全长A型肉毒毒素突变体构建及在产气荚膜梭菌系统中表达研究（可编辑）

全长A型肉毒毒素突变体构建及在产气荚膜梭菌系统中表达研究（可编辑） 全长A型肉毒毒素突变体构建及在产气荚膜梭菌系统中 表达研究 宁夏大学 硕士学位论文 全长A型肉毒毒素突变体构建及其在产气荚膜梭菌系统中表达的 研究 姓名宋孚洋 申请学位级别硕士 专业生物化学与分子生物学 指导教师王景林 2011-04 摘 要 肉毒神经毒素 botulinum neurotoxin BoNT 是一种大分子的毒性蛋白根据其抗原性的不 同可分划为 AG 7 种血清型每型 BoNT 均由一条单一多肽链组成分子量约为 150KDa 在结构上分为两部分轻链Lc50kDa为活性结构域具有锌依赖性金属内肽酶活性重 链Hc100kDa为结合和转位结构域由于 BoNT 的中毒剂量小潜伏期短致死率高已 成为最具威胁的生物恐怖剂之一所以发展 BoNT 疫苗对预防肉毒中毒以及应对生物恐怖 袭击具有重要的医学意义 首先为了 BoNTA Lc 突变体蛋白的活性我们克隆表达了 BoNTA Lc 的作用底 物 SNAP-25 蛋白将本室保存的 pET22b-SNAP25 质粒转入 Ecoli BL21DE3感受态细胞中 ?120rmin 水浴摇床振荡培养过夜采用终浓度为 1mM 的 IPTG诱导表达25 表达产物经过 SDS-PAGE 电泳结果表明目的蛋白在上清和包涵体中均有分布为了保证 SNAP-25 的生物学活性我们采用了上清中的蛋白来进行下一步的活性分析实验 其次利用实验室已构建的含有 BoNTA Lc 目的基因片段的质粒 pET-32a-ALc采用定点 突变技术对 BoNTA Lc 中 Arg362Tyr365 和 Glu350 三个关键性的氨基酸位点进行了突变 获得了 BoNTA Lc 的突变体采用低温诱导表达融合蛋白的方法成功获得了可溶性的 BoNTA Lc及其突变体蛋白通过该突变体与 BoNTA底物蛋白 SNAP-25 的切割反应发现未 经突变的 BoNTA Lc 蛋白能够特异性的识别 SNAP-25 上的 Q197-R198 位点而突变体蛋白则 完全无法识别该位点不具有金属内肽酶活性从而证明通过定点突变我们成功的去除了毒 素的毒力为下一步的全长 BoNTA重组疫苗的研究打下了基础 最后为有效表达全长 BoNTA 大分子抗原本实验选用了与肉毒梭菌同属的产气荚膜梭 菌Clostridium perfringens表达系统先以肉毒梭菌的 DNA为模板通过 PCR 的方法扩增全长 3901bp的 BoNTA基因并克隆至 T载体得到 pMD18T-BoNTA载体核苷酸序列 测定结果表 明与 GenBank 上所公布的 A型肉毒梭菌 62A 株登录号 M301961序列 100 一致性为 然后以 pMD18T-BoNTA 载体为模板按前述方法进行定点突变 Arg362AlaTyr365Phe Glu350Ala 经测序分析正确后经 BstBIBsu36I 双酶切将全长 BoNTA 突变 体基因连接到 pJRC200 载体中再通过电击转化的方法转入低毒产气荚膜梭菌 ATCC3624 细胞中进行厌氧 培养表达目的蛋白用 SDS-PAGE 和 Western blot 分析发现 BoNTA突变体 蛋白在产气荚膜 梭菌芽孢体中大量表达而在繁殖体中没有表达表达出的 BoNTA突变体蛋白 可以很好的被 抗 BoNTA马血清识别从而为下一步研制重组全长 BoNTA口服疫苗的奠定了 基础 关键词肉毒毒素突变体疫苗产气荚膜梭菌表达 I Abstract Botulinum neurotoxin which is the most toxic substance is produced by Clostridium botulinumIt consists of seven serotypes that have been assigned the letters A through G according to its antigenicity Each serotype BoNT is composed by a single polypeptide chain of molecules about 150 KDa which can be divided into two parts Light chain LC50 KDa is the catalytic domain as zinc dependent metalloprotease Heavy chainHC100 kDis the binding and translocation domainBecause of low minimal lethal dose short latency high mortality and can be used by terrorists it is of medical significance to perform an investigation into the recombinant vaccine against BoNT for preventing controlling of human botulism and defending aganise biological weaponsIn order to evaluate the activity of the mutant protein of BoNTA Light chain we cloned and expressed the SNAP-25 which is the substrate of BoNTAThe vector pET22b-SNAP25 was transferred into competent E coli BL21 DE3 cells IPTG was added to a nal concentration of 1 mM for inducing protein expression and the cultures were incubated at 25? with rotational shaking at 120 rpm for over night The SDS-PAGE results showed that the SNAP-25 was distributed throughout aggregate precipitate and supernatant We chose the supernatant to perform the activity analysisUsing the vector of pET-32a-ALc which was constructed by our lab as template we used the site directed mutagenesis to change these amino acidsArg362Ala Tyr365Phe Glu350Ala to obtain the BoNTA Lc mutant We achieved soluble expression of BoNTA Lc and BoNTA Lc mutant by low-temperature induction protein and expressing the fusion protein When the SNAP-25 was mixed with BoNTA Lc the reaction between enzyme and substrate showed that BoNTA Lc can cleave its substrate at Q197-R198 but the BoNTA Lc mutant has no enzymatic activity It verified that we removed toxicity of BoNTA and can be considered as the foundation to develop the recombinant holotoxoid vaccine against botulism We chose the Clostridium perfringers expression system which shows a high degree of homology with Clostridium botulinum to express the large molecular protein of BoNTA By using PCR we cloned the full BoNTA gene fragment from genomic DNA of Clostridium botulinum The DNA sequencing indicated that the cloned DNA fragment shares the same sequencees reported by GenBank No M301961 Site directed mutagenesis were used to change these amino acids Arg362AlaTyr365PheGlu350Alaby using the pMD18T-BoNTA vector as the template then we obtained the mutatnt of the BoNTA Digested by BstBIBsu36I and ligated into the pJRC200 vector the resulting recommbinant pJRC200 vector was transfected into a noncytotoxic Clostridium perfringens ATCC3624 cells by electric transfection methods The results of SDS-PAGE and Western blotting showed that the mutant protein of BoNTA was expressed during sporulation but not expressed in vegetative cells The mutatnt protein of BoNTA showed a high antigenicity Our experimental results will lay a foundation for developing novel oral recombinant holotoxoid vaccine against BoNT based on the Clostridium perfringens expression systemIIKey Words Botulinum neurotoxin mutant vaccine Clostridium perfringens expression III 中英文缩略词表英文缩写 英文全称 中文名称 BoNT Botulinum neurotoxin 肉毒神经毒素 Lc light chain 轻链 Hc heave chain 重链 SNAP-25 synaptosomal-associated protein 突触小体相关蛋白 CM Chloramphenicol 氯霉素 Amp ampicilin 氨苄青霉素 bp base pair 碱基对 BSA bovine serum albumin 牛血清白蛋白 dNTP deoxyribonucleoside triphosphate 脱氧核糖核苷三磷酸 EDTA ethylene diaminetetracetic acid乙二胺四乙酸 IPTG isopropylthio- β-D- galactoside 异丙基硫代- β-D-半乳糖苷 Kb kilobase pairs 千碱基对 rpm revolutions per minute 转分 μL microliter 微升 OD Optical density 光密度 ORF open reading frame 开放阅读框 PAGE polyacrylamide gel electrophoresis 聚丙烯酰胺凝胶电泳 PCR polymerase chain reaction 聚合酶链式反应 SDS sodium dodecyl sulfate 十二烷基磺酸钠 IV 独 创 性 声 明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果尽我所 知除了文中特别加以标注和致谢的地方外论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果 也不包含为获得宁夏大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料与我一同工作的同志对 本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意 研究生签名时间年月日关于论文使用授权的说明 本人完全了解宁夏大学有关保留使用学位论文的规定即学校有权保留送交论文的复印 件和磁盘允许论文被查阅和借阅可以采用影印缩印或扫描等复制手段保存汇编学位论文 同意宁夏大学可以用不同方式在不同媒体上发表传播学位论文的全部或部分内容 保密的学位论文在解密后应遵守此研究生签名时间 年月日 导 师签名时间 年月日 宁夏大学硕士学位论文第一章文献综述 第一章 文献综述 11 概述 肉毒毒素 Botulinum neurotoxin BoNT 是由肉毒梭菌 Clostridium botulinum 产生的一 种毒性极强的神经性毒素可以引起以迟缓性肌麻痹为特征的中毒症状具有极高的病死率 根据其抗原性的不同将 BoNT 划分为 AG 7 种血清型能导致人类中毒的这类毒素主要有 [1] 肉毒毒素 A型B 型E 型和 F型四种CD型毒素主要引起畜禽和野鸟中毒 肉毒梭菌为可形成芽孢的 G 杆菌广泛分布于土壤海洋沉积物及家畜的粪便中也可以 [2] 附着于水果蔬菜和谷物上可呈活动生长状态营养细胞或休眠状态芽孢 芽孢对热 化学药物放射线的抵抗力极强在沸水中可以存活 1022h20的甲醛需要经 24h 才能将其 杀死而营养细胞则极易被破坏在有氧状态下不能生长属于严格厌氧性菌如果有一种食 品受到污染而且其条件又适于该菌的生长则将产生大量营养细胞并产生 BoNT如果食 用此种含有毒素的食品后BoNT 可经由小肠吸收从而进入循环系统而引起 毒性作用所以 肉毒中毒是一种毒素型食品中毒而不是感染型食品中毒不具有传染性但对人和动物均有 高度致病力不分年龄和性别 分子结构与作用机制 12 121 肉毒毒素的结构 每型 BoNT均由一条单一多肽链组成分子量约为 150KDa经细菌本身内源蛋白酶和外源 蛋白酶水解形成缺口彼此靠二硫键连接为双链形式图 1包含一轻链Light chainLc 50KDa和一重链Heavy chainHc100KDa图 1 肉毒毒素的结构 Lc 链是肉毒毒素的毒性成分具有锌离子依赖的肽链内切酶活性可以识别 SNAP-25 Synaptosomal-associated protein of 25 KDa上的 Q197-R198 位点从而对其进行特异性的切 - 1 -宁夏大学硕士学位论文第一章文献综述 割从而抑制神经传导的释放最终引起中毒反应Hc 的主要作用是与神经细胞膜上相应受体 结合在内体膜上形成离子通道并辅助 Lc 转位也称为非毒性部分包含两个结构域转位 结构域H 和结合结构域H 分别负责与细胞膜受体结合并将 Lc 链转运到细胞内是 N C [3] 保护性结合和进入神经细胞所必需的H 又可分为 H 和 H 两部分 单独的 轻链和重链均 C C1 C2 不具有毒性只有双链才显示生物活性 122作用机制 对神经肌肉接头的作用机制主要包括以下几个步骤图 2 BoNT [4] 图 2 肉毒毒素作用机制示意图第一靶细胞的识别与结合 BoNT 通过其 Hc 结构域与胆碱能神经元的突触前膜相结合靶细胞的识别与结合则需要神 [4] 经节苷脂的存在特别是 GD1bGT1b 和 GQ1b 通过神经节苷脂分布及对毒素亲和结合能 力的研究表明神经节苷脂不是促进毒素结合的惟一分子 细胞表面的蛋白质也参与了这个过 [5] 程 于是Montecucco等提出了毒素结合的双受体 模型肉毒毒素与靶细胞的特异性牢 固结合同时需要毒素与神经节苷脂毒素与蛋白质受体间的相互作用通过对 ABE 三型毒 [6 7] 素的研究发现 靶细胞表面的突触结合蛋白参与了毒素的识别结合过程并且在神经节苷 脂存在的条件下对毒素的亲和力明显增强 第二内化 因为肉毒毒素是在神经元细胞的胞质中发挥作用所以毒素分子就必须先进入细胞质中 毒素结合于细胞表面后通过细胞的内吞形成一个包裹毒素分子的酸性小泡相关研究表明 当毒素结合于神经细胞表面后这种受体介导的内化过程是温度和能量依赖性的神经刺激可 [8 9] 以加快这一过程 - 2 -宁夏大学硕士学位论文第一章文献综述 第三跨膜转运 肉毒毒素形成的酸性小泡会滞留在运动神经元的突触前膜末端小泡内的酸性环境使 BoNT 分子构象发生变化此时中性环境下埋藏在内部的疏水片段暴露于分子构象表面使得 [10] 毒素的重链和轻链能够嵌入小泡的脂双分子层内 毒素嵌入质膜后形成离子通道这种离子 [11] 通道是阳离子选择性的相对分子质量小于 700KDa 的分子可以通过这个通道 该通道的形 成主要是与 BoNT 的 H 结构域相关 N 第四阻止神经递质的释放 突触前膜通过胞吐的形式释放神经递质有一组 SNARE Soluble NSF-attachment protein receptor蛋白主要包括位于转运小泡膜上的 VAMPVesicle-associated membrane protein [12] 25 和 Syntaxin以及一些胞质蛋白 共同形成复位于突触前膜上的 SNAP- 合物介导了转运小 泡与突触前膜的锚定融合是递质释放的必需蛋白BoNT 通过特异性切割 SNARE 蛋白 来阻止转运小泡中的递质释放从而引起肌肉麻痹造成肉毒中毒各种血清型 BoNT 的底物 [13] 及肽键切割位点各不相同 AE 型主要作用于 SNAP-25BDFG 型主要作用于 VAMPC 型毒素有 2 个底物分别是 Syntaxin 和 SNAP-25 13 肉毒毒素的危害 BoNT 是迄今为止自然界所发现的生物毒素包括化学毒剂中毒性最强的毒性物质肉毒 中毒的潜伏期很短一般 2-3d 内即可导致中毒者死亡据推测 1g 结晶的 BoNT 足以杀死近 100 万人和 2000 亿只小鼠根据 BoNT 对灵长类动物的试验结果推断该毒素对成年人的致死剂 量因途径而异静脉和肌肉注射时为 009015 g气溶胶吸入时 070090 g口服约为 70 [1415] g 肉毒中毒的形式主要有三种1食源性肉毒中毒Food-borne botulism2婴儿肉 毒中毒Infant botulism3伤口肉毒中毒Wound botulism 1食原性肉毒中毒关于食源性肉毒中毒的最早报道是 Kerner 医生报道的德国发生 因食用腊肠引起 234 人中毒110 人死亡的事件由于是食用腊肠引起故当时称为腊肠中 [16] 毒 1870 年另一个德国人 Muller对腊肠中毒又进行了深入的研究并改称为Botulus 拉丁文意思是腊肠到 1895 年比利时人 Van Ermengem首次从中毒食品火腿和死者脾脏 分离出肉毒梭状芽孢杆菌并证实该菌能在厌氧环境下生长并产生外毒素至此对肉毒中 毒的原因才有了较明确的认识国外引起肉毒中毒的食物主要是一些罐头腊肠等肉制品而 我国则以各种发酵腌制的食品为主迄今我国已有 19 个省区报道过肉毒食物中毒绝 大多数发生在新疆青海等西部地区据新疆自治区统计80以上的中毒患者是食用发酵豆 制品如臭豆腐豆瓣酱等引起的由发酵面制品如甜面酱等引起的占 10左右主要是这类食 品的制作过程需要严格的厌氧环境而卫生消毒等条件达不到要求一旦被肉毒梭菌污染 就很容易发生及其严重的后果 2婴儿肉毒中毒婴儿肉毒中毒是在 1976 年由美国首先报道的主要是因为婴儿肠 道的特殊环境及缺乏保护性菌群和抑制肉毒梭菌的胆酸一旦食入肉毒梭菌芽孢或被芽孢污染 3 -宁夏大学硕士学位论文第一章文献综述 - 的蜂蜜等食品芽孢就会在肠道发芽繁殖产生的毒素被吸收而致病近几年婴儿肉毒中 [17] 毒的发病率已超过肉毒食物中毒但 80以上发生在美国每年 250 例左右死亡率 2 3伤口肉毒中毒伤口肉毒中毒最早发现于 1943 年类似于破伤风主要是土壤中的肉 [18] 毒梭菌孢子通过伤口感染进入人体后繁殖成肉毒梭菌并产生 BoNT 引起的 由于 BoNT 的中毒剂量小潜伏期短致死率高而又易于制备获得且运输相对方便所 以与天花病毒炭疽杆菌等一同被国际社会列为最具威胁的生物恐怖剂例如在 1984 年恐 怖组织用 BoNT 污染罐装橘汁导致美军两艘潜水艇和潜水艇基地的 63 人肉毒中毒和 50 人死亡 的事件19901995 年日本邪教组织奥姆真理教曾 3 次在东京市区和美军驻日军事基地施放 [19] BoNT但限于不成熟的气溶胶制备技术未获成功 因此发展疫苗预防肉毒中毒以及 应对生物恐怖袭击具有重要的医学意义 14 肉毒毒素疫苗的研究 肉毒中毒的防治主要由三种手段1主动防护通过注射 BoNT 疫苗的方法让机体自 动产生相应的抗体从而对之后的感染有高度的抵抗能力免疫效果虽然要经历一个潜伏期 但是长久保持且通过注射所需抗原很容易再活化2被动防护通过对患者注射抗体 的方法让人体抵御 BoNT 的中毒反应这种方法虽然效应快无潜伏期但是维持时间很短 制备抗体需要用到天然的 BoNT具有很大的危险性而且由于 BoNT 毒性强潜伏期短一 旦未能及时救治极易导致患者的死亡3物理防护采用防毒面具生化防护服等设备防 止肉毒毒素肉毒梭菌对人体的感染但是这些设备不易获得和广泛使用由于 BoNT 疫苗具 有防治效果好制备过程安全且易于普及所以关于肉毒毒素疫苗的研究和应用也一直是各国 学者研究的一个重要方向疫苗种类也很多 141类毒素疫苗 类毒素疫苗是最早研究的一类疫苗这种经福尔马林液脱毒肉毒毒素而产生的疫苗可以 有效地防止肉毒中毒现在主要有针对 AE 型肉毒中毒的五价疫苗和针对 F 型的单价类毒素 疫苗两种迄今为止美国 CDC 的监控下已有 11000 人接种过由 Emergent 生产的五价类 毒素疫苗F 型单价疫苗也已通过?期临床试验 尽管类毒素疫苗保护性非常好但仍然存在许多的问题首先肉毒梭菌以孢子的形式存 在所以制备肉毒毒素需要专门的设备但是这些设备的造价非常高其次肉毒毒素的制备 纯化以及失活的各个环节对生产人员均会产生直接的危险必须采取适当的安全措施来进行防 范第三肉毒梭菌产毒的得率很低特别是一些血清型的菌落在人工培养基上不能产生大量 的毒素以供使用第四在类毒素制备过程中残存的福尔马林和防腐剂也大大增加了过敏反应 的发生机率因此肉毒毒素的类毒素疫苗的推广受到了很多限制仅用于高危人群如从事 肉毒毒素制备和加工的工作人员等等 142多肽疫苗 - 4 -宁夏大学硕士学位论文第一章文献综述 这类疫苗主要是基于鉴定肉毒毒素保护性表位的方法而来的因为这些抗原表位本身就来自 于肉毒毒素所以也就能被相应的抗体血清所识别即具有一定的抗原性如果采用不同表位多 串联的方法具有许多的优点比如所表达的片段较小可以表达多种毒素的串联体形成多价苗 抗原表位碱基数少易于PCR扩增及改造等等SBavari等人曾合成了两个25mer的BoNTA肽 Pep11157-1181 GTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVY 和 Pep21230-1253 GITNKCKMNLQ DNNGNDIGFIGFHQ并分别用pep1和pep2及两者的混合物接种小鼠并以BoNTA Hc做对照 结果显示pep2的免疫效果优于pep1pep1和pep2的混合物又优于pep2但与BoNTA Hc相比要差很 多 143 核酸疫苗 核酸免疫的主要载体是质粒质粒可以通过培养大肠杆菌大量获得而且不会在哺乳动物细 胞中复制Jennifer曾以pCMVint-BL为表达载体将编码BoNTAHc的DNA分别插入载体的两个 位点构建得到了PJT-1PJT-2两种核酸疫苗经过动物实验表明仅PJT-2有保护作用但是免疫 [20] 效果并不理想 [21] Bennett等 开发了一种针对BoNT F的DNA疫苗将编码BoNTF Hc的DNA 连入载体构建 得到重组质粒pABFHc1和pABFHc2在这两种重组质粒中编码FHc的基因系列都置于CMV major IE启动子之下所不同的是质粒pABFHc2编码的是一个融合蛋白在FHc的氨基末端加入了一个鼠 Ig κ的信号肽V-J2-C而pABFHc1编码的是非融合性蛋白通过在大肠杆菌中传代获得更多的克隆 4 将pABFHc1和pABFHc2以及纯化的FHc蛋白免疫小鼠结果pABFHc2在免疫3次后对10 M LD 50 剂量的BoNTF攻毒的小鼠达到了100的保护率而pABFHc1效果稍差可能与其不易分泌至胞外 有关 144 重组亚单位疫苗 重组亚单位疫苗与传统的疫苗相比具有很多明显的优点安全性高生产容易而且成本 [22] 低廉并可以排除病原中长期副作用的不相干成分早在1995年Hugh等 就发现PCR扩增的 [23] Hc基因在大肠杆菌中的表达产物对小鼠具有免疫原性可作为一种良好的免疫原Torii等 合成 了一种针对ABEF 型毒素的四价疫苗该实验通过肌肉注射来免疫五组志愿者并收集他 们2周后9个月后和12个月后的血清进行分析发现血清中的抗体随着时间的延长中和效价降 低很快例如抗A型肉毒毒素的中和效价在第二周平均为35IUml在9个月后降为026IUml在 12个月后则为019IUml不能起到一个长期的保护作用 2004年 由Covalent组织和资助支持美国USAMRIID与DynPort疫苗公司合作开发的AB型双 [24] 价BoNT重链重组疫苗被批准进入?期临床与此同时Tavallaiea 等 将合成的蛋白片段 Hc8731296Hc 8731095Hc 10961296以及后两者混合后分别对小鼠进行免疫 2N 2C 结果表明Hc片段在接种1次后就可以产生保护性免疫应答而Hc 或Hc 只有在加大剂量和多次 2N 2C 接种后才有一定的保护作用表明Hc 和Hc 这两个片段之间的相互作用以及Hc的原始结构对产 2N 2C 生保护性抗体至关重要以上研究的结果为开发亚单位疫苗提供了有力证据Hc片段也成为当前 开发亚单位疫苗的重点但由于肉毒毒素基因组中的AT含量高70而且含有大量的罕见 - 5 -宁夏大学硕士学位论文第一章文献综述 密码子导致其在异源表达时表达量低使用原核表达时最多能达到23mgL在一定程度上限制 了其发展 [25] 2007 年美国杰弗逊医学学院的 Ravichandran 等 研制出了一种通过粘膜给药途径的抗肉 毒毒素 ABE 的三价苗该疫苗引起的抗体抗毒素途径有三条1阻断毒素通过上皮细胞 被吸收2增强循环系统中清除毒素分子的效果3阻断毒素分子作用于肌肉神 经结点证 [26] 明了粘膜途径给药具有良好的免疫效果Shone 等 通过对 BoNT 的轻链关键性氨基酸进行定 点突变利用大肠杆菌表达系统成功的表达了 BoNT 的 LH 重组蛋白为无毒全长重组 N BoNT 疫苗的研究提供了很好的思路 15 我国的肉毒毒素研究状况及本课题的意义 我国的肉毒中毒早已存在但直到1958年才为北京医学院流行病学吴朝仁教授在新疆查布查 尔县证实所谓查布查尔病即当地锡伯族人嗜食面酱的中间产物米松糊糊引起的肉毒中 毒上世纪60年代初在兰州生物制品研究所成立的肉毒毒素中毒诊断治疗预防制剂的研究基 地也为肉毒中毒的救治起到了药物保障作用 对于BoNT疫苗的研究主要来自于军事医学科学院早在上世纪70年代便开始了BoNT类毒 素疫苗的相关研究工作但直到本世纪初才有研究报道2004年军事医学科学院的王景林等 在国内首次成功克隆出了BoNTA Lc片段并实现了在Ecoli中的高效表达占全菌蛋白的23以 [27] 上并以Ni-NTA亲和层析法完成了BoNTA Lc的纯化纯度达97以上 之后又成功表达并 [282930] 纯化出了BoNTA HcBoNTB H BoNTE H 等 具有较好抗原性的片段2008年军事 c2 c2 [31] 医学科学院的孙志伟课题组 使用自行构建的质粒pTIG-Trx成功的获得了BoNTB Hc蛋白的 [32] 可溶性表达此外其他的一些单位和研究小组也有零星的研究报道如柳增善等 通过PCR 扩增出了A型肉毒毒素重链的基因片段并进行了序列分析 尽管我国在BoNT基因工程疫苗的研究中已经取得了许多进展但是仍有许多问题需要进一 步研究如1BoNTA片段的表达量不高不利于疫苗的大量制备2用抗原免疫小鼠后 血清效价不高3攻毒实验中发现所表达的BoNTA片段保护性不好不能很好的结合天然毒 素等等要制备出性能优越的BoNT疫苗首先要保证其安全性即如何去除BoNT的毒力其次 要保证其具有良好的抗原性目前的研究表明BoNT的HcH 和Lc等3个功能片段上都存在 N 中和性抗原部位可能Hc的中和表位要多于H 和Lc这也是Hc的免疫保护效果优于H 和Lc的缘 N N 故所以BoNT全长分子的免疫原性要优于HcH 和Lc功能片段的单一免疫原性但目前流行 N 的全长BoNT疫苗主要是一些通过物理或化学的方法使天然的BoNT失活减毒而成的类毒素疫 苗该类疫苗的制备存在着许多的缺陷首先要获得BoNT蛋白必须要从肉毒梭菌中提取 这使实验存在相当大的危险因素其次制备合格的BoNT类毒素疫苗需要很长的周期进行大 量的安全性试验等等为了改善这些不利条件我们拟通过基因工程手段改造全长BoNT免疫原 降低毒性保留或提高免疫原性发展重组全长BoNT突变体疫苗 想要成功表达出BoNT的全长重组蛋白疫苗首先要考虑如何去除其毒力BoNTA的轻链具 有金属内肽酶活性是BoNT全毒素的活性功能区域决定了BoNT的毒性作用在BoNTA Lc中 锌结合模体HEXXH位于第223-227位高度保守对Lc生物学活性的发挥起着重要作用从 - 6 -宁夏大学硕士学位论文第一章文献综述 2 BoNTALc的晶体结构预测的锌配位模型显示His223His227Glu262直接与Zn 形成配位键 2 [33] 而Glu224借一个水分子与Zn 相连接 Glu224对Lc的催化活性非常重要类似于嗜热菌蛋白酶 [34] 中的Glu134可能参与了肽键水解的各个环节 在Lc活性中心还存在一些次层残基如Arg362 Tyr365Phe266和Glu350等其主要功能在于维持和稳定Lc活性中心严格的结构或其与被结合底 [35] 物的相对位置来保证Lc的最佳酶解能力特别是Arg362Tyr365根据Binz等 人的研究发现 这两个位点直接参与了肉毒毒素轻链与底物的催化作用共同保证了嗜热菌蛋白酶过渡态的稳 定是典型的隶属于谷氨酸锌化总科的金属蛋白酶而对Glu350进行突变则能显著的降低酶的 水解活性导致这一现象的原因主要是改变了活性位点的精细结构使得酶对热变性的更加敏感 并降低其对锌离子的亲和力因此我们选取了Arg362Tyr365和Glu350三个关键性的氨基酸位 点针对这三个位点突变引物进行定点突变通过改变BoNTA Lc的活性中心结构使其无 法识别底物蛋白SNAP-25从而彻底去除了BoNT的毒力为疫苗的安全性奠定了基础 在去除了BoNT的毒力后就要考虑如何能成功的表达出全长BoNT蛋白由于该蛋白分子量 很大达到了150KDa这对于常规的大肠杆菌表达系统来说负担过重而且BoNT基因的AT 含量很高并有大量的大肠杆菌非偏好密码子这些不利因素大大加大了表达 BoNT全长蛋白的难 [36] 度针对这一问题我们采用了产气荚膜梭菌的表达系统 选用pJRC200质粒作为表达载体 该载体含有CPE蛋白的阅读框架选用这一系统具有很多优势1产气荚膜梭菌与肉毒梭菌都 属于梭菌属生物源上的相近使得其更利于BoNT蛋白的表达2梭状芽孢杆菌抗原蛋白的 表达量高而且不需要加入特殊的诱导剂如IPTG等等3抗原蛋白以包涵体的形式存在于 芽孢形成的细胞质中只有当芽孢细胞溶解时外源蛋白才能释放出来由于芽孢有较强的抵抗 力表达的蛋白能受到保护不易被破坏4梭状芽孢杆菌是寄生于人和动物肠道的正常菌 群不致引起机体的过敏反应 综上所述本研究通过定点突变技术对BoNTA Lc上的3个关键性的氨基酸位点进行了定点 突变完全去除了BoNTA的毒力采用新的产气荚膜梭菌系统实现了BoNTA全长蛋白的表达并 进行了抗原性的初步分析为今后发展各型无毒全长BoNT重组基因工程疫苗的研究奠定了基 础 - 7 -宁夏大学硕士学位论文第二章A型肉毒毒素底物SNAP25蛋白的表达与纯化 第二章 A 型肉毒毒素底物 SNAP-25 蛋白的表达与纯化 引言 突触小体相关蛋白 Synaptosomal-associated proteinSNAP-25是主要存在于中枢神经系统 的蛋白质和与其同源的膜蛋白突触小泡蛋白 synaptobrevinVAMP质膜蛋白 syntaxin共同被 [37] 称为 SNARE 蛋白在介导小泡定向和融合方面起重要作用 根据 SNARE 同源物在神经末 梢细胞膜的分布可以分为 v-SNAREVesicle membrane SNARE与 synaptobrevin 相关和 [38] t-SNARETarget membrane SNARE与 syntaxin 和 SNAP-25 相关两大类 因此BoNT 的轻链也因其型别不同而作用于不同的 SNARE 蛋白如 BoNTAE 作 用于 SNAP-25而 BoNTBDFG 作用于 synaptobrevinBoNTC 作用于 SNAP-25 和 syntaxin对于具有相同作用靶标的各型 BoNT来说其在底物的作用位点也是不同的A型肉 毒毒素可以识别 SNAP-25 的 Q197-R198 位点从而对底物进行特异性的切割所以要对 BoNTA的毒力进行分析首先就要获得具有良好生物学活性的 SNAP-25 蛋白 本研究使用本室构建的 pET22b-SNAP25 质粒将其导入大肠杆菌工程菌 BL21DE3中 表达重组蛋白通过 SDS-PAGE 对重组蛋白进行了鉴定最后获得了高纯度的可溶性的 SNAP-25 蛋白 21 材料 211菌株和载体 Ecoli DH5 αBL21DE3购自 Taraka 公司用于表达 A 型肉毒毒素作用底物 25 SNAP- 的质粒 pET22b-SNAP质粒为本室保存 212 主要仪器与试剂 2121 主要仪器 Tpersonal PCR 仪德国 Biometra 公司 微量移液器Eppendorff EDA290 凝胶成像系统日本 Kodak 公司 EC250 电泳槽及电泳仪美国 EC 公司 1-15K SIGMA高速冷冻离心机德国 SIGMA 公司 55P-7 超速离心机日本 HITACHI 公司 VCX-760 超声破碎仪美国 SONICS公司 - 8 -宁夏大学硕士学位论文第二章A型肉毒毒素底物SNAP25蛋白的表达与 纯化 AKTAprime plus 蛋白纯化仪美国 GE Healthcare 公司 ND-1000 核酸蛋白定量仪美国 NanoDrop 公司 -80?超低温冰箱日本 SANYO 公司 Nu-440-44E 生物安全柜美国 NUAIR 公司 2122 主要试剂 质粒提取试剂盒IPTG 购自 Promega 公司Ni-NTA纯化柱购自 PIERCE公司 BCA法蛋 白定量试剂盒购自美国 Pierce 公司 Marker DL2000 购自 Taraka 公司胰 化蛋白胨Tryptone 酵母提取物Yeast extract为 OXOID 产品其他试剂为本实验室常用的分析 纯试剂购自北京 化学试剂公司常用储备液及溶液的配制见附录 质粒小提试剂盒Promega 公司50 次 RNase A10mgml 150 μl 重悬液 30 mL 溶液P1 15 mL 溶液P2 15 mL 溶液P3 20 mL 去蛋白液PD 30 mL 漂洗液PW 15 mL 洗脱缓冲液 15 mL 离心吸附柱 50 个 废液收集管2ml 50 个 BCA蛋白定量试剂盒Pierce 公司 SolutionA1mL SolutionB 50mL BSA5mgml 500L 22 实验方法 221引物设计与合成 根据 Genebank 中已报道的 SNAP 全长基因序列设计特异引物并在 5端和 3端分别引 入限制性酶切位点 NdeI及 NotI SNAP25 上游CATATGGCCGAAGACGCAGACATGCGCA SNAP25 下游GCGGCCGCTCAATGATGATGATGATGATGACCACTTCCCAGCAT引物由上 海生工公司合成 - 9 -宁夏大学硕士学位论文第二章A型肉毒毒素底物SNAP25蛋白的表达与 纯化 222 质粒的转化与鉴定 pET22b-SNAP25 质粒转化 Ecoli BL21DE3感受态细胞方法如将本室保存的 下 1将转化产物加入到感受态细胞中 2冰上放置 20min 342?热激 90s 后转移冰上放置 5min 4加入 900?μl 无抗 LB 培养基37?空气摇床中 150rpmmin 培养 1h 5取 100 μl 菌液涂布含 Amp 的 LB 平板12h 后挑取单克隆进行 PCR 鉴 定方法条件 如下 PCR 扩增体系 试剂 体积 10×PCR Buffer 25 l dNTP25mM each 2l 上游引物 1 l 下游引物 1 l rTaq 酶 03 l 菌落 1 l ddH O 2 17 2l Total 95? 5min变性 94? 1min退火 58? 1min复25 l PCR 反应条件预变性 性 72? 1min 共 30 个循环再 72?延伸 10min4?pause反应后取 5 μl PCR 产物进行 1琼脂糖电泳鉴 定将有阳性结果的单克隆菌落送交上海生工公司进行测序经测序正确的单克隆菌落转接 入培养基中并提取质粒方法如下 1挑取阳性单克隆菌落接种于 5ml 含有 100 μg μl Amp 的 LB 培养基中37?水浴振 荡摇床培养 2菌液 OD 约为 10时将菌液加入 15mlEP管中12000rmin 离心 1min 汲取菌 600 体过量菌液可多次离心 3向 EP管中加入 250 μlP1 工作液充分重悬菌体 4向 EP管中加入 250 μl 的裂解液温和地上下翻转 10 次室温静置 2min 5向 EP管中加入 350 μl的中和液温和地上下翻转 10 次充分混匀室温静置 3min 12000rmin 离心 10min 6吸取上清加入吸附柱中12000rmin 离心 1min 7弃掉废液向吸附柱中加入 500 μl 的 Wash Buffer12000rmin 离心 1min 8重复步骤7一次 9弃掉废液后空柱 12000rmin 离心 2min除去残留液体 10向吸附柱中加入 50 μl 洗脱液室温静置 2min12000rmin 离心 1min回收产物 10 -宁夏大学硕士学位论文第二章A型肉毒毒素底物SNAP25蛋白的表达- 与纯化 即为 pET22b-SNAP25 质粒置于-20?冰箱中保存 223 重组蛋白的诱导表达 将鉴定阳性的单克隆挑取菌落接种于含有 100 μg μl Amp 的 LB 培养基中 37?水浴摇床振 荡培养过夜次日按照 1100 的比例接种于含有 100 μg μl Amp 的 500mlLB 培养基中37?水 浴摇床振荡培养至 OD 为 04-06 时加入 IPTG至终浓度为 1mM25?120rmin 水浴摇床 600 振荡培养过夜诱导培养产物 4?600