实验2 亲和层析法纯化胰蛋白酶

  猪胰蛋白酶的亲和层析制备及测定 内容提要 利用亲和层析（affinity of chromatography）技术纯化胰蛋白酶是一个综合性实验。首先从鸡卵清中分离胰蛋白酶的天然抑制剂——鸡卵粘蛋白，并以此为配基，偶联到琼脂糖凝胶（sepharose-4B）上，制成鸡卵粘蛋白的亲和吸附剂，然后通过亲和层析方法从猪胰脏的粗提液中纯化猪胰蛋白酶。 本实验要求掌握亲和层析的原理和方法；凝胶层析和离子交换层析技术；酶活性测定方法和抑制活性测定的原理和方法。 原理 亲和层析已经广泛应用于生物分子的分离和纯化，如结合蛋白、酶、抑制剂、抗原、抗体、激素、激素受体、糖蛋白、核酸及多醣类等；也可以用于分离细胞、细胞器、病毒等。近几十年来，亲和层析技术发展十分迅速。对于那些分离流程长、浓度低、杂质多、采用常规方法难以进行分离的生物分子来说，亲和层析技术就显示出其独特的优越性。亲和层析在分离、纯化的效率上可以说是最佳的方法。 亲和层析是由吸附层析发展起来的，主要是根据生物分子与特定的固相化配基（ligand）之间的亲和力而使生物分子得到分离的。所谓亲和力是指：范德华力、疏水力、静电力、氢键等，它存在于某些分子内部，也是维系着某些分子之间的结合力。酶与底物、酶与抑制剂、抗原与抗体、激素与激素受体等彼此分子之间的结合力就是亲和力。亲和力是很弱的，只有在彼此分子挨得很近的条件下才显示出来。所以要求两分子之间的结合具有高度特异的分子基础，即分子间的互补结构。利用这种具有亲和力的生物分子间可逆的结合和解离的原理发展起来的层析，就称为亲和层析。它相对于建立在物理化学原理（如分子颗粒大小、分子带电荷状况等）的分离方法而言，可称为“生物专一吸附”的层析分离方法。在亲和层析过程中，被分离的生物分子在一定的条件下，有选择性地，即高度特异地被结合到共价偶联的不溶性载体的配基亲和吸附剂上，改变原有条件，如选用竞争性抑制剂、底物、辅助因子或采用不同pH的缓冲液、高浓度盐、变性剂等，又可有选择性地从亲和吸附上把被分离物质洗脱下来。通过亲和层析，被分离物质的纯度有时一次即可提高几倍、十几倍甚至几百倍。活性回收率也是非常高的。 亲和层析需要选择耐用的、非特异性吸附少的、水不溶性的载体，并可在温和条件下与配基共价偶联，而又不影响配基原有的生物学特性。最常用的载体是琼脂糖凝胶（Sepharose-4B）。它具有机械强度高，透性好，非特异性吸附少等优点。此外，用作载体的材料还可以有纤维素、葡聚糖凝胶、多孔硅胶、树脂等。但是它们都具有不同程度的非特异性吸附。目前使用得并不多。 1967年Axen, Porath和Ernback报道了采用溴化氰活化琼脂糖凝胶，并把含有氨基的生物分子偶联到多糖基质上的方法。这从而把亲和层析技术向前推进了一步。 溴化氰活化载体是目前用得最多、效果最好的活化方法。但是，由于溴化氰容易分解，在贮藏和使用过程中产生少量有剧毒的氢氰酸及溴。因此，在操作时要戴防毒器具，并要求在通风橱内进行实验。 1967年Porath又报道了应用无毒性的环氧氯丙烷在碱性条件下活化载体的方法，解决了在无通风橱的普通实验室里进行载体活化的难题，使亲和层析技术得到更广泛的应用。除了这两种活化剂外，其他的活化剂还有戊二醛、1，4-丁二醚等。载体的活化及蛋白质配基偶联的反应如下： 2. 溴化氰活化载体与蛋白质配基偶联 3. 活化载体“接臂” 在亲和层析过程中，如果以一个小分子作为配基（如有机胺类），而被分离物质又是一个大分子，二者在结合过程中就会受到空间阻碍，影响结合。必须在载体和配基之间连接一段有机小分子，称之为“手臂”，使载体上的配基向外延伸以增强配基和被分离物质之间的接触面，减少空间阻碍，提高亲和层析的结合效率。合成这种亲和吸附剂要经过载体活化、连接“手臂”、“手臂”活化及配基偶联等步骤。 本实验采用的是猪胰蛋白酶的天然抑制剂——鸡卵粘蛋白作为配基的。鸡卵粘蛋白是一种特异性胰蛋白酶抑制剂，对猪和牛的胰蛋白酶有很强的抑制作用，但对糜蛋白酶无抑制作用。在pH7.6—8.0的范围内，猪或牛胰蛋白酶能牢固地吸附在鸡卵粘蛋白亲和吸附剂上，在pH2.5—3.0的条件下，又能从鸡卵粘蛋白亲和吸附剂上洗脱下来。因此，采用鸡卵粘蛋白为配基合成的亲和吸附剂，可从猪胰脏的粗提液中，通过亲和层析直接获得高纯度的猪胰蛋白酶，比活可以达到（1.5—2.0）×104BAEE单位/mg，相当于5次重结晶的胰蛋白酶的纯度，纯化效率可达到10—20倍以上。 一、主要仪器，材料和试剂 1.仪器 恒温水浴（规格25—100℃），紫外分光光度计，核酸蛋白质紫外检测仪，pH酸度计，组织捣碎机，离心机，循环水真空泵，层析柱（Ø15×400mm， Ø12×200mm），透析袋，尼龙网（200目），抽滤瓶，布氏漏斗（800mm），玻璃烧结漏斗（G—3）。 2.材料 鸡卵清，新鲜猪胰脏，琼脂糖凝胶（sepharose-4B），葡聚糖凝胶（sephadex G-25），DEAE-纤维素（DE—32）。 3.试剂 ● 各组配制试剂： 1) 0.02mol/L, pH6.5磷酸缓冲液，1000毫升。 2) 0.3mol/L NaCl —0.02mol/L  PH6.5磷酸缓冲液，200毫升。 3) 0.5mol/L NaOH — 0.5mol/L NaCl混合液，150毫升。 4) 0.5mol/L HCl，150毫升。 5) 1mol/L NaCl  100毫升、0.5mol/L NaCl  200毫升。  6) 2mol/L NaOH  20毫升。 7) 0.2mol/L PH9.5碳酸钠缓冲液，100毫升。 8) 56%1，4-二氧六环（V/V） 9) PH2.5-3.0乙酸酸化水：取200ml蒸馏水，用冰乙酸调至PH2.5-3.0。 10) 亲和柱平衡液200毫升： 0.5mol/L  KCl，0.05mol/L CaCl2，0.1mol/L, Tris—HCl PH7.8缓冲液。 11) 亲和柱洗脱液：0.5mol/L KCl—0.1mol/L PH2.5甲酸溶液，100毫升。                            （甲酸当量为23.3N） ● 公共试剂： 1) 10% PH 1.15三氯乙酸溶液：称10g三氯乙酸加入70ml蒸馏水溶解，用5mol/L NaOH调至pH1.15(在pH酸度计上调节)，然后加水至100ml，放置4h以后，再检查一次pH。 2) 1mol/L NaOH 、5mol/L NaOH 3) 1mol/L HCl 、5mol/L HCl 4) 5mol/L H2SO4 5) 0.2mol/L NaH2PO4 溶液 、0.2mol/L Na2HPO4 溶液 6) 胰蛋白酶溶液（mg/mol）：用0.001mo/L  HCl配制。 7) BAEE底物缓冲溶液：0.05mol/L CaCl2-0.05mol/L,PH8.0 Tris-缓冲液。 8) 1mmol/L BAEE底物溶液：34mg  BAEE，用BAEE底物缓冲液定容至100ml，临用前配制。 9) 环氧氯丙烷 二、操作步骤 1．鸡卵粘蛋白的制备 鸡卵粘蛋白是一种糖蛋白，存在于鸡卵清中。它在中性及偏酸性溶液中对热、高浓度脲、有机溶剂（如丙酮）等均有较高的耐受性；在碱性条件下有易变性；在50%丙酮或10%三氯乙酸溶液中仍有较好的溶解度。因此选择适当的pH值、丙酮或三氯乙酸的浓度，可从鸡蛋卵清中除去大量的非鸡卵粘蛋白，从而获得较高纯度的鸡卵粘蛋白。鸡卵粘蛋白的分子是由4个亚基组成的，它们的氨基酸组成和对胰蛋白酶抑制的生物学活性没有多大差异，但是在糖蛋白的糖基部分（主要是D-甘露糖，D-半乳糖，葡萄糖和唾液酸）的含量上有一定的差别，经聚丙烯酰胺凝胶电泳后呈现出4条电泳条带，其等电点在pH3.9—4.5之间，分子量为2.8 ×104。一分子鸡卵蛋白能抑制一分子的胰蛋白酶，1mg鸡卵粘蛋白能抑制大约0.86mg的胰蛋白酶。鸡卵粘蛋白的消光系数是4.13 (E1cm = 4.13)。 （1）鸡卵粘蛋白粗品的制备：取30ml鸡卵清，加入等体积的10%，pH1.15的三氯乙酸溶液，这时出现大量白色沉淀，搅拌均匀后在pH酸度计测定pH值，此时溶液的pH值应当是pH3.5，若pH值偏离pH3.5±0.2，则用5mol/L NaOH或5mol/L HCI回调到pH3.5±0.2的范围以内。由于提取液非常粘稠，在调pH值时要严防局部过酸或过碱。pH值调好后，在室温下静置4h以上，待清蛋白完全沉淀后，以3000r/min离心10min。弃去沉淀，上清液用滤纸过滤，除去上清液中的脂类物质及不溶物。收集滤液转移到一个500ml烧杯里。检查滤液的pH值是否是pH3.5，若不是，则要调回到pH3.5的范围内。放置冰浴中冷却片刻，缓缓加3倍体积的预冷丙酮，用玻璃棒搅匀，并用塑料薄膜盖好防止丙酮挥发，在4℃下放置4h以上。待鸡卵粘蛋白完全沉淀后，小心倾出一部分上清液，剩余的部分沉淀液全部转移到50ml的离心杯里，盖上盖或者用塑料膜封好，以3000r/min离心15min。弃去上清液，离心杯底部沉淀物放入真空干燥器内抽气，除去残留丙酮，然后用20ml蒸馏水溶解。若溶解后的溶液混浊，可用滤纸去不溶物。收集的滤液经Sephadex G-25凝胶层析柱脱盐或者对蒸馏水透析除盐。 Sephadex G-25凝胶层析柱脱盐操作如下： 称15g Sephadex G-25，用0.02mol/L，pH6.5磷酸缓冲液500ml热溶胀2h或者在室温下溶胀24h，脱气后装柱（Ø12×600mm）。柱床体积约为60ml，用大约2倍床体积的0.02mol/L，pH6.5磷酸缓冲液平衡。流出液在核酸蛋白质检测仪上绘出稳定的基线或经紫外分光光度计测定光吸收，待A280nm小于0.02时即可。取20ml鸡卵粘蛋白粗提取液上柱脱盐（上样量不得超过柱床体积的1/3）。用0.02 mol/L，pH6.5磷酸缓冲液洗脱，收集第Ⅰ洗脱峰，这就得到鸡卵粘蛋白脱盐的粗提取液。柱层析图谱见图2-1。 洗脱体积/ml 图2-1鸡卵粘蛋白在SephadexG-25凝胶柱层析上分离图谱 （2）鸡卵粘蛋白的纯化：将脱盐的鸡卵粘蛋白粗提取液经DEAE-纤维离子交换桩层析进一步分离纯化。 称10g DEAE—纤维素粉（DE-32），用100ml 0.5mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl溶液浸泡20min，然后转移到布氏漏斗（内垫200目的尼龙网）中抽滤，用蒸馏水洗至中性（大约PH8.0），抽干后转移至烧杯中，用100ml 0.5mol/L HCl浸泡20min，再转移到布氏漏斗内抽滤，用蒸馏水洗至中性（大约PH6.0），抽干后转移到烧杯中，用100ml 0.02mol/L，PH6.5磷酸缓冲液浸泡片刻，脱气后装柱（Ø12×200mm），用同样的缓冲液平衡。在核酸蛋白质检测仪上绘出稳定的基线或者经紫外分光光度计测定，A280nm小于0.02即可。 将已经脱盐的鸡卵粘蛋白粗提取液上柱吸附。以0.02mol/L，PH6.5磷酸缓冲液平衡，流出液在核酸蛋白质检测仪上绘出稳定的基线或者经紫外分光光度计上测定，A280nm小于0.02以后，改用含0.3mol/L NaCl的0.02mol/L，PH6.5磷酸缓冲液洗脱。收集第Ⅲ洗脱峰。收集的体积一般在35-45ml为宜。如果在前面的提取过程中，条件控制得适宜，提取的鸡卵粘蛋白是较纯的，有可能不出现卵清蛋白峰（峰II）。鸡卵粘蛋白在DEAE—纤维素离子交换柱层析上分离图见表2-2。                                             鸡卵粘蛋白                                                                     洗脱体积/ml                                                        鸡卵粘蛋白在DEAE-纤维素离子交换柱层析上的分离图                  （3）鸡卵粘蛋白纯品的制备：将经DEAE-纤维素离子交换柱层析分离的鸡卵粘蛋白溶液装入透析袋内对蒸馏水透析。间隔一段时间更换一次蒸馏水，直到用1% AgNO3检查无氯离子为止。 将透析液转移到桡杯内，取出2ml透析液测定鸡卵粘蛋白含量及其抑制活性，其余的透析液用1mol/L HCl调到PH4.0，然后加入3倍体积的预冷丙酮沉淀（此时应当出现大量的白色沉淀，否则就是溶液的PH值不准确），盖上塑料膜，在4℃下放置4小时以上。待鸡卵粘蛋白析出后，倾出部分上清液，剩余的沉淀液装入50ml离心杯里，于3000r/min离心15min。弃去上清液，沉淀物真空干燥，干燥后的鸡卵粘蛋白为透明胶状物。一般可得到0.2~0.5g/100ml鸡卵清。 2．亲和吸附剂的合成 （1）载体——Sepharose 4B的活化 ●环氧氯丙烷活化法：将适量的Sepharose 4B于玻璃烧结漏斗G-3中抽干，称8g（湿重）Sepharose 4B。用100ml 0.5~1.0mol/L NaCl溶液淋洗，用100ml蒸馏水淋洗、抽干，转移到100ml三角瓶内。然后加入6.5ml 2mol/L NaOH、1.5ml环氧氯丙烷、15ml 56% 1, 4—二氧六环。在40℃的恒温摇床中振摇活化2h。然后将活化的Sepharose 4B转移至玻璃烧结漏斗中，用蒸馏水洗去未反应的残留试剂，再用20ml 0.2mol/L, PH 9.5 Na2CO3缓冲液洗涤。抽干后立即偶联。 ●溴化氰活化法：称8g（湿重）Sepharose 4B，用0.5-1.0mol/L NaCl溶液洗，用蒸馏水洗，抽干后转移到100ml小烧杯内。以下的操作必须在通风橱里进行。加入0.2mol/L Na2CO3，将装有Sepharose 4B的小烧杯放置在一个冰浴里（可用大培养皿装一定的冰代替），用电动磁力搅拌器缓缓搅拌，反应器内的温度保持在5℃左右。戴上乳胶手套小心称2g溴化氰放入一个烧杯内，加入5.0ml乙腈使溴化氰完全溶解，取一只滴管向装有凝胶的烧杯内滴加溴化氰，另取一只滴管向反应烧杯内滴加6mol/L NaOH，使反应液的PH值保持在PH10.5，直到溴化氰加完后继续反应5min。停止反应，将凝胶速转移到玻璃烧结漏斗内抽滤（在收集滤液的抽滤瓶内预先加入一定量的固体硫酸亚铁以破坏未反应的溴化氰），用200ml预冷的蒸馏水淋洗，再用20ml 0.2mol/L, PH9.5 NaCO3缓冲液洗。抽干后立即偶联。溴化氰活化使用过的器具都要经硫酸亚铁溶液处理。 （2）配基——鸡卵粘蛋白的偶联：将活化好的Sepharose 4B装入100ml三角瓶内，用10ml 0.2mol/L，PH9.5 Na2CO3缓冲液将鸡卵粘蛋白溶解，取出0.1ml溶液稀释30倍，用紫外分光光度计测定鸡卵粘蛋白的含量。剩余的溶液全都转移到三角瓶内与活化的Sepharose 4B偶联。把三角瓶放入40℃恒温摇床振荡24h左右。如果是溴化氰活化的Sepharose 4B，则要在4℃振荡偶联24h左右。 准备好干净的玻璃烧结漏斗和抽滤瓶。偶联终止后，将Sepharose 4B转移到玻璃烧结漏斗中抽滤，收集滤液，量取体积。在紫外分光光度计上测定未被偶联的蛋白含量。用100ml 0.5mol/L NaCl溶液淋洗Sepharose 4B，用100ml蒸馏水洗，50ml亲和柱洗脱液淋洗，蒸馏水洗至中性（大约PH6.0）。然后转移到小烧杯内，用亲和柱平衡液（见试剂配制）浸泡约15min，脱气后装柱。 3．猪胰蛋白酶粗提取液的制备 （1）猪胰蛋白酶原的提取：称30g猪胰脏（已剥去脂肪和结缔组织），剪碎后装入组织捣碎机内，加入150~200ml（以浸过捣碎机的刀片为准）预冷的乙酸酸化水。将猪胰脏捣碎（30s /次，间隔30s，共3次）。然后把匀浆转移到500ml烧杯中，在5~10℃提取4h以上。4层纱布过滤。滤液用2.5mol/L H2SO4调至PH2.5~3.0，静置2-4h。在静置期间要检查一下PH值，使PH始终保持在2.5~3.0左右。然后离心或滤纸过滤，收集滤液待激活。 （2）胰蛋白酶原的激活：将胰蛋白酶原的粗提取液用5mol/L NaOH调节PH8.0，加入固体CaCl2使溶液Ca2+的终浓度到0.1mol/L，取2ml胰蛋白酶粗提取液测定激活前的蛋白含量及酶活性。然后加入大约2mg结晶胰蛋白酶，轻轻搅匀，在4℃冰箱中激活12~16小时左右或在室温下（20~25℃）激活2~4h。在酶激活期间经常检测酶的活性，待酶的比活达到800~1000 BAEE单位/mg时停止激活。用2.5mol/L H2SO4调至PH2.5~3.0，放置冰箱内备用。 4．亲和层析分离纯化胰蛋白酶 （1）装柱：取一支层析柱（Ø12×200mm），柱内先装入1/4体积的亲和柱平衡液，将脱气的亲和吸附剂轻轻搅匀，一次装入柱内，待其自然沉降，调好流速（2~4ml/10min）。用亲和柱平衡液平衡，流出液在核酸蛋白质检测仪上绘出稳定的基线或者经紫外分光光度计测定A280nm值小于0.02即可。 （2）上样：将胰蛋白酶粗提取液用5mol/L NaOH调至PH8.0，过滤，取滤液上柱亲和层析。上样体积可根据酶粗提取液的比活来确定，计算公式如下：                               W×0.86×1.3×104 胰蛋白酶上样体积（ml）= ———————————— × 1.5                                   C×A 式中，W：鸡卵粘蛋白偶联的总mg数；0.86：1mg鸡卵粘蛋白能抑制约0.86mg的胰蛋白酶，1.3×104：纯化后胰蛋白酶比活的近似值，c：胰蛋白酶粗提液的浓度（mg/ml），A：胰蛋白酶粗提液的比活（BAEE/mg），1.5：上样量过量50%。 上柱后用亲和柱平衡液平衡，待流出液在核酸蛋白检测仪上绘出稳定的基线或者经紫外分光光度计测定A280nm小于0.02以后，改用亲和柱洗脱液洗脱。收集第II洗脱峰，测定酶蛋白含量及其活性。亲和层析分离胰蛋白酶层析图谱见图2~3。 经亲和层析获得的胰蛋白酶可以用两种方法，进一步制成结晶或干粉。 盐析法：向胰蛋白酶溶液中加入0.8饱和度的（NH4）2SO4，静置数小时，待酶沉淀后，抽滤，沉淀用少量的水溶解，加入1/4体积0.8mol/L，pH8.0硼酸缓冲液，精确调至pH8.0，放置冰箱内结晶。数日后在显微镜下观察到棒状的胰蛋白酶结晶，抽滤后干燥。该法需要有较多的酶液才能做结晶，否则无法得到结晶品。 冷冻干燥法：将亲和层析获得的胰蛋白酶溶液装入透析袋内在低温下（4℃）对蒸馏水透析，然后经冷冻干燥成干粉即可。该法适合少量的胰酶的制备。 A280mm                                                                   洗脱体积/ml                图 2-3 酶蛋白酶在亲和层析柱上的分离图 使用过的亲和柱，经亲和柱平衡液平衡后可重复使用。也可将亲和吸附剂经蒸馏水洗净，加入0.01%NaN3于冰箱保存。 5．胰蛋白酶的活性测定及鸡卵粘蛋白的抑制活性测定 胰蛋白酶能催化水解蛋白质，它除了能水解碱性氨基酸的羧基与其他氨基酸所组成的肽键外，还能水解碱性氨基酸所组成的酯键。催化活性表现出高度的专一性。因此，可用人工合成的苯甲酰—L—精氨酸乙酯（bezoyl-L-arginone ethyl ester，简称BAEE）为底物测定胰蛋白酶的活性。测定原理及胰蛋白酶活性计算请参看有关籍。 测定胰蛋白酶活性时，酶的用量约5-10ug。具体加样量见表2-1。 表2-1  胰蛋白酶活性测定的加样顺序表               比色杯 0.05mol/L pH7.8 Tris-HCl /ml 1.5 1mmol /L BAEE底物/ml 1.5 混匀，在仪器上进行基线调零。 自制胰蛋白酶 /μl （或1mg /ml标准胰蛋白酶） 5             （60） 总体积 /ml 3.060（3.005） 加入胰酶后立即混匀立即开始扫描测定。 鸡卵粘蛋白的抑制活性测定的操作步骤见表2-2。 在测定鸡卵粘蛋白的抑制活性时，先在比色杯内加入1.5ml 0.05mol/L pH7.8 Tris-HCl， 0.1ml胰蛋白酶及0.05ml鸡卵粘蛋白，在室温下（最好在25℃）放置2min，使胰蛋白酶和鸡卵粘蛋白充分结合，然后加入1.5ml的BAEE底物，混匀后立即测定其活性。测定胰蛋白酶活性的光吸收递增值在△A253nm/min 0.1±0.02最适宜。测定鸡卵粘蛋白的抑制活性的光密度递增值在△A253nm/min 0.05±0.01最适宜，测定胰蛋白酶反应的时间为5~7min，测定鸡卵粘蛋白的抑制活性是胰蛋白酶的2~3倍时间或许更长。 表2-2  鸡卵粘蛋白的抑制活性测定的加样顺序表               比色杯号 0.05mol/L pH7.8 Tris-HCl /ml 1.5 1.5 1mg/ml标准胰蛋白酶 /μl — 60μl 0.1mg/ml鸡卵粘蛋白 /μl — 5μl 混匀后室温放置2分钟 1mmol/L BAEE底物 /ml 1.5 1.5 总体积 /ml 3.0 3.065 三、实验结果及数据处理 1．计算公式                                 A280nm×稀释倍数 鸡卵粘蛋白浓度（mg /ml）= ————————————                                   0.413                               A280nm×稀释倍数 胰蛋白酶浓度（mg /ml）= ————————————                                                       1.35                                   ΔA253nm / min 胰蛋白酶活性单位（BAEE）= ————————————                                       0.001                                     胰酶活性u×稀释倍数 胰蛋白酶比活性单位（BAEE/mg）= ——————————————————                                 胰酶浓度(mg/ml)×加入酶体积ml                                     A1——A2 鸡卵粘蛋白抑制活性单位（胰酶BAEE）= ———————                                         0.001 Ai ×N 鸡卵粘蛋白抑制比活性单位（胰酶BAEE/mg）= ———————                                             Ci×Vi 式中，A1：未加抑制剂的胰蛋白酶ΔA253nm/min，A2：加入抑制剂胰蛋白酶的ΔA253nm/min，Ai：抑制剂活性单位（胰酶BAEE），Ci：抑制剂的浓度（mg /ml），N：抑制剂的稀释倍数，Vi：加入抑制剂的体积。 2．结果 鸡卵粘蛋白产率（mg /ml）：100ml鸡卵清得到鸡卵粘蛋白的mg数。 偶联率（mg/ml）：100g Sepharose 4B偶联鸡卵蛋白的mg数，也可用1g sepharose 4B偶联鸡卵粘蛋白的mg数表示。 亲和吸附率（mg/g）：100g亲和吸附剂结合胰蛋白酶的mg数，也可用1g Sepharose 4B结合胰蛋白酶的mg数表示。 活性回收率：经亲和层析得到的胰蛋白酶总活性除以上样胰蛋白酶总活性。 纯化倍数：经亲和层析得到的胰蛋白酶比活性与上样前胰蛋白酶比活性之比。 绘制亲和层析分离胰蛋白酶的层析图。 绘制Sephadex G-25柱层析分离鸡卵粘蛋白的层析图。 绘制DEAE-纤维素离子交换柱层析分离鸡卵粘蛋白的层析图。 四、结果讨论和注意事项 1．关于鸡卵粘蛋白的制备 在鸡卵粘蛋白的制备过程中，最重要的环节是如何掌握好溶液的pH值，这是关系到实验成败的关键问题。鸡卵粘蛋白是一种性质较稳定的糖蛋白，它在10%，pH 3.5的三氯乙酸溶液中有很好的溶解度，只有小量的（约5%）沉淀，而鸡卵清蛋白则会出大量（约95%）的沉淀，因此，只要将提取液的pH值严格控制在pH3.5，可以将鸡卵粘蛋白和鸡卵清蛋白基本分开，而且鸡卵粘蛋白的产率也比较高。经10%三氯乙酸提取鸡卵粘蛋白的上清及DEAE-纤维素离子交换后的透析液都要用丙酮沉淀鸡卵粘蛋白，在加丙酮之前，一定要先将溶液的pH值精确调至所规定的范围，否则加入丙酮后不会出现沉淀或者只出现极少的沉淀，而且事后难以弥补。 2．关于载体的活化 用环氧氯丙烷活化Sepharose 4B是常用的一种活化方法。但是其活化效率决定于活化剂的用量、活化温度、活化时间及氢氧化钠的用量。这些因素之间的关系见下图： 3．关于胰蛋白酶的制备 胰蛋白酶在胰脏内是以酶原的形式存在的。它在碱性环境中，有Ca2+的条件下酶原可以自身激活。激活的胰蛋白酶在酸性环境（pH3.0-5.0）中稳定，当溶液大于pH 5.0时酶易自溶，小于pH2.0时易变性。胰蛋白酶是碱性蛋白，在酸性溶液中具有一定的缓冲作用。因此，胰蛋白酶的乙酸提取液及用硫酸酸化时溶液的pH值容易上升，往往要调几次才能使pH值稳定。酸化时要等到酸性蛋白完全析出后才能过滤，否则滤液将是混浊的。溶液的pH值和温度是影响胰蛋白酶原激活的重要因素，pH8.0是激活的最佳PH值，比PH7.0-7.6激活速度快5~10倍；25~30℃是激活的最适温度，比1~5℃激活速度快6~7倍。 4．关于亲和层析 在亲和层析分离纯化胰蛋白酶之前，将胰蛋白酶粗提取液调到pH8.0过滤后才能上样。若上样的胰蛋白酶是在酸性环境中，亲和吸附剂与胰蛋白酶不会发生结合。但是，也要注意胰蛋白酶粗提取液调至PH8.0以后，在室温下不宜放置时间太久，否则胰蛋白酶会自溶。 5．关于活性测定 用BAEE底物来测定胰蛋白酶活性及鸡卵粘蛋白的抑制活性时，应当严格控制好酶的用量。若酶量过大将无法测得酶的初速度；酶量过小反应时间很长，测得数据误差较大。每次测定前都必须把比色杯洗净，确保比色杯内不含残留胰蛋白酶，否则会影响测定结果。如果在30s测得的第一次数A253nm大于0.2，应当考虑到不是酶量过大就是比色杯未洗净所致。 思考题 1．在鸡卵粘蛋白的提取、分离及纯化过程中，直接影响产率的是哪几步？应当注意什么？ 2．环氧氯丙烷活化Sepharose 4B影响活化效率的因素主要有哪些？ 3．胰蛋白酶原激活主要控制哪些条件？胰蛋白酶在什么环境中最稳定？为什么？ 4．测定胰蛋白酶活性应注意什么？如何控制？ 答  案 1．用10%三氯乙酸沉淀卵清蛋白和其他杂蛋白及用丙酮沉淀鸡卵粘蛋白等是影响产率的主要步骤。关键要注意溶液的PH值。 2．影响Sepharose 4B活化效率的主要因素是：环氧氯丙烷的用量及氢氧化钠用量、活化温度及时间。 3．酶原激活时要控制最适的溶液PH、温度、Ca2+浓度及胰蛋白酶晶种。胰蛋白酶在PH3.0-5.0最稳定，小于PH2.0易变性，大于PH5.0易自溶。 4．测定胰蛋白酶活性应注意酶的用量、底物浓度、反应体系的PH值、温度等。根据ΔA253nm/min来控制酶用量。