蛋白类生物活性物质

蛋白类生物活性物质 第一章 蛋白类生物活性物质 本章要点 1. 免疫球蛋白的基本概念、分布、结构与组成 2. 牛乳中的免疫球蛋白 3. 免疫球蛋白的生物学功能 4. 乳铁蛋白的基本性质、生物活性及其影响因素 5. 乳铁蛋白的分离方法 6. 溶菌酶的基本性质、加工适应性及其在食品中的应用 免疫球蛋白作为重要的蛋白类生物活性物质，目前有着比较广泛的研究背景和应用潜力，乳铁蛋白和溶菌酶等作为具有抑菌蛋白已经得到广泛的关注，因此本章介绍了它们的基本概念、来源与分布、结构与组成、生物活性等。 第一节 免疫球蛋白 免疫球蛋白(Immunoglobulin，简称Ig)是一类具有抗体活性，能与相应抗原发生特异性结合的球蛋白。免疫球蛋白不仅存在于血液中，还存在于体液、粘膜分泌液以及B淋巴细胞膜中。它是构成体液免疫作用的主要物质，与补体结合后可杀死细菌和病毒，因此，可增强机体的防御能力。 目前，食物来源的免疫球蛋白主要是来自乳、蛋等畜产品。特别是近年来人们对牛初乳和蛋黄来源的免疫球蛋白研究开发的较多。 在牛初乳和常乳中，Ig总含量分别为50和0.6mg,mL，其中约80,,86,为IgG。人乳免疫球蛋白主要以 IgA为主，含量为4.1,4.75μg,g。 从鸡蛋黄中提取的免疫球蛋白为IgY，是鸡血清IgG在孵卵过程中转移至鸡蛋黄中形成的，其生理活性与鸡血清IgG极为相似，相对分子质量164000。其活性易受到温度、pH的影响。当温度在60?以上、pH<4时，活性损失较大。 一、Ig的基本概念 从功能性食品角度考虑，能够与病原微生物、毒素等许多抗原发生特异性结合的Ig，其功能性机制十分确切。Ig特殊性表现在:?生物合成的分子遗传学较为特别;?异种性，即表现型很多;?具有极其重要的生物功能。由于这些特征，必须借助一定工具才能对它们正确定性和命名。1964年，WHO首次提出了人体免疫球蛋白的名称，一直延用至今，并用相似体系对牛以及其他动物的这类物质进行了命名。实践上，免疫球蛋白的分类与命名在很大程度上依据免疫化学，包括与参照蛋白质 (一般来源于人)的交叉反应性。 (一)Ig的分类与命名 实际测定每一种免疫球蛋白的结构是难以实现的工作，故通常根据免疫反应特性进行Ig分类。 免疫球蛋白通常具有抗体活性，但其本身对其他种动物或同一种系不同个体来说，也是一种抗原物质。免疫球蛋白产生的遗传背景不同，其抗原性也有差异，它们在异种、同种异体和同一个体内可引起免疫应答,产生相应的抗体(抗—抗体)。因此，可利用血清学方法测定和免疫球蛋白的抗性，据此可将Ig分为同种型、同种异型和独特型三种血清型。 1 1. 同种型(Isotype) 它是指同一种属所有正常个体免疫球蛋白(Ig)分子共同具有的抗原特异性标志。同种型免疫球蛋白抗原特异性因种而异。根据Ig重链或轻链恒定区肽链抗原特异性的不同，可将Ig分为若干类、亚类和型、亚型。 ? 类和亚类:根据免疫球蛋白重链恒定区(CH区)肽链抗原特异性的不同，可将人免疫球蛋白分为IgG、IgA、IgM、IgD和IgE 5类。这5类免疫球蛋白的重链分别以希腊字母γ、α、δ、η和ξ表示。这些重链间恒定区内的氨基酸组成约有60,的不同，也即有约40,相同，其含糖量也存在明显差异。 同一类免疫球蛋白，因其重链恒定区内肽链抗原特异性仍有某些差异，所以又可将它们分为若干亚类。目前已经发现，IgG有4个亚类即IgG、IgG、IgG、IgG，IgA有 IgA和IgA两个亚类，IgM123412有IgM和IgM两个亚类，而IgD和IgE尚未发现有亚类。各类Ig不同亚类间的氨基酸组成约有10,12 的差异。 ? 型和亚型:各类免疫球蛋白根据轻链恒定区肽链抗原特异性的不同，可分为κ和λ两型。每个Ig分子中的两条轻链都是相同的，在一个Ig单体分子上不可能同时出现κ和λ型轻链。由于λ型轻链恒定区内氨基酸仍存在微小差异，因此又可将其分为4个亚型。 2. 同种异型(Allotype) 同种异型是指同一种属不同个体所产生的同一类型Ig由于重链或轻链恒定区内一个或数个氨基酸不同(即遗传标志不同)而表现的抗原性差异。 目前已在IgG和IgA重链(γ和α)恒定区及κ型轻链恒定区中发现有决定同种异型抗原特异性的遗传标志，简称为同种异型标志。 3. 独特型(Idiotype) 独特型是指不同B细胞克隆所产生的免疫球蛋白分子V区和T、B细胞表面抗原(识别)受体V区所具有的抗原特异性标志。 (二)Ig的定义 根据上述分类和命名，免疫球蛋白(Immunoglobulin，简称Ig)定义为具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白。 免疫球蛋白过去也称为γ—球蛋白，主要存在于血液和某些分泌液中。应指出，抗体都是免疫球蛋白，而免疫球蛋白并不一定都是抗体。如骨髓瘤患者血清中浓度异常增高的骨髓瘤蛋白，虽在化学结构上与抗体相似，但无抗体活性，没有真正的免疫功能，因此不能称为抗体。可见，免疫球蛋白是化学结构上的概念，而抗体则是生物学功能上的概念。 二、Ig的分布 免疫球蛋白是在人的体液中广泛分布的一种免疫物质。人乳中以IgA为主，牛乳中则主要以IgG含量最高。牛初乳中Ig的含量受多种因素制约，如乳牛的年龄影响乳中Ig的含量和类型，较老的乳牛初乳量少且含IgG(IgG、IgG)低，IgG,IgG的比值较年龄小的乳牛高。乳中Ig的浓度不受血液1212 中Ig浓度的影响，而与泌乳阶段有关，如初乳、末乳Ig含量较高。 不同动物乳汁和血清中Ig的含量如表1—1所示。各种体液中免疫球蛋白的含量如表1,2所示。 表1,1 不同动物乳汁、血清中Ig的含量 -1种类 免疫球浓度,mg?mL Ig主要成分含量,, 蛋白 血清 初乳 常乳 血清 初乳 常乳 人 IgG 12.1 0.43 0.04 78 IgA 2.5 17.35 1.00 90 87 IgM 0.93 1.59 0.10 96 76 , FSC 2.09 0.02 2 狗 IgG 11.1 23.4 0.24 81 68 IgA 0.7 9.8 2.63 85 IgM 1.7 0.8 0.22 猪 IgG 21.5 58.7 3.0 89 80 IgA 1.8 10.7 7.7 70 IgM 1.1 3.2 0.3 马 IgG(总) 21.9 113.4 0.39 89 88 IgG(T) 8.2 15.2 0.09 43 IgA 1.5 10.7 0.48 IgM 1.2 5.4 0.03 牛 IgG(总) 25.0 32,212 0.72 88 85 66 14.0 20,200 0.6 IgG1 IgG 11.0 12.0 0.12 2 IgA 0.4 3.5 0.13 IgM 3.1 8.7 0.04 FSC 0.5 0.2 表1,2 在各种体液中免疫球蛋白的含量 单位:mg,dL 种类 IgA IgG IgM IgA,IgG 血清 200 1.30 120 0.15 耳下腺唾液 3.95 0.036 0.043 109 颚下腺唾液 4.5 0.04 0.06 112 鼻液 20 10 痕量 2 鼻液(刺激后) 144 16 0.8 9 汗 0.8 3.2 ,0 0.25 初乳(人) 600 30 50 20 泪 20 痕量 ,0 , 胃液 56 20 3 2.8 肠液 150 140 , 胆汁 160 145 , 1.1 前列腺分泌液 26 150 , 0.3 腔分泌液 6.3 36 , 0.2 羊水 1.6 21 , 0.76 脑髓液 1.8 7.9 , 0.08 十二指肠液 23 1.2 1.5 19.2 空肠液 160 22 1.5 7.3 粪便 17 1 3 17 ,1尿,mg?d 1.1 3.0 , 0.37 支气管分泌液 8.2,70 5.6,60 , 1.5 三、Ig的结构和组成 (一)基本结构 1962年，Porter首先提出IgG分子的化学结构模式。后来证实，其他几类Ig也都具有与IgG相似 3 的基本结构。图1,1为免疫球蛋白的结构示意图。总体上看，所有Ig的基本结构均由4条多肽链，即2条相同的重链和2条相同的轻链借二硫键连接组成的对称结构。活性Ig可以是这种基本结构单位的单体或聚合体。对于聚合态免疫球蛋白IgA和IgM而言，比IgG基本结构多了附加的多肽链。此外，Ig为糖蛋白，糖基连接于重链。 图1,1 免疫球蛋白的结构 Ig的基本组成:?2条重链，每条均有1个由310,500个氨基酸残基(因类别不同而异)组成的恒定区(constant region)和1个由107,115个残基(因可变区亚群不同而异)组成的可变区(variable region)构成;?2条轻链，每条也分别含有1个恒定区(107,110个氨基酸残基)和1个可变区(107,115个残基)。免疫球蛋白的轻链和重链之间依靠二硫键以及其他非共价键结合，形成一个整体。抗原结合部位正是在重链和轻链的可变区内，故这些区域的结构决定了抗体结合抗原的特异性。 IgG的重链(H链)分子质量约49 893，由440个Aa残基组成。其中N端1,4区域因氨基酸组成及排列顺序多变，称重链可变区 (VH区)，特别是其中第31,35，49,66，86,91和101,110位置上的氨基酸具有更大的变异性，称之为超变区(HV区)。重链可变区中非HV区部分称为骨架区。重链剩余3,4区域因氨基酸组成和排列顺序变化较小且相对稳定，称重链恒定区(CH区)。 IgG轻链(L链)分子质量较小，约24 974，由214个Aa残基组成。其中近N端1/2区域因氨基酸组成及排列多变，称为轻链可变区(VL区)，其中第26,34，50,56，89,93位置上的氨基酸具有更大变异性，称之为超变区。轻链剩余1/2区域因氨基酸组成及排列顺序相对稳定，故称轻链恒定区(CL区)。 如图1,1所示，Ig分子中两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键维系构成，其中每条肽链又可被链内二硫键连接折叠成几个球形结构，这种结构使一系列对于Ig生物功能有贡献的氨基酸彼此靠近，集中在一个部位，称为Ig的功能区(domain)。IgG、 IgA和IgD的重链有4个功能区，即VH、CH、CH和CH;IgM和IgE的重链还有第5个功能区(CH);轻链则有VL和CL两个功能1234 区。各区主要功能如下:?VH和VL为抗原特异性结合部位;?CH和CL为Ig遗传标志;?IgG,13 的CH和IgM的CH是补体(Clq)结合部位，参与补体激活;?IgG的CH和IgE的CH有亲细胞2334活性，能使Ig结合固定于具有相应受体的组织细胞表面。 介于CH和CH功能区之间的区域称为铰链区(hinge region)，此区含大量脯氨酸和二硫键，富12 有柔性，张合自如，可伸展180?。此种结构有利于补体结合部位的暴露，为补体活化创造条件。此外， 4 该区对木瓜蛋白酶和胃蛋白酶敏感，经酶处理后可从该处断裂成几个不同的片段。 免疫球蛋白的恒定区结构仅仅用于定性、分类，借以区分成各种类、亚类或者型、亚型。重、轻链的恒定区几乎决定了整体Ig分子的全部抗原性。 (三)IgG的氨基酸组成 蛋黄IgG(即IgY)、鸡血IgG和牛乳IgG的氨基酸组成见表1—3。牛IgG与鸡IgG显著不同，前者的Asp、Thr和Ser含量较高，而Gly、Ala和Leu的含量较低。用于制造功能性食品，为提高IgG对特定抗原的效果，常对动物进行免疫处理，它对IgG氨基酸组成一般无影响。 表1,3 IgG和IgY的氨基酸组成 单位:,(质量分数) 氨基酸种类 普通母鸡 免疫母鸡 鸡血 牛乳 IgY IgY IgG IgG Asp 6.9 6.8 6.7 8.1 Thr 8.3 8.3 8.5 9.9 Ser 12.3 12.4 12.7 14.4 Glu 9.3 9.2 8.8 9.2 Pro 7.5 7.1 7.1 6.8 Gly 9.8 9.9 9.9 7.7 Ala 8.0 8.0 8.4 5.4 1/2Cys 2.3 2.5 2.5 2.2 Val 7.5 7.5 7.8 8.4 Met 1.0 1.0 1.0 0.9 Ile 3.1 3.1 3.1 2.6 Leu 8.2 8.2 8.2 6.9 Tyr 3.2 3.2 3.3 4.0 Phe 2.8 2.8 2.8 2.7 Lys 3.5 3.5 3.2 5.5 His 1.6 1.6 1.3 1.6 Arg 4.8 4.7 4.7 3.7 四、牛乳中的Ig 乳牛或其他物种通过乳腺分泌的免疫球蛋白并非乳腺独有的产物，乳腺局部合成与机体其他部位合成的免疫球蛋白完全相同。然而，乳腺分泌物，尤其是初乳，独到之处在于富集了各种Ig，总浓度高于血液或者其他外分泌液。现已经证实，牛初乳中存在IgG、IgA、IgM、IgE和lgD等5类Ig，其中IgD尚未发现具有作为功能性食品的潜力。人乳及牛乳之间、初乳与常乳之间各类Ig的含量差别很大(表1,4)。表1,5为牛乳Ig主要理化性质和生物学活性。 IgG是牛初乳和常乳中含量最高的Ig，例如牛初乳中IgG占Ig总量的55,以上。 IgG占血清Ig总量的75,,80,，多以单位形式存在，分子质量为149 680。IgG也是血清半衰期(约23天)最长的Ig，主要由脾脏和淋巴结中的浆细胞合成，是机体重要的抗菌、抗病毒和抗毒素抗体。牛初乳Ig在乳牛体内半衰期约21天，但牛犊持续摄入初乳在 4,6个月内均有较强的抗病能力。IgG更是惟一能通过胎盘的抗体，故对哺乳动物新生幼仔、新生儿抗感染起重要作用，通常婴儿出生后3个月内不能合成IgG。 表1,4 牛乳和人乳免疫球蛋白含量比较 单位:g/L 牛乳 人乳 免疫球蛋白 5 初乳 常乳 初乳 常乳 IgG 0.40 0.04 47.60 0.60 , , IgG1 IgG 2.90 0.02 , , 2 IgA(SIgA) 3.90 0.14 17.40 1.00 IgM 4.20 0.05 1.60 0.10 SC 0.20 0.05 2.10 微量 表1,5 人、牛的Ig主要理化性质和生物学活性 理化与生物活性 IgG IgM IgA,SIgA IgD IgE 分子质量 150 000 900 000 16 000,390 000 185 000 190 000 沉降系数(S,) 7 19 7,11 7 8 重链 类 γ μ α δ ε 亚类 γ、γ、γ、γ μ、μ α、α , , 12341212 轻链 型 κ、λ κ、λ κ、λ κ、λ κ、λ 主要存在形式 单体 五聚体 单体或二聚体 单体 单体 抗原结合价 2 5,10 2,4 2 2 半衰期(天) 23 5 6 3 3 体内开始形成时间 出生后3个月 胚胎末期 出生后4,6个月 较晚 较晚 生物学活性 通过胎盘、激活补激活补体、抗抗菌、抗病毒、粘膜无抗体活性 亲细胞活性、 体、亲细胞活性、调菌、抗病毒 局部免疫 理作用、抗菌、抗病 毒 -13, 1S,10s 牛乳IgG至少包括两个亚类IgG和IgG，它们与相应抗原结合后可激活补体，但各亚类与补体结12 合的能力不同，一般认为IgG>IgG。在牛初乳和分娩前乳腺分泌物中，IgG占总乳清蛋白的近80,，121 在初乳乳清中浓度超过100mg,mL。 牛IgM通常以四链单体的五聚物形式存在，沉降系数为19S，IgM单体经J链连接予以IgM较高的抗原结合效价，在补体和吞噬细胞参与下，其杀菌、溶菌、激活补体和促吞噬等作用均显著强于IgG。脾脏是IgM的主要合成部位。IgM分子质量大，不能通过血管壁，几乎全部分布于血液中，占血清Ig总量的5,,10,。 机体感染后血液中最早产生的Ig是IgM。鉴于IgM在血清中的半衰期(5天左右)比 IgG短，所以血清中特异性IgM含量增高提示有近期感染，临床上测定血清特异性IgM含量有助于早期诊断。目前已知天然血型抗体、类风湿因子和冷凝集素等均为IgM类抗体。 1965年前后，一些研究者在牛体和血清中发现了分泌型IgA。牛IgA最有趣的特性在于它在乳汁中相对浓度较低。在大多数其他牛外分泌物中，IgA均为一种主要的免疫球蛋白，但在牛初乳和常乳中含量相对较低。分泌型IgA为人初乳中含量最高的Ig，初产、年轻妇女乳汁IgA浓度以较快速度下降。牛初乳中IgG可部分替代IgA的生物功能。 血清型IgA和分泌型IgA不能通过胎盘。婴儿在出生4~6个月后才能自身合成IgA，需从母亲乳汁中获得分泌型IgA，这对婴儿抵抗呼吸道和消化道病原微生物的感染具有重要意义。这是大力提倡母乳喂养的重要原因之一。 五、Ig的生物学功能 6 Ig的生物学功能和抑菌特性如表1—6、表1—7所示。以下简要介绍Ig的几个主要生物学功能。 表1,6 各种Ig的生物学功能 功能 IgM IgD IgG IgG IgG IgG IgA IgA IgE 123412活化补体 ，，， , ，， ， ，，， , , , , (经典途径) 活化补体 , , , , , , , , , (旁路途径) 胎盘通过性 , , ， ， ， ， ， ， , 体外分泌 ， , ， ， ， ， ，，， ，，， , 结合细胞 中性粒细胞 , , ， , ，， ， ， ， , 嗜酸性粒细胞 , , ， , ， , , , ， 嗜碱性粒细胞 , , , , , , , , ， 淋巴细胞 ， ， ， ， ， ， ， ， ， 乳突细胞 , , , , , , , , ，，， 血小板 , , ， ， ， ， , , , 巨噬细胞 , , ， , ， , , , ， 生物功能 凝集反应在淋巴细胞在血管外体液中含量最多，对异物反应 在消化道、气管表面存在，对异 的主体 表面存在 物反应 表1,7 Ig能抑制的微生物和毒素 微生物 毒素 Shigella dysenter Influen virus(毒素) Shigella flexncri 1 Diptheria toxin Shigella flexncri 6 Tetanus toxin Shigella sonnei Streptolysin Salmonela Poli virus(毒素) Escherichia coli oill:B 4 Bacteroides fraglis Streptococci Pneumococci (一)与相应抗原特异性结合 免疫球蛋白最主要的功能是能与相应抗原特异性结合，在体外引起各种抗原-抗体的反应。抗原可以是侵入人体的菌体、病毒或毒素，它们被Ig特异性结合后便丧失破坏机体健康的能力。需指出，若Ig发生变性，空间构象发生变化便可能无法与抗原发生特异性结合，即丧失了相应的抗病能力。 (二)活化补体 IgG和IgM与相应抗原结合后，可活化补体经典途径(Classical pathway，CP)，即抗原—抗体,13 复合物刺激补体固有成分C1,C9发生酶促连锁反应，产生一系列生物学效应，最终发生细胞溶解作用的补体活化途径。 通常Ig分子呈“T”型，与抗原结合后发生构型改变而呈“Y”型，此时IgG分子中原来被掩盖的CH功能区即补体结合点所在处得以暴露，从而使C19与该区补体结合点结合，启动活化途径。IgG21的补体结合点位于CH功能区，而IgM的补体结合点则位于CH功能区。两类Ig活化补体的能力—323 也有所不同，一般地，一个IgM分子就可活化补体经典途径。IgA和IgE不能通过经典途径激活补体，但它们的凝聚物能活化补体旁路途径(Alternative pathway，AP)。 7 (三)结合细胞产生多种生物学效应 免疫球蛋白(Ig)能够通过其FC段与多种细胞(表面具有相应FC受体)结合，从而产生多种不同的生物效应。 (四)通过胎盘传递免疫力 Ig的转移方式，不同类型的Ig在不同的动物的母体和幼体间有不同的Ig转移方式，对于在多种病原菌中出生的幼体，母亲传递给幼体多种抑菌物质，Ig是其中最主要的一种。 第二节 乳铁蛋白 近年来，乳铁蛋白(Lf)的研究受到广泛重视。1993年在日本召开了第一届乳铁蛋白(Lf)的结构与功能的国际会议，会上研究者就Lf的铁结合机制、生物功能、医学临床应用和食品中的应用进行了探讨，这标志着Lf特有的生物学意义已受到世界范围的广泛重视。 一、Lf的基本性质 (一)Lf的基本结构和组成 乳铁蛋白是一种天然蛋白质的降解物，存在于牛乳和母乳中。乳铁蛋白晶体呈红色，是一种铁结合性糖蛋白，相对分子质量为 77100?1500。牛乳铁蛋白的等电点(pI)为8，比乳铁蛋白高2个 pH单位。在1分子乳铁蛋白中，含有2个铁结合部位。其分子由单一肽键构成，谷氨酸、天冬氨酸、亮氨酸和丙氨酸的含量较高;除含少量半胱氨酸外，几乎不含其他含硫氨基酸;终端含有一个丙氨酸基团。 1939年，Sorensen等人在分离乳清蛋白时得到一种红色蛋白，Polis等人在分离 Lp时也得到部分纯化的红色蛋白，但直到1959年Groves用色谱法得到纯的红色物质后，才确认这种红色物质是一种含铁蛋白质，称之为乳铁蛋白(Lactoferrin，Lf)，又称红蛋白。 通过Lf的组成和氨基酸顺序分析，证明它是由转铁蛋白(Transferrin，Tf)演变而来。各种哺乳动物(如人、羊、牛)的乳铁蛋白在氨基酸排列上有较小的差异。Lf的相对分子质量是77000?2000， ，3它是一种铁结合糖蛋白，1分子 Lf能结合两个Fe离子，含15,16个甘露糖，5,6个半乳糖，10,11个乙酰葡萄糖胺和1个唾液酸，其中中性糖8.5,，氨糖2.7,。 乳清Lf和初乳Lf有相同的性质。X光衍射实验(XRD)表明，其主体呈无柄银杏叶并列状结构，铁离子结合在两叶的切入部位，Fe离子的间隔为0.28,0.43μm，椭圆形叶的大小为 0.55μm?0.35μm?0.35μm。 乳铁蛋白由乳腺合成，分娩后乳腺合成Lf的能力减弱，故其含量在分娩几天后迅速下降。乳铁蛋白是由血清中转移而来。现已证明乳铁蛋白有两种分子形态，相对分子质量为86 000和82 000，其主要差别在于它们所含的糖类不同，经溴化氰切断和脱糖化实验证实Lf是以复相分子形式存在，它们的生理功能的差别尚不清楚。 (二)Lf的金属结合性质 ，，，332 1分子饱和Lf中含两个Fe离子。乳铁蛋白不仅能结合Fe，且对Cu也有结合作用，其结合能 ，2力也是每个Lf分子含两个Cu。在乳铁蛋白和Fe或 Cu形成络合物的过程中有碳酸氢盐的参与，Fe或Cu和碳酸氢盐的比例为1:1，碳酸氢盐的存在对络合物的生成有催化作用。维生素C对缺铁Lf的饱和过程也有催化作用，维生素C的存在有利于饱和Lf的形成，Tf也有类似的性质。 用XRD实验证实，Tf的铁结合2个酪氨酸，1个组氨酸，1个天冬氨酸和碳酸根，碳酸根上连接1个精氨酸和水分子，这种模式是否和Lf一样，尚需实验的进一步证实。 (三)Lf的热力学性质 对加热Lf的抗原性和其它生物活性进行分析的结果表明:缺铁乳铁蛋白pH>7时胶凝，pH<7时不沉淀，pH,4.0时90?,100?、5min的加热，对Lf的铁结合能力、抗菌性没有影响;在pH2.0,3.0， 8 100?,120?，加热5min后，Lf明显地降解，但其抑菌活性反而增强。 对多种乳清蛋白的热变性温度的研究表明，饱和Lf有两个变性峰(69.0?和83.5?)，不饱和Lf有一个变性峰(64.7?)。第一个峰是一铁离子Lf，第二个峰是二铁离子Lf;一铁Lf和二铁Lf的变性焓分别是2100kJ,mol和2900kJ,mol。 二、Lf的生物活性及其影响因素 (一)Lf的生物活性 乳铁蛋白具有结合并转运铁的能力，到达人体肠道的特殊接受细胞中后再释放出铁，这样就能增强铁的吸收利用率，降低有效铁的使用量，减少铁的负面影响。 —乳铁蛋白对铁的结合，避免了人体内OH?有害物质的生成。超氧离子O?和抗坏血酸盐或HO222,反应能产生高反应活性的OH?，这种OH?被认为是一种对人体有害的物质，O?和HO的反应称222之为Haber—Weiss反应，它在过渡元素(如Fe)的催化下进行反应。该反应的产物OH?能杀死几乎所有的微生物生物分子和诱导脂氧化。 乳铁蛋白还有多种生物活性，归纳起来有以下几个方面: ?刺激肠道中铁的吸收。 ?抑菌作用，抗病毒效应。 ?调节吞噬细胞功能。 ?调节发炎反应，抑制感染部位炎症。 ，，，223?抑制由于Fe引起的脂氧化，Fe或Fe的生物还原剂(如抗坏血酸盐)是脂氧化的诱导剂。 (二)Lf生物活性的影响因素 乳铁蛋白的生物活性受多种因素的制约，盐类、铁含量、pH、抗体或其他免疫物质、介质等均有影响。它的铁含量对其抑菌作用有决定性作用，碳酸盐的存在可明显增强其抑菌能力，而柠檬酸盐的增加却明显减弱其抑菌能力。另外，它的抑菌效果还与pH密切相关，在pH7.4时效果明显高于pH6.8，pH<6基本无抑菌作用。 ?铁饱和程度的影响:乳铁蛋白的铁含量对抑菌有决定性作用，如从乳房炎中分离的大肠杆菌、 3+葡萄球菌和链球菌类在一定的合成介质中均被缺铁乳铁蛋白抑制，这种抑制作用因加入Fe使其饱和而消失，说明了乳铁蛋白抑菌作用的铁依赖性，它的抗脂氧化有类似结果。 ?盐类作用:在上述实验中，碳酸盐的存在可明显增强乳铁蛋白的抑菌能力，柠檬酸盐的增加明显减弱了缺铁乳铁蛋白对三种菌的抑制。乳汁的实际抑菌作用和其分泌的乳铁蛋白与柠檬酸盐的比例 3+有关，其实质仍是二者竞争Fe使微生物可对铁利用，因而减弱了抑制能力。 ?pH的影响:乳铁蛋白的抑菌效果和pH密切相关，在pH7.4时效果明显高于 pH6.8，pH<6基本无抑菌作用。 ?抗体或其它免疫物质间的协同作用:研究表明乳铁蛋白和IgA抑菌有协同作用，Sarllson等人也得出相同结论。 125 ?介质的作用:金黄色葡萄球菌用I示踪蛋白实验表明:85,能和Lf稳定结合，其它部分很少或不能结合，其介质以血液、胨—琼脂较好，盐汁或富盐脱脂乳较差，最适pH为4.0,7.0。 ?形态:Lf的生物活性和其形态有关，如10,水解的Lf有最好的抑菌效果，HPLC法分析有8种Lf的降解肽存在。 ?动物的种类:Lf的活性和动物的种类相关，人、牛、羊等乳汁中Lf的含量和结构稍有不同，在许多体液、组织液(如唾液、鼻汁、胆汁、精液、泪等)均有Lf存在，它们在这些部分参与生物调解作用。 Lf对多种病原菌有抑制作用，服用含Lf的食品或制剂，对抑制肠道的病原菌，增加有益菌类和平衡肠道菌群，均有较好的作用。 三、Lf的分离方法 9 目前报道的Lf分离方法很多，主要有色谱法(吸附色谱法、离子交换色谱法、亲合色谱法、固定化单系抗体法等)和超滤法。 色谱法的优点是分离效果好、纯度高，抗体被固定化可重复使用，其缺点是柱的制备工艺复杂，抗体成本昂贵，难以工业化生产。超滤法操作简便，费用相对较低，易于形成工业化规模，其缺点是乳铁蛋白纯度较低，膜需经常清洗。超滤法是生产食品用乳铁蛋白最具实现工业化潜力的方法之一。 第三节 溶菌酶 溶菌酶(Lysozyme，Lz，EC(3.2.1.17))又称胞壁质酶(Muramidase)或N—乙酰胞壁质聚糖水解酶(N—Acetyl muramide glycanohydralase)，它于1922年由英国细菌学家Fleming在人的眼泪和唾液中发现并命名。它广泛存在于鸟、家禽的蛋清,哺乳动物的眼泪、唾液、血浆、尿、乳汁和组织(如肝肾)细胞中，其中以蛋清中含量最为丰富，而人的眼泪、唾液中的Lz活力远高于蛋清中Lz的活力。 一、Lz的基本性质 Lz是一种碱性球蛋白，广泛存在于鸟和家禽的蛋清中。其酶蛋白性质稳定，对热稳定性很高。母乳中的Lz活力比鸡蛋清Lz高3倍，比牛乳Lz高6倍。Lz是由129个氨基酸组成，相对分子质量14 200，等电点为 pH10.7,11.0，分子内有4个二硫键交联，对热极为稳定。Shahani等人牛乳的Lz相对分子质量为18 000，一级结构尚未确定。人乳Lz和α,乳白蛋白的一级结构有74,是相同的，α—乳白蛋白是人乳中含量较多的蛋白质，它对于乳腺中乳糖的合成是必不可少的，是乳糖合成酶的辅酶。溶菌酶和α—乳白蛋白在生物学上是同源的，但它们的三级结构有着很大的差异。Lz通过其肽键中第35位的谷氨酸和第52位的天门冬氨酸构成的活性部位，水解破坏组成微生物细胞壁的N—乙酰葡萄糖胺与N—乙酰胞壁质酸间的β,(1，4)糖苷键，使菌体细胞壁溶解而起到杀死球菌的作用。 Lz在人血清中含量平均为0.6~l.0mg,100mL，人初乳中达40mg,100mL，牛乳中的含量约为人乳的1,3000，目前在人、猪、猫、兔、马、驴、猴乳中均发现有Lz存在，羊、山羊的乳中仅有微量的Lz。 二、Lz的加工适应性 (一)热稳定性 Lz在酸性pH下是稳定的，此时100?的加热对Lz仅有很小的活力损失。在pH4.5(100?，3min)、pH5.29(100?，3min)下加热Lz是稳定的。一般认为Lz在酸性条件下稳定，在碱性条件不稳定。 Genentech和Genoneor两公司用遗传的方法生产出一种改性溶菌酶，此酶中有一种新的二硫键，这个键通过稳定酶的四级结构而增加了溶菌酶的热力学稳定性，使其在食品防腐方面更为有效。 糖和聚烯烃类能增加Lz的热稳定性，NaCl对 Lz也有抗热变性作用，而且盐溶液的存在对Lz的活力是十分必要的。在低盐浓度时，Lz的活化和离子强度密切相关，在高盐浓度时Lz的活力受到抑制，阳离子的价态愈高则其抑制作用愈强。具有,COOH和,SHOH基的多糖对Lz活力有抑制作用。 3 (二)加工过程中的化学反应 蛋白质和过氧化的脂类作用对食品的贮藏有着重要影响，自由基使不饱和脂肪酸过氧化产生HO，22导致产品的损坏，这类反应后的一个特征是产品的溶解性下降。溶菌酶和过氧化甲基亚油酸盐一起培养，导致蛋白质溶解度的下降和增加了溶解部分的分子质量。这是由于在Lz中产生了游离基，而导致其和过氧化的甲基亚油酸作用，研究表明Lz中游离基浓度随水分活度的上升而下降。 在150?,300?焙烤对溶菌酶和酪蛋白的作用，溶菌酶被作为一个纯蛋白质样品，在250?几乎所有溶菌酶的氨基酸被分解，色氨酸、含硫氨基酸、碱性氨基酸和β—OH氨基酸，较酸性氨基酸、脯 10 氨酸、芳香族氨基酸(除色氨酸外)、有烷侧链的氨基酸容易分解，这在氨基酸和还原糖间形成风味和有色物质的美拉德反应中是很重要的。 (三)络合作用 溶菌酶和许多物质形成络合物导致其失活。人们发现等量蛋清和蛋黄的混合物其溶菌酶无活力;脱水全蛋中仅保留部分溶菌酶活力;蛋黄污染的蛋清仅有两个离子交换色谱峰，而不是无污染的三个峰;对全蛋的色谱分离无溶菌酶。据此研究者认为抑制机理是在溶菌酶和蛋黄化合物间形成静电相互作用的络合物所致。 三、Lz在食品中的应用 由于Lz对多种微生物有抑制作用，因此可以用于食品保藏。目前已经用于香肠、鱼片、火腿、蔬菜和水果的防腐剂。在日本，Lz还用于豆腐的保存。Lf、Lz有防止肠道炎和变态反应的作用，因此可用于婴幼儿食品。而且Lz可以使肠道Bifidus bacillus增殖，对婴幼儿的肠道菌群有平衡作用。 人们对Lz添加于干酪等乳制品的影响进行了广泛研究。Lz加入乳中，可引起酪蛋白的水解。Lz的添加可以使用CaCl进行乳凝的时间缩短。Edam干酪易受到丁酸菌的污染，用 HO、硝酸盐或用222Lz对丁酸菌可以进行抑制。在加工Edam干酪时加入Lz不但对加工工艺无任何影响，而且还可以明显改善干酪的感官质量。意大利干酪、Edam干酪和Gouda干酪后期膨胀产气主要是Clostridum 5tyrobutyricum所致。用500单位,mL的Lz能杀死99,的Clostridum tyrobutyricum(5?10)，为此，Lz可替代硝酸盐防止干酪产气。特别是添加干酪中的Lz还可以回收使用，添加于酸乳清、乳、皱胃酶乳清和干酪中的Lz的回收率分别为97,,100,、75,,80,、88,,93,和87,,91,。 Lz还可以用于各种肉肠类食品起防腐作用。将Lz、NaCl和NaNO三者相结合的防腐效果比单独2 使用Lz或NaCl，NaNO的效果好。此外，溶菌酶还可用于保存海产品。 2 第四节 其它蛋白类生物活性物质 一、金属硫蛋白(Metallothionein，MT) 金属硫蛋白，是一种含有大量Cd和Zn、富含半胱氨酸的低相对分子质量的蛋白质。相对分子质量6000,10 000，每摩尔金属硫蛋白含有60,61个氨基酸，其中含,SH的氨基酸有18个，占总数的 30,。每3个,SH键可结合1个2价金属离子。 金属硫蛋白的生理功效，体现在: ?参与微量元素的贮存、运输和代谢。 ?清除自由基，拮抗电离辐射。 ?重金属的解毒作用。 ?参与激素和发育过程的调节，增强机体对各种应激的反应。 ?参与细胞DNA的复制和转录、蛋白质的合成与分解以及能量代谢的调节过程。 全世界接受治疗的癌症患者中，50,,70,曾接受过放射性与化学治疗。放射性与化疗在伤害癌细胞的同时，对正常细胞有严重的损伤，导致出现白细胞减少症，使患者生存质量恶化。应用特异活性成分防止放疗的副作用，保护正常人体细胞，已成为提高癌症放疗治愈率、改善患者生存质量的重要方面。金属硫蛋白就是这样一种有效的活性成分，它具有很强的抗辐射、保护细胞损伤及修复损伤细胞的功能。 某些行业的工作人员，长期与重金属(如Hg、Pb)接触，可引起中毒，出现四肢疼痛、口腔疾病、肾损伤、红细胞溶血等病症。锌—金属硫蛋白进入体内后，与Pb或Hg可结合成稳定的金属硫蛋白排出体外，而被置换出的Zn离子对人体无害，从而起到保健作用。 二、大豆球蛋白(Glycinin) 11 大豆球蛋白是存在于大豆籽粒中的储藏性蛋白的总称，约占大豆总量的30,。其主要成分是11S球蛋白(可溶性蛋白)和7S球蛋白(β-与γ-浓缩球蛋白)，其中，可溶性蛋白与β-浓缩球蛋白两者约占球蛋白总量的70,。 (一)蛋白质的营养价值 大豆球蛋白的氨基酸模式，除了婴儿以外，自2周岁的幼儿至成年人，都能满足其对必需氨基酸的需要。 将大豆球蛋白与牛肉相混合，不论大豆球蛋白与牛肉按什么比例混合，其蛋白质利用率都没有什么差别。也就是说，在保持氮平衡的情况下，即使将大豆球蛋白置换牛肉，其整体营养价值与牛肉没多大差别。 (二)降低胆固醇 大豆球蛋白对血浆胆固醇的影响，已确认的特点有: ?对血浆胆固醇含量高的人，大豆球蛋白有降低胆固醇的作用。 ?当摄取高胆固醇食物时，大豆球蛋白可以防止血液中胆固醇的升高。 ?对于血液中胆固醇含量正常的人来说，大豆球蛋白可降低血液中LDL,HDL胆固醇的比值。 作为蛋白质来源的大豆球蛋白，以140g,d剂量连续摄取1个月，可以改善并保持健康状况。若进一步过量摄取，则会抑制Fe的吸收。不过，摄取量在0.8g,kg左右，对Fe、Zn等微量元素的利用没有影响。 三、酶蛋白 (一)超氧化物歧化酶(SOD) 超氧化物歧化酶(EC 1.15.1.1)是生物体内防御氧化损伤的一种重要的酶，能催化底物超氧自由基发生歧化反应，维持细胞内超氧自由基处于无害的低水平状态。 SOD是金属酶，根据其金属辅基成分的不同，可将SOD分为三类:铜锌超氧化物歧化酶(Cu,Zn-SOD)、锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)和铁超氧化物歧化酶(Fe-SOD)。 SOD都属于酸性蛋白，结构和功能比较稳定，能耐受各种物理或化学因素的作用，对热、pH和蛋白水解酶的稳定性比较高。通常，在pH 5.3,9.5范围内，SOD催化反应速度不受影响。 作为一种功效成分，SOD的生理功效可概括为: ?清除机体代谢过程中产生过量的超氧阴离子自由基，延缓由于自由基侵害而出现的衰老现象，如延缓皮肤衰老和脂褐素沉淀的出现。 ?提高人体对由于自由基侵害而诱发疾病的抵抗力，包括肿瘤、炎症、肺气肿、白内障和自身免疫疾病等。 ?提高人体对自由基外界诱发因子的抵抗力，如烟雾、辐射、有毒化学品和有毒医药品等，增强机体对外界环境的适应力。 ?减轻肿瘤患者在进行化疗、放疗时的疼痛及严重的副作用，如骨髓损伤或白细胞减少等。 ?消除机体疲劳，增强对超负荷大运动量的适应力。 (二)谷胱甘肽过氧化物酶(GSH—Px) GSH-Px(EC 1.11.1.9)是生物体内第一种含硒酶，硒是GSH-Px的必需组成成分。GSH-Px可以清除组织中有机氢过氧化物等，对由活性氧和?OH诱发的脂氢过氧化物有很强的清除能力，延缓细胞衰老。也可清除DNA氢过氧化物，降低细胞突变的发生率。 思考题 1. 简述免疫球蛋白的种类、基本性质和生物学功能。 12 2. 请说明乳铁蛋白与转铁蛋白关系，并简述乳铁蛋白的生物活性。 3. 简述溶菌酶的生物活性及其在食品中的应用。 4. 请阅读有关文献，说说本章没有阐述的蛋白类生物活性物质的名称和所具有的生物活性。 参考文献 1 郭本恒编著. 功能性乳制品. 北京:中国轻工业出版社，2001 2 曹劲松编著. 初乳功能性食品. 北京:中国轻工业出版社，2000 3 郑建仙编著. 功能性食品学. 北京:中国轻工业出版社，2003 4 Carneiro De Melo etal. Trisodium phosphate increases sensitivity of gram-negative bacteria to lysozyme and nisin. Journal of Food Protection，61:839,844，1998 5 金宗濂主编. 保健食品的功能评价与开发. 北京:中国轻工业出版社，2001 13 14