20种中草药对水霉菌的抑菌作用研究[1]

20种中草药对水霉菌的抑菌作用研究[1] 水霉(Saprolegnia sp.)是水体中常见的病原性丝状真菌[1]，对寄主没有严格的选择性，能够感染水产养殖动物的卵、苗种以及各龄成体，且具有极大的传染性，容易造成大量水产养殖动物死亡，危害特别严重[2]。据报道[3-6]，水霉病流行广泛，草鱼、花鲈、大银鱼、斑点叉尾鮰、大鲵、黄鳝、月鳢、虹鳟、黑鱼、中华绒螯蟹等诸多水产养殖动物都曾爆发过水霉病。然而，水霉菌在养殖水体中广泛存在，对养殖水体环境有很强的适应能力，抗逆性强，能形成雄器和藏卵器进行有性生殖以抵御不良环境[7]抑制作用，因而一般药物难以将其杀灭，从而给水霉病的防治带来了极大的困难[8]。2002年以前，水霉病的防治主要使用孔雀石绿，但孔雀石绿存在着免疫抑制、致癌、致畸、致突变、高残留等毒副作用[9，10]，因而于2002年被我国农业部禁用[11]。此外，虽然氯化钠、福尔马林、过氧化氢、臭氧等也具有防治水霉的效果[12]，但氯化钠使用浓度太高，无法用于池塘泼洒;福尔马林对操作人员的危害较大且对环境会造成不利影响;过氧化氢使用成本较高;臭氧也需要相应的制备装置，使用和储运都不方便，很难推广。因此，我国水霉病的防治目前尚缺乏高效、安全、廉价的药物，很难填补孔雀石绿被禁用而出现的药物真空。 中草药提取于自然并保存了其生物活性物质，是一种理想的天然、环保绿色药物，其毒副作用小、残留低、能全面调节机体的生理功能，兼具营养与药物的双重作用，同时还具有来源广、成本低、药效长、使用方法简单等优点[13]，已经用于一些真菌性病害防治药物的开发[14]。本实验通过测定丁香、蛇床子、昆布、大茴香、紫苏、苦参、土槿皮、黄精、紫草、姜黄、冰片、黄柏、地肤子、茵陈、小茴香、五倍子、苦楝子、陈皮、白鲜皮、山苍子等20种常见中草药对水霉孢子和菌丝生长的抑制活性，最终筛选出了土槿皮和山苍子等2种对水霉孢子和菌丝生长具有良好抑制效果的中草药，从而为水霉病防治中草药制剂的开发提供新的途径。 1.材料与方法 1.1 实验材料 水霉菌株XJ(Saprolegnia sp. XJ)，分离于鲟鱼肌肉，为本实验室保藏菌株;丁香、蛇床子、昆布、大茴香、紫苏、苦参、土槿皮、黄精、紫草、姜黄、冰片、黄柏、地肤子、茵陈、小茴香、五倍子、苦楝子、陈皮、白鲜皮、山苍子等20种中草药，均购自上海联华复星药房南汇店;血细胞计数板，购于上海求精生化试剂仪器有限公司;全自动高压蒸汽灭菌锅抑制作用，购于日本三洋电器集团;马铃薯葡 萄糖琼脂培养基(PDA)，购于青岛海博生物技术有限公司;直径9cm玻璃平皿、PBS缓冲液和M199细胞培养液，均购于国药集团(上海)化学试剂集团 参考邱庆连等[15]的方法。即将中草药粉碎，经充分研磨后取5g，加水至75mL，4?浸泡12h后，煮沸后用文火煎煮30min，滤出煎液，再加相同体积的水煎煮。合并3次煎煮液，加热浓缩至50mL，用瓶装密封，4?保存待用。 1.3 水霉孢子悬液的制备 参考Prast等[16]的方法。即挑取保藏于试管的水霉菌丝转接于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)平板上，25?下培养72h。待菌丝长满整个培养皿后，用0.01moL/L的PBS缓冲液洗涤3次，经4层纱布过滤，加入pH值为7.4的M199细胞培养液，经血细胞计数板计数，分别调整孢子浓度为1104个/ml、1106个/ml、1108个/ml，4?保存待用。 1.4中草药提取液对水霉孢子的最小抑菌浓度测定 参考吴绍熙[17]的方法。即用无菌移液器吸取水霉孢子菌悬液100l于含0.625 mg/ml、1.25mg/ml、2.50mg/ml、5.00mg/ml、10.00 mg/ml中草药提取液的PDA平板上，25?下培养120h，每24h观察1次， 肉眼判定无菌落生长的PDA平板中的最低药物浓度即为中草药提取液对水霉孢子的最小抑菌浓度。每个浓度设3个平行，同时设添空白对照。 1.5中草药提取液对水霉菌丝的最小生长抑制浓度测定 参考夏修蛟等[18]的方法。即用无菌刀片将长满水霉的PDA平板切成约1cm2的小块，在盛有0.625 mg/ml、1.25mg/ml、2.50mg/ml、5.00mg/ml、10.00 mg/ml候选中草药提取液(根据1.4实验结果确定)的试管中分别浸泡0.5 h、1.0 h、2.0 h后再用无菌镊子取出置于PDA平板上抑制作用，25?下培养120h，每24h观察1次，肉眼判定无水霉菌落生长的最小中草药提取液的浓度为中草药抑制水霉菌丝生长的最小生长抑制浓度。每个浓度设3个平行，同时设添空白对照。 2.试验结果 2.1 中草药提取液对水霉孢子的最小抑菌浓度 中草药提取液对水霉孢子最小抑菌浓度的测定结果见1。实验结果表明，丁香、大茴香、苦参、土槿皮、黄精、黄柏、五倍子、陈皮、山苍子等9种中草药提取液对水霉孢子的最小抑菌浓度小于10 mg/ml，其中土槿皮和山苍子对水霉孢子的最小抑菌浓度最低，均 为1.25-2.50 mg/ml。然而，实验结果表明，中草药提取液对水霉孢子的最小抑菌浓度的大小并不受受试水霉孢子悬液浓度高低的影响，说明中草药的水提取液对水霉孢子的抑制作用仅由作用浓度决定，与受试水霉孢子悬液浓度无关。 表1 20种中草药提取液对水霉孢子的最小抑菌浓度 中草药名称 水霉孢子悬液浓度 1104个/ml 1106个/ml 1108个/ml 丁香 5.00-10.00 5.00-10.00 5.00-10.00 蛇床子 ,10.00 ,10.00 ,10.00 昆布 ,10.00 ,10.00 ,10.00 大茴香 2.50-5.00 2.50-5.00 2.50-5.00 紫苏 ,10 ,10.00 ,10.00 苦参 2.50-5.00 2.50-5.00 2.50-5.00 土槿皮 1.25-2.50 1.25-2.50 1.25-2.50 黄精 2.50-5.00 2.50-5.00 2.50-5.00 紫草 ,10.00 ,10.00 ,10.00 姜黄 ,10.00 ,10.00 ,10.00 冰片 ,10.00 ,10.00 ,10.00 黄柏 2.50-5.00 2.50-5.00 2.50-5.00 地肤子 ,10.00 ,10.00 ,10.00 茵陈 ,10.00 ,10.00 ,10.00 小茴香 ,10.00 ,10.00 ,10.00 五倍子 2.50-5.00 2.50-5.00 2.50-5.00 苦楝子 ,10.00 ,10.00 ,10.00 陈皮 5.00-10.00 5.00-10.00 5.00-10.00 白鲜皮 ,10.00 ,10.00 ,10.00 山苍子 1.25-2.50 1.25-2.50 1.25-2.50 2.2中草药提取液对水霉菌丝的最小生长抑制浓度 中草药提取液对水霉菌丝的最小生长抑制浓度的测定结果见表2。实验结果表明，在丁香、大茴香、苦参、土槿皮、黄精、黄柏、五倍子、陈皮、山苍子等9种对水霉孢子具有良好抑制效果的中草药提取液中，只有10.00 mg/ml土槿皮和山苍子等2种中草药提取液与水霉菌丝作用2h后对水霉菌丝生长起到了抑制作用，但与水霉菌丝作用0.5h和1h均未产生抑制作用，说明作用时间的延长可以在一定程度上提高中草药水提取液对水霉菌丝的杀灭效果。 表2 几种中草药提取液对水霉菌丝的最小杀菌浓度 中草药 作用时间 (h) 浓度(mg/ml) 0 0.625 1.25 2.50 5.00 10.00 大茴香 0.5 ， ， ， ， ， ， 1.0 ， ， ， ， ， ， 2.0 ， ， ， ， ， ， 土槿皮 0.5 ， ， ， ， ， ， 1.0 ， ， ， ， ， ， 2.0 ， ， ， ， ， - 丁香 0.5 ， ， ， ， ， ， 1.0 ， ， ， ， ， ， 2.0 ， ， ， ， ， ， 苦参 0.5 ， ， ， ， ， ， 1.0 ， ， ， ， ， ， 2.0 ， ， ， ， ， ， 陈皮 0.5 ， ， ， ， ， ， 1.0 ， ， ， ， ， ， 2.0 ， ， ， ， ， ， 黄精 0.5 ， ， ， ， ， ， 1.0 ， ， ， ， ， ， 2.0 ， ， ， ， ， ， 黄柏 0.5 ， ， ， ， ， ， 1.0 ， ， ， ， ， ， 2.0 ， ， ， ， ， ， 五倍子 0.5 ， ， ， ， ， ， 1.0 ， ， ， ， ， ， 2.0 ， ， ， ， ， ， 山苍子 0.5 ， ， ， ， ， ， 1.0 ， ， ， ， ， ， 2.0 ， ， ， ， ， - 注:， 表示水霉生长;表示水霉没有生长 3(讨论 水霉病是淡水养殖鱼类的常见病，自传统渔药孔雀石绿被禁用以来，目前尚未找到既安全又理想的替代药物进行防治，对于水霉病的治疗尚处于摸索与探索阶段，国内外许多科学家都投入到了水霉病方面的研究，也在防治水霉病的药物筛选上做过很多尝试和探索，虽然取得了一些成果，但对于水霉病的治疗，多年来国内外研究均无重大进展[2] 近年来，抗真菌中草药的研究成为抗真菌新药开发中的一个热点领域，许多学者进行了中草药对动植物真菌性病害防治方面的研究，但中草药防治水霉病的研究还比较少，且起效浓度很高，这可能是与中草药成分较为复杂，直接抑菌成分含量少，且抑菌活性成分 提取不完全等因素有关，这就需要进一步改进中草药加工和提纯的，使药效得到充分发挥。通过加强对土槿皮，山苍子等具有较好抑杀水霉能力的中草药提取物的化学结构组成和抑菌机理研究，人工合成相应的物质，将有可能为水霉病的治疗带来福音。 参考文献 [1]Roberts,R.J.，李耀祖，华鼎可译. 鱼病学教程[M]. 北京:农业出版社，1988. [2]周志明，朱俊杰.水霉病研究概况[J]. 现代渔业信息，2009，24(5):9-12. [3]张繁荣，张风银.高锰酸钾、福尔马林防治大银鱼卵水霉病试验,J,. 江汉大学学报，1999，16(6):22-25. [4]刘德建，陈奇，郑伟力.斑点叉尾鮰水霉病的防治技术,J,. 科学养鱼，2006(9):56-57. [5]朱玲.月鳢水霉病病因分析与防治,J,. 科学养鱼，2006(4): 53. [6]Carballo,M.,Munoz,M.J. Effect of sublethal concentrations of four chemicals onsusceptibility of juvenile rainbow trout(Oncorhynchus mykiss) tosaprolegniosis [J]. Appl. Environ.Microbiol. 1991(57): 1813-1816. [7]倪达.鱼类水霉病的防治研究.北京:农业出版社,1982,8. [8]袁万安，陈建，杨松权，等(抗真菌药物对鱼类鳃霉的防治效果 [J](内陆水产，2004(3):1214( [9]Prast H，Sopinska A(Evaluation of activity ofthe celluar protective process in carp with saprolegnia infection and treatmentwith malachite green and immunostimulant [J]. Medycyna Weterynaryjna,1989(45): 603605. [10]翟毓秀，郭莹莹，耿霞，等(孔雀石绿的代谢机理及生物毒性 研究进展(中国海洋大学学报，2007，37(1):2732. [11]谢文，丁慧瑛，奚君阳，等(水产品中孔雀石绿、结晶紫及其 代谢产物残留量的检测(色谱，2006，24(5):52953O. [12]FomerisaG，Bellardib S,Palmegiano GB，et a1(The use of ozone in trouthatchery to reduce saprolegniasis incidence[J](Aquaculture，2003，221(1):l57一l66. [13]李川,何登菊,牟洪民，等.大鲵水霉病中草药治疗试验[J].河北渔业，2010(1):33,57. [14]王宝庆,张晓丹.抗真菌药物的研究概况[J].黑龙江医药,2008(2):62-63. [15邱庆连，潘清清等.五倍子、乌梅等45种中草药提取物对锯缘青蟹致病弧菌的抑菌作用研究[J]. 浙江海洋学院学报(自然科学版),2010(1):34-38. [16]Ral T L(Adherence of candidaspecies to human epidermal corheytes and cataneous pathogeiuaith[J](Invest Dermatol，1984，83:37. [17]吴绍熙(现代医学真菌检验手册(第二版)[M](北京:中国协和医科大学出版社，2005:324327( [18]夏修蛟,郑俊惠,沈琳(十一种常用消毒剂灭真菌效果观察[J](九 江医学(2001(16(2):6869( [19]张书俊，杨先乐，李聃，等.水霉拮抗菌的筛选及其拮抗作用的 初步研究[J](水生生物学报.2008.32(2):301-307. [20]许鹏，卢红，马强.水霉病的治疗新技术[J](河北渔业.2010(7): 21. [21]李川,何登菊,牟洪民等.大鲵水霉病中草药治疗试验[J].河北渔 业，2010(1):33,57. [22]EbeleM.Ilondu, Francis O.Arimoro, Adjekawen P.Sodje. The use of aqueous extracts ofVernonia amygdalina in the control of saprolegniasis in Clarias gariepinus, afreshwater fish[J]. African Journal of Biotechnology, 2009, 8(24):7130-7132.