人乳头状瘤病毒(HPV)疫苗的

人乳头状瘤病毒(HPV)疫苗的 好风光好风光恢复供货才 人乳头状瘤病毒,HPV,疫苗的 最新研究进展 王小兵 张伟 中国协和医科大学 中国医学科学院 肿瘤研究所生物检测中心 摘要:人乳头状瘤病毒,HPV～human papillomavirus,感染是宫颈癌的主要病因。清除HPV感染和阻断由HPV感染所引发的宫颈癌前病变的进展尚缺乏理想的方法。目前～国际上已有20多种HPV相关疫苗已进入动物和临床试验阶段～主要分为预防性疫苗和治疗性疫苗～主要制剂形式是蛋白质、核酸。动物实验和临床试验结果显示HPV疫苗将在预防HPV感染及治疗由感染所引起的相关疾病方面将有重要作用。 关键词: 人乳头状病毒 疫苗 进展 中图分类号:R730.7 文献标识码 A 人乳头状病毒是一种无包膜的DNA病毒～目前已发现100多型别～主要感染生殖道粘膜和口腔、咽部上皮粘膜细胞等～是宫颈癌的主要病因～在我国妇女宫颈癌组织中HPV感染率大于95%～其中高危型HPV如16、18型占90%以上～世界范围内每年有40万新发宫颈癌病例～20万人死于该病[1]。HPV感染与宫颈上皮不典型增生及粘膜生殖道尖锐湿疣发病关系密切。因此～研制HPV疫苗来预防HPV感染和治疗HPV感染引起的相关疾病对于保护广大妇女身体健康具有重要价值。 一. HPV疫苗的分型 1( HPV疫苗可分为预防性和治疗性两种类型 1.1 HPV预防性疫苗:可阻断HPV感染皮肤和粘膜～一般由病毒衣壳蛋白L1或L1+L2组成～在细胞内可自我组装成空心病毒样颗粒,VLPs,[2]～它具有与完整病毒相同的抗原空间表位～可激发机体的CD4+淋巴细胞介导的体液免疫反应～刺激机体产生保护性中和抗体。预防型疫苗种类较少～主要以HPV病毒的结构蛋白质形式存在。 1.2 HPV治疗性疫苗:可清除由HPV感染所引起的肿瘤残存病灶、宫颈不典型增生,CIN,及生殖器尖锐湿疣～阻断低危型病变向高危型及癌症的转变过程。主要分为蛋白质疫苗和基因疫苗。HPV引发上皮细胞的转化并最终导致癌变主要由于HPV转化基因E6、E7造成～E6可诱发P53的降解～E7可抑制Rb的抑癌功能。实验证实在宫颈上皮细胞发生癌变的整个过程中必须有E6、E7基因的持续表达,故E6、E7已成为HPV治疗性疫苗研究焦点。另外～由于HPV基因组已整合 于基底层细胞染色体中～病毒复制需要E1、E2的表达～因此国际上有用E1、E2来设计治疗性疫苗的研究报道。 1.2.1 HPV治疗性蛋白疫苗:该疫苗的抗原部分一般采用E6或,和,E7～E7免疫原性优于E6～E6/E7融合后可提高免疫效果～在使用或不使用佐剂的情况下均可产生细胞免疫反应。由于E6、E7蛋白本身的免疫原性较弱以及具有潜在的致癌性～而且野生型的E6、E7不易被降解～不利于抗原的递呈～因此HPVE6、E7疫苗多经修改或融合其它蛋白以提高其免疫效果。蛋白质疫苗又分为多肽疫苗～融合蛋白疫苗～嵌合疫苗等。 多肽疫苗:E6、E7与人HLA型相配的多肽片段～使用佐剂诱导机体产生CTL反应来治疗HPV感染。如E7肽段疫苗。 嵌合蛋白疫苗:HPV晚期蛋白L1和L2的末端与早期蛋白相融合～以激发对早期蛋白的免疫。如L1-E7、L2E7 (TA-GW)、L2E7E6 (TA-CIN)等。 融合蛋白疫苗:由HPV早期蛋白相互融合或早期蛋白融合有其它蛋白～能更好的激发对机体免疫系统的免疫功能。如E6/E7、HSP/E7融合蛋白等。 1.2.2 HPV治疗性基因疫苗:基因疫苗可分为DNA和RNA两种。采用基因载体携带E6或E7基因进入抗原呈递细胞～并持续表达抗原蛋白分子～免疫系统识别抗原后被激活清除感染HPV的细胞。 基因疫苗可持续表达抗原～并易于构建和改造～易于制成多价疫苗～不需要 佐剂～热稳定性好～成本低廉等～但同时存在免疫效果弱和重组复活等安全性问题。 1.2.2.1 DNA疫苗:采用病毒载体或其他载体携带HPV早期基因～如重组 有E7的牛痘病毒疫苗、腺病毒疫苗、腺相关病毒疫苗～一些疫苗还混合有APC的表面受体的相应配体、化学激活剂等～还有学者将DNA疫苗中融合有可引导抗原至细胞内降解的序列、致细胞死亡的序列等。DNA疫苗的主要问题为HPV基因整合后具有潜在危险～而且不具有内在的扩增能力～以及不能在体内扩散而影响其效用的发挥。 1.2.2.2 RNA疫苗:具有RNA复制子可自我复制[3]。采用α病毒SINrep5作为复制子～融合有早期基因片段和其他基因片段～如单纯疱疹病毒外壳蛋白基因,VP22,、结核杆菌热休克蛋白基因,HSP70,和定位到内体、溶酶体的信号蛋白基因,LAMP-1,。RNA疫苗常采用肌肉注射～疫苗RNA可在肌肉细胞中大量复制导致细胞裂解～大量的RNA被APC获得～或在肌肉细胞中翻译成蛋白后分泌到细胞外被APC获得～通过MHC?途径激发抗HPV早期蛋白的细胞免疫。另外～RNA疫苗还能激活NK细胞～增强免疫激活功能。RNA疫苗不整合入基因组～并且不含有病毒结构基因～不能形成有活性的病毒～且被感染的细胞将发生调亡～故无致癌潜能～有利于人体的应用。其缺限为在注射部位有逐渐增强的坏死和炎症反应～并且活化的NK细胞和抗原特异性的T淋巴细胞可能会产生的自体免疫～最终损伤组织和器官。 二. HPV疫苗的临床试验结果 目前～已有二十多种疫苗处于动物实验和临床研究中。HPV疫苗的临床试验报道为数不多～此类研究主要集中在发达国家。 1.预防性疫苗 有报道英国使用昆虫表达体系表达重组的HPV16 L1 VLPs～分别在两种剂量下～使用或不用佐剂～多次肌肉注射～经人体试验证实可激发机体产生抗原特异性的IgG抗体～最常见的副作用是注射区的疼痛感～但大多数受试 者的疼痛温和而短暂～说明VLPs疫苗在安全性和有效性方面取得了进展。VLPs作为预防性疫苗在美国和拉丁美洲已开展临床?期实验～但是由于HPV感染到患病的周期较长～实验获得的数据有限～计划在亚洲进行相应的?期实验[4]。专家预测5年内该产品可上市～可能为VLPs四价疫苗。 另外～HPV6型预防型疫苗VLPs在一项针对尖锐湿疣的临床试验中证实能起到一定的治疗作用[5]。 此外～也有部分预防型疫苗采用DNA疫苗～如Merck公司的痘病毒载体融合L1基因片段[6]。 2.治疗性疫苗 治疗性疫苗较预防性疫苗种类要多～蛋白质型和基因型在临床试验中都获得了一定的治疗效果。 2.1肽段疫苗 肽段疫苗最主要的代表为E7肽段疫苗～采用HLA-A0201结合肽～主要是E7蛋白第11-20和86-93个氨基酸两段分子肽段～动物实验证明其能引发细胞毒性T淋巴细胞免疫反应,CTL,～在一项针对宫颈和外阴重度不典型增生的?期临床实验中[7]～18名受试者中有3名不典型增生消失～在可评价的16人中有10人检测到针对抗原的CTL发应～宫颈刮片有12人没有检测到HPV DNA。另外～在芬兰曾进行?、?期临床试验治疗一些用常规方法无效的晚期宫颈癌患者～结果在19名治疗对象中没有发现严重的副作用～其中一名患者病情 得以稳定～2名患者肿瘤得以抑制[8]。 临床试验证实多肽疫苗对癌前病变及宫颈癌有一定的治疗效果。多肽疫苗具有易于生产、价廉等优点～但多肽疫苗抗原性弱～一般采用结合佐剂的方法～但佐剂是临床副作用的一个重要原因～且目前被FDA批准的唯一佐剂是Al(OH)3～该佐剂能促进体液免疫～但对治疗起重要作用的细胞免疫无促进作用。多肽疫苗的另一个问题是需要符合特定的HLA型～给应用带来一定局限性。 2.2 嵌合蛋白 嵌合蛋白的研究是目前治疗型疫苗的另一重要方面～文献报道主要有L1-E7、L2E7 (TA-GW)、L2E7E6 (TA-CIN)三种。其中L1-E7疫苗有多家公司研制～有多种存在形式～如MediGene的L1-E7采用L1融合了E7 N端60个氨基酸的形式～动物实验表明能很好的激发针对L1的体液免疫和E7的细胞免疫～2000年进入?/?临床试验阶段～受试者为HPV16阳性的CIN患者～临床结果尚未公布,L2E7[9]为HPV6型L2羧基端缺失部分片段并结合完整E7片段～是Cantab公司产品～主要用于治疗尖锐湿疣～1996年已完成?a期临床～实验对象为由16名复发和11新发的尖锐湿疣病例组成～结果6名完全清除～另15患者继续接受治疗～有13名完全清除～并且都没有复发～临床实验后研究方向主要集中在佐剂的选择之中～但至今没有文献报导,L2E7E6[10]是由HPV16型早期蛋白和晚期蛋白组成～用于治疗宫颈癌～动物实验显示其能有效的抑制肿瘤的形成～且接种L2E7E6后结合TA-HPV疫苗能取得更好的效果。在一项针对40例健康个体的临床?期试验中显示其具有激发细胞免疫的功能～目前一项针对女性外阴高度不典型增生的临床?期试验正在验证此疫苗与DNA疫苗TA-HPV的联合免疫效果。嵌合蛋白既可刺激机体产生体液免疫～起到预防作用～也能激发细胞免疫～起治疗作用～但是对于感染者来说～血清中经常存在抗晚期蛋白的抗体～这些抗体对嵌合蛋白的治疗可能具有抑制作用。 2.3 融合蛋白 融合蛋白E6/E7的研究国内外进行较早～但治疗效果不理想并且表达水平较低～随着新的免疫佐剂或增强剂的出现～目前国内已有人研究E6/E7融合蛋白～且对其进行改造～消除早期蛋白的潜在致癌潜能～并实现高表达。动物实验结果理想～尚未进入临床阶段。 HSP65-E7[11]是HPV16 型E7蛋白与牛的分枝杆菌热休克蛋白65,HSP65,融合而成～利用热休克蛋白可将抗原导入树突状细胞的特性～从而激活抗早期蛋白E7的细胞免疫。该疫苗由加拿大STRESSGEN公司研制～现已进行了大量的临床实验～针对不同的适应症～临床实验进度不同～肛门不典型增生已完成临床?期～尖锐湿疣已完成临床?期试验～复发性呼吸道乳头状瘤病(RRP) 已完成临床?期试验～宫颈不典型增生已完成临床?期试验～宫颈癌已完成临床?期试验。临床结果表明该疫苗对由HPV引起的相关疾病确有明显的治疗作用～但具体数据不祥。此疫苗具有无HLA限制、CTL反应无需CD4+T细胞诱导的特点～这对已扩散或HIV感染等免疫抑制患者具有优势。这种疫苗有望成为治疗HPV感染的疫苗。 2.4 基因疫苗 DNA疫苗的临床研究较RNA疫苗成熟～大多进行到临床试验阶段。DNA疫苗多使用病毒作为载体～如牛痘病毒、腺病毒和腺相关病毒～他们在对免疫系统的刺激上比单纯的E7基因疫苗有明显的优势。腺病毒作为载体并混合抗CD40双特异性抗体～可增强DCs对抗原基因的获得～用这种疫苗在小鼠实验中能获得抗原特异性和CD8+T细胞依赖的免疫反应[12]。 一种重组牛痘病毒疫苗TA-HPV[13]～融合有HPV16、18 型E6和E7基因～在欧洲已开展了临床?期实验～临床实验结果表明TA-HPV是安全有效的～在患有宫颈癌的29名受试者中～接种一次就有4名患者产生了特异性的细胞毒性T淋巴细胞反应～8名患者有特异性的血清反应。 基因疫苗在诱导免疫效应上还不如人意。为进一步提高其免疫及保护效率～众多研究者们付出大量努力:改善免疫途径和方式,选择优化免疫刺激序列及载体,表达嵌合抗原或多重抗原,共表达抗原与细胞因子或协同刺激分子～如LAMP-1[14],HSP70[15]等。Chen[15]等]研究发现～利用结核分枝杆菌HSP70融合肿瘤抗原基因HPV E7构建基因疫苗～可显著增强抗原特异性的CTL反应和提高抗肿瘤效力。另外～在剂型方面的改变也有报道～如美国研发的一种基因疫苗药物ZYC101[16]～由可降解的生物大分子多聚体包裹质粒DNA形成～质粒DNA中表达抗原部分为编码HLA-A2限制性表位的E7片段～它主要用于治疗HPV16型引起的肛门的不典型增生～治疗对象的HLA是A2型～在进行的临床?期试验中～12名患者在所有剂量组的实验中均有很好的耐受～其中3名在接种后的12-24周后出现部分的病变部位组织学上的变化～有10名患者显示免疫能力有所提高。 另有报道使用E5作为抗原的DNA疫苗—rAd-E5[17]～在动物实验中～一次肌肉注射rAd-E5即可产生CD8+介导的细胞免疫反应～抑制肿瘤的发生。 RNA疫苗的临床研究目前还未见报道～但在理论上分析其可能具有较大的应用价值～并且动物实验也证实了其具有激发CD8+T介导的免疫反应能力和明显的抗肿瘤作用～是基因疫苗发展的一个重要方向。 展望 HPV疫苗的研究在近10年中取得了长足进展～许多疫苗已完成?/?期临床试验～准备进行更深入的研究。但距临床应用尚有距离～如临床副作用和对环境的安全性～HPV病毒的严格种属特异性,无法建立动物模型评价疫苗的免疫效果以及疫苗自身的安全性问题等～另外～如何选择最佳的疫苗策略,如载体的优化,临床应用疫苗条件的合理选择等～这些都应该是研发HPV疫苗和治疗时应考虑的内容。由于以上种种原因,现已开发的疫苗还没有一种是十分有效,安全性好～能被普遍接受的。因此～要研制出一种理想的HPV治疗疫苗并在人群大规模推广尚 需时日。开发对尖锐湿疣和不典型增生以及宫颈癌都有效的疫苗将有重要应用价 值和前途。 参考文献: 1( Pisani P,Parkin DM,Bray F ,et al.Estimates of the worldwide mortality from 25 cancers in 1990.Int J Cancer [J].1999,83:18-29 2( Kirnbauer R,Taub J,Greenstone H,et al.Efficient self-assembly of human papillomavirus type 16 L1 and L1-L2 into virus like particles.J Virol [J].1993,67:6929-36 3( Ying H, Zaks TZ, Wang RF, et al. 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