法 利用抗原与抗体特异反应的特性，用已知病毒的抗血清来鉴定未知病毒的种类，其中酶联免役吸附反应(ELISA)是常用的一种方法。 5、分光广度法 即把病毒的纯品干燥、称重，配成已知浓度的病毒悬浮液，在260nm下测其光密度，并折算成消光系数。利用分光广度法测得的病毒浓度是指全部核蛋白的浓度。 五、无病毒种苗的保存、应用及繁殖 (一)无病毒原种的保存 获得无毒原种不易，如果保存不好会很快重新感染病毒，为防止再度感染，应在隔离的条件下保存。如果原种保存得好，无毒原种可以利用5—10年，在生产上可以创造更多的经济效益。 1、隔离种植保存 通过无毒原种要在隔离区或隔虫网室内种植保存。无毒原种即使种植在隔离区，仍有可能被重新感染，因此还要定期进行重感病毒的检测，一旦发现隔离区内有感病毒时，应采取相应措施排除病毒再次传播。 2、离体保存 脱毒苗经鉴定后，选择无病原种株系，回接于试管内，可长期保存，是最理想的保存方法。 (二)无毒原种的应用 获得无毒原种后，一方面要积极进行无毒苗的推广，另一方面还要做好无病毒种的繁育。 无毒苗的推广应在发展良种的新区使用才能取得良好的效果;在老病区使用时应实行统一的防治措施，一次性全区换种，才能取得应有的效果。 (三)无病毒原种的繁殖 可在无毒源和其他病虫害的大田中进行，场地土壤要进行消毒，防治蚜虫、线虫和其他传毒媒介，并建立一套严格的原种繁育和栽培，防止病毒的再次感染。 ?离体繁殖的使用范围 用于加速某些难繁殖或繁殖速度很低的植物，或某些需要加速繁殖的特殊基因型，如名 贵花卉、优良资源、果树芽变分离、工程植株等。用于自然繁殖极易感染病毒的植物，如马 铃薯、甘薯、甘蔗、香蕉、石竹、百合等。用于有性繁殖变异范围大而自然条件下又不易无 性繁殖的植物，如非洲菊、花竹、紫罗兰等。