cN0甲状腺乳头状癌中央区淋巴结微转移的初步研究[Word文档]

cN0甲状腺乳头状癌中央区淋巴结微转移的初步研究[Word文档] cN0甲状腺乳头状癌中央区淋巴结微转移的初步研究 关键字:cn0,甲状,甲状腺,乳头,头状,中央,中央区,淋巴,淋巴结,巴结,转移,初步,步研,研究 cN0甲状腺乳头状癌中央区淋巴结微转移的初步研究 本文为Word文档，感谢你的关注, [摘要] 目的 探,cN0甲状腺乳头状癌中央区淋巴结的微转移情况，探讨逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR)技术对诊断淋巴结微转移灶的价值，并筛选微转移的临床病理高危因素。 方法 选取2012年11月,2014年3月浙江省肿瘤医院收治的cN0甲状腺乳头状癌患者48例，对从中取到136个病理证实无转移的中央区淋巴结分别用免疫组化和RT-qPCR检测CK19的表达情况。将患者的各项临床病理相关因素作为自变量，以淋巴结微转移因素作为因变量，应用二分类变量Logistic回归模型进行多因素，以期发现微转移可能的高危因素。 结果 免疫组化检测CK19为15.44%(21/136)，RT-qPCR法的阳性检出率为82.35%(112/136)。RT-qPCR 法与免疫组化法比较具有显著差异。Logistic回归模型中筛选出肿瘤甲状腺包膜侵犯是cN0甲状腺乳头状癌中央区淋巴结微转移的危险因素。 结论 应用RT-qPCR检测CK19表达，可提高对甲状腺癌的淋巴结微转移阳性检出率。肿瘤甲状腺包膜侵犯是淋巴结微转移的独立危险因素。 [关键词] 甲状腺肿瘤;甲状腺乳头状癌;细胞角蛋白19;微转移;聚合酶链反应 [] R736.1 [] A [] 1673-9701(2017)02-0001-04 Preliminary study of lymph node micrometastasis in the central compartment of cN0 papillary thyroid carcinoma HAN Chun1 WANG Kejing1 ZHANG Gu2 XU Jiajie1 ZHENG Weihui1 1.Department of Head and Neck Surgery， Zhejiang Cancer Hospital， Hangzhou 310022， China; 2.Department of Pathology， Zhejiang Cancer Hospital， Hangzhou 310022， China [Abstract] Objective To investigate the micrometastasis of lymph node in the central compartment of cN0 papillary thyroid carcinoma， to explore the value of reverse transcription polymerase chain reaction(RT-qPCR) in the diagnosis of lymph node micrometastasis， and to screen the clinical pathological risk factors of micrometastasis. Methods A total of 48 patients with cN0 thyroid papillary carcinoma who were admitted to Zhejiang Cancer Hospital from November 2012 to March 2014 were enrolled in this study. The expression of CK19 was detected by immunohistochemistry and RT-qPCR in 136 lymph nodes in the central zone collected from them， which was pathologically confirmed without metastasis. The clinicopathological factors of patients were taken as independent variables， and lymph node micrometastasis factors were taken as the dependent variables. Multivariate analysis was applied by binary variables Logistic regression model， so as to explore the possible risk factors of micrometastasis. Results CK19 was detected by immunohistochemistry in 15.44%(21/136). The positive rate of CK19 was 82.35%(112/136) by RT-qPCR. RT-qPCR method and immunohistochemical method were compared， and the differences were significant. Logistic regression analysis showed that tumor thyroid capsule invasion was the risk factor of central zone lymph node micrometastasis in cN0 papillary thyroid carcinoma. Conclusion The test of CK19 expression by RT-qPCR can increase the positive detection rate of lymph node micrometastasis in thyroid carcinoma. Tumor thyroid capsule invasion is an independent risk factor for lymph node micrometastasis. [Key words] Thyroid tumor; Papillary thyroid carcinoma; Cytokeratin 19; Micrometastases; Polymerase chain reaction (PCR) 甲状腺癌是最常见的内分泌恶性肿瘤之一，约占全身 恶性肿瘤的1%[1，2]，其中又以甲状腺乳头状癌所占比例最 高，且近年来发病率呈增高的趋势。手术治疗是目前临床治 疗甲状腺癌的主要方法，其中淋巴结转移经常是手术治疗面 临的重要问[3-5]。多数临床认为对无淋巴结转移的患者进 行扩大淋巴结清扫无临床意义，且会增加患者损伤，提高,g 后并发症的发生率[6，7]。因此，如何更好地判断淋巴结有 无转移风险，以指导淋巴结清扫选择和预后判断十分重要。 细胞角蛋白19(Cytokeratin 19，CK19)是近年来发 现的与肿瘤发生发展密切相关的一种肿瘤抗原，其强阳性表 达预示着肿瘤的浸润潜能，与甲状腺癌的发生具有明显的相 关性[8]。近年来，免疫组化方法检测蛋白标志物已经广泛用 于乳头状甲状腺癌的诊断，其灵敏度还存在一定缺陷[9， 10]。本研究通过免疫组化及RT-qPCR联合检测CK19的表达 用于提高对甲状腺癌淋巴结微转移的检测灵敏度和准确度， 并结合患者临床病理因素，探讨影响淋巴结微转移的危险因 素。 1 与方法 1.1 一般资料 研究对象为我院肿瘤头颈外科于2012年11月,2014 年3月收治的初治临床淋巴结阴性(clinical negative lymph node，cN0)甲状腺乳头状癌患者48例，其中男9 例，女39例，中位年龄41(22，70)岁，>45岁36例，?45岁12例;单发病灶35例(72.9%)，多发病灶13例(27.1%);双侧甲状腺癌5例(10.4%)，单侧甲状腺癌43例(89.6%);伴有包膜侵犯23例(47.9%);5例伴有腺内播散及砂砾体(10.4%)。术后病理根据美国癌症联合会(AJCC)2010年第7版癌症分期[11]:T1aN0M0 ?期19例;T1aN1aM0 ?期9例;T1aN1aM0 ?期5例;T1bN0M0 ?期6例;T1bN1aM0 ?期2例;T2N0M0 ?期1例;T2N1aM0期2例;T3N0M0 ?期1例;T3N1aM0 ?期2例;T3N1aM0 ?期1例。48例术前均接受了颈部超声、胸部CT和甲状腺功能检查。均经术中冰冻病理确诊为甲状腺乳头状癌。手术分别行单侧甲状腺及峡部切除或双侧甲状腺全切除术并施行患侧中央区淋巴结清扫术。 1.2 实验方法 手术均由同一医疗组完成。术中将48例患者行中央区清扫的淋巴结标本，每1枚均剔除周围脂肪纤维组织，沿最长轴于中间最大切面对半切开，标号后取其中的1/2标本获取连续切片两张，淋巴结中性福尔马林固定，石蜡包埋。间隔500 μm 连续分切淋巴结，切片厚度为4 μm，分别行HE染色常规病理检查和免疫组化CK19检测，另一半淋巴结放置于液氮罐中冷冻，并储存于-80? 的低温冰箱中用于提取mRNA荧光定量RT-PCR检测CK19的表达。根据术后常规病理诊断结果，排除HE切片证实病理转移的淋巴结，选取HE切片病理未见癌转移的淋巴结进一步行免疫组化及RT-qPCR检测。 1.2.1 免疫组化检测 全部标本经10%中性甲醛固定后常规石蜡包埋，将淋巴结标本4 μm厚度连续切片、染色。切片均经微波抗原修复，采用免疫组化S-P 法检测，具体操作步骤均按照试剂盒说明书进行。CK19单克隆抗体分别购自丹麦 DAKO 公司和美国 Cell Marque 公司。采用 ZEISS ImagerZ1显微镜及VENTANA Image Viewer 3.1.3 图像软 件。结果判定:CK19细胞染色均以细胞浆出现的棕黄色颗粒为阳性标准。所有染色标本均进行数值测量及染色强度判定，每张切片在高倍镜下(40倍)选取 5 个视野，按照阳性细胞所占百分数并参考着色强度确定，行半定量积分法，统一判定结果[12]。按阳性细胞百分比记 0,4分，阳性细胞百分比5 分为强阳性(+++)。 1.2.2 实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测 采用实时荧光定量PCR检测 CK19 mRNA 的表达。淋巴结 RNA 提取和 cDNA 的合成以及 PCR 反应试剂均由广州达晖生物技术有限公司提供，严格按照试剂说明书进行。逆转录反应条件为 42?1 h，70?，15 min(仪器型号:ABI 2720 Thermal Cycle)。RT-qPCR法检测 CK19，其中PCR反应体系为 50 μL，扩增反应条件为:预变性95? 5 min，然后95? 15 s，60? 40 s，共45个循环。同时设置内参对照和空白对照(仪器型号:ABI Step One Plus TM Real-Time PCR Instrument)。CK19正向引物: 5’AGGAGATTGCCACCTACCG3’，反向引物:5’CC TTCCC ATCCCT CTACCC 3’;内参基因GAPDH正向引物:5’CTCTC TGCT CCTCCT GTTCGAC 3’，反向引物:5’GCCCAATACGACCAAATCCG 3’。 1.3 统计学方法 采用SPSS 23.0 统计学软件进行统计分析。数据为分类资料，CK19 mRNA拷贝数的比较采用χ2检验。分析甲状腺癌患者 RT-qPCR 法检测CK19的阳性率，对比免疫组化与RT-qPCR法检测方法是否存在差异。多因素分析采用二分类Logistic回归模型分析。P 2 结果 2.1 免疫组化结果 48例 cN0 甲状腺癌患者中，术中共取到 212 枚中央区清扫淋巴结标本，平均4.4枚。经病理证实转移 76 枚，病理证实无转移 136 枚。病理证实无转移的136 枚淋巴结行 进一步检测。根据上述免疫组化判定结果，CK19阳性的数目分别为 21例，余27例为无转移患者。见封三图1。 2.2 RT-qPCR检测结果 采用Primer 5.0软件设计检测GAPDH、CK19引物，并进行2对引物扩增特异性分析。2对引物具有较好的扩增特异性，能保证样品中目的基因准,_检测，见封三图2,3。48例甲状腺癌患者的136枚病理证实无转移淋巴结中，免疫组化CK19阳性数目为21枚。通过RT-qPCR检测CK19，阳性数目为112枚。CK19基因RT-qPCR检测法较免疫组化具有更高的阳性检出率，两种方法比较，差异有统计学意义[15.44(21/136) vs 82.35%(112/136)，P<0.05]。见表1。 表1 CK19在免疫组化和 RT-qPCR两种方法中的表达比较 2.3 淋巴结微转移的临床病理特征及影响因素 将患者的各项临床病理相关因素作为自变量，以淋巴结微转移因素作为因变量，筛选淋巴结微转移的危险因素。采用分类变量Logistic回归分析:将性别、年龄、病理T分期、病灶个数、包膜侵犯、单双侧、腺内播散等因素引入分析，结果提示:包膜侵犯是淋巴结微转移的主要危险因素，其余变量比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。Logistic回归分析结果见表3。 3 讨论 甲状腺癌多数属于低度恶性、进展相对缓慢，未发生转移的甲状腺癌患者术后10年生存率超过80%[13]。据统计超过90%的甲状腺乳头状癌可检测到淋巴结微转移。微转移是恶性肿瘤发展过程中播散于淋巴系统、血循环及骨髓等器官中的微小肿瘤细胞灶，是肿瘤局部复发和远处转移的根源，是影响患者预后的因素，鉴别是否发生淋巴结微转移对于临床处理具有较大的指导意义。对于有淋巴结累及的患者应行淋巴结清扫(包括中央区和/或侧颈部)，但对于术前超声检测及术中探查未发现明显可疑淋巴结的患者是否应行常规清 扫仍有争议。目前为止，还没有非常可靠的技术和检测指标能用于准确评估甲状腺癌的转移。 CK19是一种低分子量角蛋白，主要在上皮细胞中表达，但不会在间质组织中表达，是一个上皮组织来源肿瘤特异的微转移标志物[14]。在甲状腺癌中可以强烈而弥漫的表达，而在正常甲状腺组织、结节性甲状腺肿中不表达或灶状表达，可用于预测甲状腺癌淋巴结微转移。已有不少研究显示:CK19的表达能反映甲状腺乳头状癌淋巴结微转移的状态[15-17]。 运用RT-qPCR技术对比目前普遍采用的HE染色技术对淋巴结微转移的检测分析比较，RT-qPCR 技术是较为灵敏的方法，可以检测淋巴结的微小转移。本研究用免疫组化和RT-qPCR方法对136枚甲状腺癌淋巴结组织的CK19进行检测，其中RT-qPCR法阳性检出率更高，两种检测方法比较差异具有统计学意义(P<0.05)。在本研究中可见RT-qPCR 技术比免疫组化更敏感。因此，在影像学检查及触诊未及颈淋巴结的cN0患者中，可对清扫术后病理阴性淋巴结标本进一步应用RT-qPCR技术检测淋巴结微转移的状况。对于RT-qPCR检测结果阳性的患者可考虑选择较为积极的治疗策略如颈淋巴结清扫术，或严密随访必要时手术。反之则可选择暂不行淋巴结清扫，定期复查。 检测甲状腺乳头状癌淋巴结微转移可作为病理状态的有效补充，但本研究结果显示，cN0甲状腺乳头状癌淋巴结的微转移与甲状腺癌患者大部分的临床病理高危因素无显著统计学差异。张磊等[18]在cN0甲状腺乳头状癌常规病理淋巴结转移的多因素分析中显示非微小癌、男性、年龄<40岁是淋巴结转移的高危因素。一些研究[19-23]也认为男性，年龄<45岁、肿瘤有腺外侵犯、多病灶者，淋巴结转移发生率明显增加。但本研究中在肿瘤的大小、性别、年龄这三个因素中，均未显示是淋巴结微转移的危险因素。一方面与本研究的样本量小有关，另一方面也提示，淋巴结微转移的高危因 素的筛选较常规病理的转移更为困难，说明微转移发生在较 早的肿瘤进展过程中，预测该相关因素与临床病理特征，需 要进一步深入研究。 本研究发现甲状腺包膜侵犯这一因素是淋巴结微转移 的独立危险因素。优势比OR=4.000意味着伴有包膜侵犯的患 者，发生淋巴结微转移的危险是无包膜侵犯的4倍。因此伴 有包膜侵犯的患者需要更多的关注淋巴结的处理方法，包括 中央区淋巴结的积极清扫，右侧甲状腺癌的患者，还有必要 行右侧喉返神经深面淋巴结的清扫等。 总之，本研究一方面认为RT-qPCR法检测甲状腺癌微 转移具有相对优势。另一方面，淋巴结微转移的预测模型的 优化建立需要扩大样本量，并关注包膜侵犯这一因素，具有 一定的临床指导意义。 [参考文献] [1] Mai KT，Truong L D，Ball C G，et al. 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