【doc】脂质体──斯锑黑克抗仓鼠内脏利什曼病的靶向治疗试验

【doc】脂质体──斯锑黑克抗仓鼠内脏利什曼病的靶向治疗试验 脂质体??斯锑黑克抗仓鼠内脏利什曼病 的靶向治疗试验 . , /拍 创刊号 1993年l2月 寄生虫与医学昆虫 ActaParasito1.Mea1.Entomo1.Sin 私7甲 FirstIssue Dee.,1993 脂质体——斯锑黑克抗仓鼠内脏 利什曼病的靶向治疗试验 鸿 新 振 链 (北京医科大学,北京100083) Rtgo5- 摘要用脂质体小囊包封斯锑黑克对感染杜氏利什曼原虫的白化突变黑线仓鼠作靶向治疗采用计分挂表示表示 药散.试验结果以指质俸包封斯锑黑克j2g/ml荆量适当,蓖控翩病程发展,无中毒死亡,存话串迭1oo%a透射 电镜现寨发现眉c虫的多泡俸明显胀大,内含多十电子致密团块,曦质结构,棱殛动基体等均无变化.对斯锑黑克的抗 利什曼病靶向泊疗的作用机制进行了讨论.为药物被蓑^蘼虫体内的溶尊吞譬系统,改变填的{参透性而造成自溶. 美鼍词内脏利什曼病脂质体新锑黑克靶向治疗 当前治疗利什曼病的首选药物仍是五价锑剂.其毒性与疗效相当,因此减低毒性和提 高疗效仍是必须解决的问题.用脂质体载药能导向淋巴巨噬细胞系统,可以集中所载药物 于靶区而达到降低浓度和提高疗效的目的(Shen,1987).我们于1989—1990年用脂质体 包封斯锑黑克对感染杜氏利什曼原虫的白化突变黑线仓鼠作治疗试验,获得比较理想的结 果.现报导如下: 斌与方法 材料 一 ,虫种:杜氏利什曼原虫(Le~shmanCadonovani),保存于野生黑线仓鼠(Cricetulus barabensisgriseus)体内. =,模型动物t实验室内人工繁殖的黑线仓鼠白化突变群(A:CHA).由中国人民 解放军军事医学科学院实验动物中心提供.年龄30d,体重15g左右. 三,斯锑黑克:原粉,由山东新华制药厂生产.脂质体包封由我校药学院物理化学教 研室完成(另文报导). 方法 一 ,抗利什至原虫的药教试验感染杜氏利什曼原虫6周的白化突变黑线仓鼠90 只,腹腔内注射各种制荆如表l. 丰立于1993年7.目2日收茔l '国家自然科学基叠费助课题. ? 22? 易有云等:脂质体——斯锑黑克抗仓鼠内脏剩什曼病的靶向治疗试验 每只鼠穰日注射O.5ml,连续6d.然后在同样条件下分笼饲养15周.解翻存活的7O 只仓鼠,每鼠作脾脏印片3张,吉氏染色后,油镜观察. 1.原虫密度:参照wHO公布的分缎标准(wHO,l984),由0-4按五级计分. 2.形态结构根据体积,空抱大小,外膜,按和动基体等态结构的变化情况,也由 0—4按五级计分. 每鼠的3张印片均记密度和形态分,二者相加为该鼠的台计分.各组台计分的均敦即 为该组所用制荆的药效计分,计分低者药效高. = ,脂质体包封斯锑黑克抗利什蔓原虫的电镜观察感染杜氏利什曼原虫6周以上 的白化突变黑线仓鼠8只,分为4组.驻腔内注射各种制荆:第一组注射脂质体包封斯锑 黑克l2g/ml,第二组注射脂质体包封膜溶剂——月桂酰甲酯(LAM)0.1.umol.第三 组注射脂质俸包封斯锑黑克120.ug/ml和0.1#mo1月桂酰甲酯,第四组为不处理对照. 每鼠每日注射0.5ml,连续6d.第6d注射后15min解剖4组全部仓鼠,各取脾脏作印片 3张.每鼠另取小块脾组织,用3%戊二醛及1%锇酸双固定,丙酮脱水后,用618包 埋,超薄切片,在JEM一100xII电镜下观察. 结果与讨论 一 ,存活率感染杜氏利什曼原虫的白化突变黑线仓鼠的存活时间可长达一年以 ? 23? 寄生虫与医学昆虫创刊号 上.我们的实验周期为2l周,因此存活率不能代表治愈率,只能表示药物的毒性和药 效.本实验中动物死亡多发生在治疗的同时或观察疗效的后期.前者由药物毒性所致,后 者由于药效差而发病死亡.表l中第四组仓鼠注射游离斯锑黑克24O00pg/ml,因毒性 太大,自注射第三针后陆续死亡,最后只存活1只,故不予统计.第一组仓鼠注射脂质体 包封斯锑黑克80#g/ml,不能控制所有仓鼠发病,药效较差,3O%死亡.第三组仓鼠注 射游离斯锑黑克12O00pg/ml,自注射至观察的整个过程的前期和后期共死亡4o%,说 明药效差且有毒性.第五组仓鼠注射空白脂质体,也有少数死亡,存活率为86.7%.唯 有第二组仓鼠,注射脂质体包封斯锑黑克120#g/ml,剂量适当能控制病程发展,无中毒 死亡,存活率达到100%.实验终结时,7个组共存活70只仓鼠,舍去第四组不予统计的 1只,6个组共69只仓鼠存活. =,药效各组仓鼠脾脏印片的原虫密度及形态结构的平均计分见表2.光镜下的 形态变化见图l.脾脏印片计分只有第二组脂质体包封斯锑黑克120#g/ml与第七组不予 处理对照相比差别有高度显着性(P<0.01),疗效理想.而剂量为100倍的第三组游离斯 锑黑克12O00#g/ml却无效(P>O.05).第一组脂质体包封斯锑黑克80pg/ml也无效 (P>0,05),原因是剂量不足,达不到控制原虫繁殖的目的.因此,用脂质体作载体包封 斯锑黑克治疗仓鼠利什曼病的最低安垒有效剂量为120#g/ml.其最高安垒剂量有待进一 步试验. 囊2鲁试验组莳效计分 Table2蛐嗍ofcs~dveeHect 脂质体包封斯锑黑克120#g/ml组脾脏印片光镜下的形态变化最明显的是虫体内 空 泡胀大,占整个虫体的2/3,原虫体积可增大一倍,核和动基体被挤到虫体两端.(图 1). ?24? 易有云等:脂质体一一斯锑黑克抗仓鼠内脏剥什曼病的靶向治疗试验 脂质体包封斯锑黑克120pg/n】J组原虫俸内窜抱胀大,虫俸增大一倍吉氏色.光镜 lO00X 脂质体包封斯锑黑克120/~g/ml组,原虫多抱体明显胀大,内古电子致密团块.透射 电镜36O00X 脂质体包封0Iu卸oILAM组,原虫的膜质结构受报.透射电镜36GOOX 脂质体包封斯锑黑克I2Opg/mJ及0IpmolLAM组,原虫解体.透射电镜36O00X Liposome— stibiihexonas120pg/mlgroupThevacuoleintheamastoreenlargedandtheprotozoa doubleditssizecomparedwiththecontrolGiemsaslain.10O0X Liposomcstibii[1cxonas120/mlgroupThemuitivcsicularbodyconspicuousHenlarged.Itc ontainssev- eralelectrondensemassesTEM36000X Liposome—LAM0l#tooJgroup.damageofthemerebran0usstructuresTEM3600OX Liposome— stibiibexonas120#/mlplus0lpmolLAMgroupAutolysisoftheprotozoa.TEM3600OX 三,透射电镜观察(凰2,3.4)脂质体包封斯锑黑克120~tg/ml治疗的仓鼠脾 脏内的杜氏利什曼原虫无鞭毛体显示细胞质减少,电子密度增加,多泡体 (multivesicular body或juxtanuclearvacuole)明显胀大,内含多个圆形或不规则形,大小不等的电子 致 密团块.原虫的表膜,核膜,动基体膜及线粒体膜等均未见损伤迹象,核与动基体等 无变 化(图2).此与Chulay等用15-20ragSb/kg葡萄糖酸锑钠治疗由杜氏利什曼原虫所致 的黑热病病人脾穿刺的透射电镜结果相似,他们也未发现膜损伤现象(Chulay,1985). 而与Langreth等用苯妥斯登(葡萄糖酸锑钠)对体外培养的热带利什曼原虫Ltropica ? 25? ?;4i4啦吨 寄生虫与医学昆虫创刊号 无鞭毛体的作用结果不同,他们发现有严重的膜损伤现象(Langreth,1983). 我们用脂质体包封膜溶剂——月桂酰精甲酯0.1pmol作为对照,电镜观察显示明显的 膜损伤变化:外膜溶解,虫体外形不规则,呈长形,核膜,动基体膜及线粒体膜均增厚, 界限模糊,多泡体也胀大,未见电子致密团块,核与动基体本身的结构无变化.(图3) 我们还将斯锑黑克120pg/ml及0.1#molLAM一起包封于脂质体小囊内,二者的联 合作用导致原虫解体.(图4). Chulay等认为葡萄糖酸锑钠对杜氏利什曼原虫的作用不是由外部消化,而是原虫自 溶.他们认为多泡体是利什曼原虫无鞭毛体的消化细胞器,某些导向细胞内溶酶体的药物 常集中于此,改变其膜的渗透性,使细胞质浓缩,电子密虚增高,溶酶番噬系统内的水解 酶外渗,导致原虫自溶.脂质体载药能增强对细胞内溶酶侉的靶向性.小剂量的药物可在 原虫体内集中于溶酶番噬系统,充分发挥药效,促进原虫自溶.因此,脂质体包封斯锑黑 克l2g/ml即能获得比较理想的疗效,而浓度比它大100倍的游离斯锑黑克却无效. 至于我们观察到的多泡体内的电子致密团块是否即为被载入的药物,因未作标记,尚 不能证实. 参考文献 Chulay.J.D,DWFaw~ttandC.N.Chunge1985Elcgtronma?粤copyof工dl埘咖donov~einsplcaic aspiratesfrompatieatswithvisceralIeishmania出dlIdn窑trCatRtc~twithsodiumstiboglucouat~AnnTrop. MeParaMtoL7W4):4I7—429 Langrcth.SG,F.DBerman..GP.RiordalletaL1983Fine—structuralalterationsii1Lei~hmaniatropicawithin humanmacrophagesexposedtoanfilcishmanialdrugsinvitro,_ProtozooL30(3):555—561. ShenTY198"/Prefercntialmembranepermeationandreceptorrecognitionindrugtargeting In:Rock~,EB Eds.,Bioreversiblecarriersin喀des~ntheoryandapplicationpp2I4—225 WHol984The1eishmanmsisAppendix4.ReportSer&sNo.701139. EXPERIMENToNTARGETINGTREATMENToF LIPoSoME—STBIIHEXoNASAGAINST?SCERAL oFHAMSTERS YiYouyanWagWealuHouX-皿p.IHUlI~N~mgxann MaiHengyanLiWenuBiZh~wIg (Be#ingMedicalUniversity船100083) Liposome—entrappedsfibiihexonaswasusedfortargetingtreatmentofalbinostriped—backhamslers infectedwithLeishmaniadonovani. Thedrugefficacywasexpressedbysc0—method.Only liposome—entrappedstibiihcxonas120~g/mlgrouphassuperiorefficacyandnotoxicityTEMobscrva. 1ionrevealedthemultivesicularbodyoftheamastigotcconspicuoustyenlarged.Itcontainedseveraldec. trolldens~mas~s.Allthemembranousstl~lctures.nucleus, andlduetc'plast—mitochondrioncomplexhave nochange.Thcmechanismofautileishmanialtargetingtreatmentofstibiihexouaswasdiscussed.Itis suggestedthatthedrugiscarriedintothephagolysosomalsystemoftheamastigolc.italteredthemem— branepermeabilityandleadingtoautolysisoftheamastigote. KeywordsvisceralleishmaniasislipOSOI'~estibiihexonas~rgefingtteatmL~at ? 26?