中药消栓通络方有效成分组及相关成分的药动学的研究（可编辑）

中药消栓通络方有效成分组及相关成分的药动学的研究（可编辑） 中药消栓通络方有效成分组及相关成分的药动学的研 究 中国协和医科大学 博士学位 中药消栓通络方有效成分组及相关成分的药动学研究 姓名:裴利霞 申请学位级别:博士 专业:药理学 指导教师:杜冠华;刘艾林 20080601.. 缩略词表 准确度? 时间从时到无穷大时血 帅药浓度一时间曲线下面积 . 时间从时到时血药浓 .度一时间曲线下面积 药时曲线一阶矩 碰撞活化解离碰撞能量 碰撞诱 导裂解清除率 达峰浓度 变异系数 碰撞室出口电压 细胞色素 去簇电压 入口电压提取回收率电喷雾离子化 高效液相色谱法 .内标 .. 静脉给药 / 质荷比 基质效应 多反应监测 平均滞留时间 /串联质谱还原性辅酶 口服给药 .. 过程效率精密度 质控样品 ..汀 & 相对标准偏差 丹酚酸 标准差 稳定性消除半衰期 , 脱溶剂气温度总离子流 达峰时间 戤 嗍 三羟甲基氨基甲烷维生素 消栓通络方有效成分组独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研 究成果。论文中除了特别加以标注和致谢的地方外,不包含其他人已经发表 或撰写 过的研究成果,也不包含为获得其他教育机构的学位或证书而使用过的材 料。与我 一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢 意。 签字日期: 年月”日 学位论文作者签名:裴彖霞 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解量塞迹塑匡堂院有关保存、使用学位论文的管理 办法。有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查 阅和借阅。本人授权量塞迹塑匡堂暄可以将学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 保密的学位论文在解密后适用本授权书 导师签名: 学位论文作者签名:浆禾愎 签字日期:冽年/月 签字日期:川年/月夕日 日 学位论文作者毕业后去向: 工作单位: 电话: 通讯地址: 邮编:..’盯中药消栓通络方有效成分组及相关成分的药动学研究 中文摘要 中药复方是中医药理论的具体体现,但其作用机理及质量控制问题限制了中药 复方的进一步使用。从中药复方药动学研究入手,研究服药后体内出现的中药成分 及其代谢产物,对于认识中药复方的药效物质基础具有十分重要的作用,能够促进 中药的现代化、科学化和国际化。 消栓通络方由味中药黄芪、川芎、丹参、泽泻、山楂、三七、槐花、桂枝、 郁金、木香、冰片组成,临床上用于治疗血脂增高、脑血栓引起的精神呆滞、舌 质发硬、言语迟涩、发音不清、手足发?、活动疼痛等症,是治疗心血管疾病的传 统中药复方。 为开展服用消栓通络方有效成分组后主要药效成分的药动学研究,本文建立了 灵敏、特异地同时定量检测方中四种化合物的方法。运用这种分析方法研究了 服用后,芦丁、金丝桃苷、槲皮素和山柰酚在大鼠体内的药动学特征。 另外本文还对在大鼠体内的吸收、分布、代谢及排泄,匹诺塞林在 犬体内的药动学及代谢产物进行了探讨。 第一部分 本试验选择作为研究对象,研究了大鼠口服后,芦丁、金丝桃苷、 槲皮素和山柰酚的药动学特征。 血中即可检测到芦丁、金丝桃苷、 大鼠口服剂量为/后, 槲皮素、山柰酚,四种成分的达峰时间依次为.、.、、 ,达峰浓度分别为 .士.、. .、. .、.士. /。血浆药时曲线经梯形法 .、.士 计算,芦丁、金丝桃苷、槲皮素、山柰酚的口锄分别为. .、. .、.士. ./。 第二部分 这部分实验主要是对在大鼠体内的吸收、分布、代谢及排泄进行探讨,建 立//法测定在大鼠血浆的浓度及组织分布情况。应用、. 等方法从大鼠尿样及胆汁中发现了的种代谢产物。本研究还探讨了对 大鼠肝微粒体酶的影响。初步阐明了在大鼠体内的吸收、分布、代谢及 排泄过程,为指导新药开发和临床用药提供了一定的理论依据。 .在大鼠体内的吸收动力学研究..汀 建立了测定大鼠血浆中的//法。线性范围为.. /,最 低定量浓度为. /。绘制大鼠灌胃和静脉给予后的血浆药物浓度.时间曲 线,计算其主要药物动力学参数,评价大鼠给药后在体内的药动学特征。 .在大鼠体内的组织分布研究 建立了测定大鼠体内各组织中的//法。实验结果发现,在大鼠 体内许多组织中都能检测到,表明在大鼠体内广泛分布。 .在大鼠体内的代谢研究 应用,/等方法从大鼠尿样及胆汁中发现了的种代谢物,通 过分析及其代谢产物的多级质谱特征丢失碎片及质谱裂解规律,并与相关文 献比较对照,推测了代谢产物的结构。在大鼠体内主要经历种代谢途径,包 括甲基化、单葡萄糖醛酸结合反应,甲基化和葡萄糖醛酸结合双重反应。 .在大鼠体内的排泄研究 大鼠口服后 尿排泄总量约占给药量的.%,粪排泄总量约占给药量 的.%,大鼠给药后 胆汁排泄总量约占给药量的.%。 .对大鼠肝微粒体酶的影晌 通过对的特异性底物非那西丁,的特异性底物甲苯磺丁脲, 的特异性底物奥美拉唑,的特异性底物右美沙芬,的特 异性底物氯唑沙宗,的特异性底物硝苯地平进行分析,评价了对大 鼠肝微粒体、、、、和活性 的影响,结果表明:对大鼠肝微粒体酶的各个亚型既没有明显的抑制作 用,也没有明显的诱导作用。同时发现,在体内对大鼠肝徽粒体总量及 蛋白总量都没有明显的增加或减少作用。 第三部分 这部分研究主要是对匹诺塞林在犬体内的药代动力学及代谢产物进行探 讨,建立了测定犬血浆中匹诺塞林浓度的/法,考察了匹诺塞林在 血中即可 犬体内的吸收动力学。犬:服 /匹诺塞林后 检测到原形药,达峰时为 ,达峰浓度为. /。应用、. 等方法从犬尿样及血样中发现了匹诺塞林的种代谢产物并对这两种代谢产 物进行鉴定。 关键词: 匹诺塞林药动学代谢产物液相色谱一质谱联用法 ..’ . , . ,,, . ,, , , , , , , , , , ,, . ,, , .,, , ., . ., ,,, . / ,,, ..,.,, ..,. .,. . . .,. .锄 .,. /,. . .,. .,. ./. .. & , , . , , 。 ./ , . . . . , ,. .? / . . /... . .. . // . . . . .,. /. . .. . . . % ?. ,.% ,.% . . ? ..., . . , ,, ... . , . / ., . /.? ./“,.; : ; ;;;// ..第一部分在大鼠体内的药代动力学研究 .‘ 刖 吾 消栓通络方出自北京同仁堂传统秘方,共由味中药黄芪、川芎、丹参、泽 泻、山楂、三七、槐花、桂枝、郁金、木香、冰片组成。主要功效为活血化 瘀、 、 温经通络。该方现已被开发成多种现代剂型,包括消栓通络片、消栓通络胶 囊【 消栓通络颗粒等,其中消栓通络片于《中华人民共和国药典》年版一部开始收 载。临床上用于治疗血脂增高、脑血栓引起的精神呆滞、舌质发硬、言语迟涩、发 音不清、手足发?、活动疼痛等症,是治疗心血管疾病的传统中药复方。 方解 消栓通络方中重用黄芪为君,取其力专性走,周行全身,以助推动诸药之力, 使气旺血行,瘀祛而不伤自,达到益心气的目的;川芎为血中气药,行气解郁之功 尤佳,与丹参配伍加强活血止痛之效为臣;更辅以山楂、三七、郁金,活血化瘀; 桂枝温经通络,木香行上、中、下三焦之气,两药相伍,使寒凝之气滞得温则通, 气行则血行,又加强活血药物之功力;槐花苦?为清热?血药,泽泻甘寒为利水渗 湿药,两药配伍,一方面可防辛温之品化热化燥之虞,另一方面降低血脂作用;冰 片芳香通窍为使。诸药配伍,具有益气活血、温阳通络之效。消栓通络方的组成如 表卜所示。. . .. 组方中药材的成分及功划 处方中川芎为伞形科植物川芎的干燥根茎,含%的挥发油为其有效药用成分。 本品性温、味辛、微苦,有活血行风,祛风止痛的功效; 丹参为唇形科植物丹参的干燥根和根茎,有效成分为菲醌类化合物丹参酮、隐 丹参酮、新丹参酮等,隐丹参酮具有抗菌作用。丹参性微寒、味苦,有祛瘀止痛, 活血调经,养心除烦的功效,对心绞痛,心肌梗塞有一定疗效; 黄芪为豆科植物蒙古黄芪及膜荚黄芪的干燥根,含一谷甾醇、天冬素、黄芪多 糖、胡萝卜苷和多种氨基酸及微量成分硒。黄芪多糖具有免疫促进作用。本品性微 温、味甘,补气固表、利尿、托毒生肌; 三七为五加科植物三七的干燥根,含多种与人参类似的皂苷及止血活性成分和 少量的黄酮苷。本品性温、味甘、微苦,有止血散瘀,消肿止痛的功效; 郁金,为姜科植物郁金的干燥块茎。性寒、味苦辛,行气止血,?血,祛瘀, 利胆; 槐花,性寒、味苦,有?血止血,润肠通便;木香,辛、苦、温,行气止痛, 发汗解肌,温通经脉,助阳化气; 冰片,性微寒,味辛苦,芳香开窍,消肿止痛,去翳明目; 山楂,性微温、味酸,消食化积,散瘀止痛,强心降压。 消栓通络方的药理作用及临床应用 .降血脂作用 消栓通络片对高血脂症有防治作用,可使血清总胆固醇和甘油三酯的含量下 降。能够预防及抑制主动脉粥样硬化斑块的形成、缓和其发展,可使主动脉内各种 脂质减少,特别是胆固醇显著减少。同位素跟踪证实本品能抑制肠内胆固醇吸收, 及其体内胆固醇的酯化。还能提高血液中高密度脂蛋白一胆固醇的含量。高密度脂 蛋刍提高后,能促进胆固醇从动脉壁正常地消除,运至肝脏代谢和排泄,防 止其沉积。所以本品具有干扰胆固醇吸收、分解和排泄的作用。 血脂紊乱是致冠心病和其他动脉粥样硬化性血管疾病的主要危险因素。降低 、和水平,升高水平能有效减少冠心病及其他动脉粥样硬化血管疾 病发生率。消栓通络片为纯中药制剂,可以有效降低、、,并合理提高 ,应用消栓通络治疗高脂血症患者有其卓越疗效,特别是对治疗中老年人高脂 血症比较理想【。 .抗血栓形成和改善血液流变学 血栓形成是影响患者生命的重要因素,血小板激活在血栓形成过程中发挥着至 关重要的作用。消栓通络片通过对凝血因子的影响抑制血栓的形成,能够提高纤溶 酶的活性,促进纤维蛋白的溶解;可使凝血酶元时间、凝血活酶时问和凝 血酶时间延长,从而使凝血时间延长。可以提高血小板中含量,对血栓烷 .. 的活性和生物合成有抑制作用,可降低血小板表面活性,抑制血小板聚集,且能使 己聚集的血小板解聚。通过以上作用可以防止血栓形成或延长血栓形成时间,达到 抗血栓形成的作用,此外消栓通络片具有溶栓作用,可缩短血栓长度和减轻血栓的 重量。能够改善血瘀患者血液流变学特性,随着采用本药物的治疗可以使患者的各 项血液流变学指标均见改善。消栓通络精制胶囊’】具有明显的抗血栓形成作用;并 可抑制诱导剂诱导的家兔血小板聚集,降低最大聚集率。表明该药可能通过抑制血 小板激活的作用,从而抑制血栓的形成。 张冉【,】等用凝血酶诱导小鼠肺栓塞模型评价的抗血栓作用:观察药物对 小鼠尾尖出血时间和凝血时间的影响,同时测定凝血酶原时、活化部分凝血 活酶时间和凝血酶时。结果显示:可剂量依赖性使凝血酶诱导 的小鼠急性肺栓塞模型的麻痹持续时间显著缩短;可延长小鼠出血时间%,并显 著延长大鼠和。可抑制体内实验性血栓的形成,其作用可能与抑制内 外源性凝血途径有关。 .改善微循环 使用消栓通络治疗后的患者,可见微循环血液流速加快,流态趋向正常,毛细 血管网开放增加,外周微循环障碍明显改善。治疗前流动缓慢或瘀滞的血细胞流速 加快,集聚的血细胞解聚,有报道【 】用消栓通络丸治疗脑梗塞。 .影响血流动力学 消栓通络片能使心功能不良的患者心脏功能改善,加强心肌收缩力而不增加心 肌耗氧量,并能使冠脉血流量增加,并能扩张肢体血管,使肢体脉博动增强。另外, 本药能促进组织的修复与再生,使心肌梗塞患者坏死心肌清除较快,巨噬细胞活跃, 纤维母细胞分化和胶原纤维形成明显,因此对心肌梗塞患者具有一定的治疗作用 【“】 .抗动脉粥样硬化 .的高低与动脉粥样硬化的广泛性、严重性成下性相关,.可作 为预测糖尿病血管病变的重要指标之一。仲过生【】等研究发现:服用消栓通络胶囊 后,治疗组病人其.、明显下降,与对照组比较有显著性差异。由此推测, 的氧化修 消栓通络胶囊具有通过清除血管自由基及抗过氧化损伤作用,抑制 饰,防止?的形成,从而达到防止动脉粥样硬化,修复血管内皮损伤作用, 最终有利于抑制血管内皮素、内皮生长因予、转化生长因子、血管紧张素等细胞因 子的释放,从而降乇,有利于防止患者血管病变的进一步发展。 以上分析表明,消栓通络方具有良好的疗效,临床应用广泛,是作用肯定的中 药制剂。但是,对消栓通络方的研究与其他中药方剂研究一样,还有很多问题没有 解决,比如复方的药效物质基础、药效成分的体内过程等,尤其是中药复方的药动 学研究,更称为中药复方研究的关键问题之一。..汀 & 在前期实验中,本课题作采用萃取和大孔树脂相结合的方法从消栓通络方中制 备得到个连续组分,并采用与动脉粥样硬化相关的多个模型对这些组分进行了 筛选与评价,初步确定了消栓通络方的有效成分组。在此基础上,为满足较大用量 的实际需求,对原有工艺进行了简化,并对多种新工艺所制得的组分进行了轮的 筛选与评价,最终确定采用分级萃取的工艺制备较大规模用量的消栓通络方有效成 分组。 本课题针对进行药动学研究,选择为研究对象,通过口服给药测 定方中四个药效成分的体内动力学参数,研究其在体内的药动学特征,为临 床应用 提供依据。另外,通过对比单体给药与复方给药后成分在体内药动学参数的 差异, 推断中药复方配伍的原则。 与方法 药品与试剂 中国医学科学院药物研究所植化室 中国药品生物制品检定所 芦丁 金丝桃苷 中国药品生物制品检定所 中国药品生物制品检定所 槲皮素 中国药品生物制品检定所 山奈酚 水飞蓟宾 中国药品生物制品检定所 ,美国 乙腈,纯 甲酸,纯 甲酸铵,纯 以上所有溶剂均经抽滤、超声脱气处理津腾公司滤膜:水相,. ;有机 相,.肛 仪器与设备 高效液相色谱与美国应用生物系统公司 美国公司 型三重四极杆质谱仪联用。质谱配有离子源以 ..数据处理系统。 及 . 氮气吹干仪 .. 漩涡振荡器 北方同正 高速台式离心机 贝克曼公司 江苏海门其林贝尔仪器公司 微量振荡器 .电子天平 公司 微量移液器 公司 实验动物 大鼠,雄性,体重 ,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,许可证 ?,相对湿 编号:京.。自由摄食饮水,饲养环境温度控制在 度?%,通风干燥、安静, 光照周期。 给药与样品采集 ,自由饮水。随机 健康大鼠只,雄性,体重 。给药前禁食 分为组,每组只,分别灌胃给予 /;芦丁 /;槲皮素 和 ,于给药前及给药后 , , , /;以上给药体积均为 ,.,,,,,, 经眼球后静脉丛取血约. ,置于预先准备含有肝 素的离心管中,离心 曲制得血浆,并按 分装成两份,于一 保存直至分析。 大鼠血浆中芦丁、槲皮素、金丝桃苷,山柰酚的定量分析方法的建立 色谱条件 . .., 色谱柱: . ; 柱温:。; .% ; 流动相:, .%; , : 梯度洗脱: %%; . %%: ?? %?%: %: : 流速:. /; 进样量:“。 质谱条件:负离子检测 ..& 离子源相关的参数: ?. 化合物相关的参数如 所示 .????. : ;: ;: ; :.对照溶液和内标溶液的配制 ,分别 标准溶液的配制精确称取芦丁、槲皮素、金丝桃苷和山柰酚各. 用甲醇配成浓度为 /的储备液。精确吸取四个被测化合物的储备液适量,用 甲醇稀释成浓度为 ,/的中间液,放于一冰箱中备用。 内标溶液的配置精确称取作为内标的水飞蓟宾. ,用甲醇配成浓度为 /的储备液。吸取该储备液适量,配制成浓度为 ‖的内标液,存放于一。 冰箱中备用。 .血浆样品预处理 测定前将血浆样品解冻,取 /, ,加入 内标溶液水飞蓟宾, ,离一 曲, 混合均匀后,“乙酸乙酯,振摇 取上清液 .,并在。用氮气吹干,残留物用 流动相溶解,用 ./分析,进样量“。..盯 & .分析方法的确证 分析方法的选择性 取大鼠空白血浆肛,按“.血浆样品预处理”项下方法操作,获得空白样 品质谱图,见?。取大鼠灌胃给予后收集的血浆样品,同法操作, 得色谱图,见一。其中芦丁的保留时间为.,金丝桃苷保留时. ,内标的保留时间为. ,槲皮素的保留时间为. ,山柰酚的保留时间 。 为. 结果表明,空白血浆中内源性物质不干扰芦丁、槲皮素、金丝桃苷和山柰酚 的 测定。 眚口口乓墨荀芷// 一... .. ;. . ,,, ,. 标准曲线的制备取浓度分别为,,,,,和. /的标准血浆样品, 经过血浆样品前处理后,进样“,得色谱图,以待测物浓度为横坐标,待测物 与内标物的峰面积比值为纵坐标,用加权最小二乘法 ,/进行回 归运算,求得的直线回归方程即为标准曲线。芦丁、金丝桃苷、槲皮素和山 柰酚四 种成分的回归方程、线性范围、线性相关系数等见.、.、.、.。根据 标准曲线,芦丁、金丝桃苷、槲皮素和山柰酚的线性范围均为.. /,定量 .. 下限均为. /:。 . . . ???.耐???~珥/ . 刊??耐省。山/一. 埔挖加 州??甘爿柙山? .珥 . ..地? ;:目学~ 乜 /. 样品的稳定性在方法学验证中,对样品稳定性进行考察,内容包括样品在整 个分析过程中可能遭遇到的各个重要环节,包括保存条件、处理方法和放置 过程等。 血浆样品室温放置稳定性:制备低、中、高个浓度、、 /的血浆样 品,分别在室温放置、、、 后,测定芦丁、金丝桃苷、槲皮素和山柰酚的浓 度。 血浆样品冻融稳定性:制备低、中、高个浓度、、 /的血浆样品, 在.冰箱中冷冻后取出,室温融化,重复操作次,测定芦丁、金丝桃苷、槲皮 素和山柰酚的浓度。 血浆样品冷冻放置稳定性: 制备低、中、高个浓度、、 /的血浆 样品,在.。冰箱中放置个月,取样测定芦丁、金丝桃苷、槲皮素和山柰酚的 浓 度。 血浆样品处理后室温放置稳定性:制备低、中、高个浓度、、 / 的血浆样品 ,加入 /的水飞蓟宾甲醇液 ,混合均匀后,加入 ,离心 曲,取上清液 ,并 ?乙酸乙酯,振摇 在。下用氮气吹干,残留物用“流动相溶解。将此处理后的样品在室温放 置、、、 后取上清液测定芦丁、金丝桃苷、槲皮素和山柰酚的浓度。 在所有的测试样品中,芦丁、金丝桃苷、槲皮素和山柰酚在试验条件下均相 当 稳定。 方法的准确度与精密度按“标准曲线制备”项下方法分别配制芦丁、金丝 桃苷、槲皮素和山柰酚的低、中、高三个浓度、、 /的质量控制样品 样本,连续测定三天,与标准曲线同时进行。计算质量控制样品测得的浓度, 与配 制浓度对照,求得本方法的准确度与精密度,见.。本方法的同内、日间精 密度与准确度均符合国内外的有关规范要求。 ..盯.,,, . 提取回收率分别在一份大鼠空白血浆中依次加入芦丁、金丝桃苷、槲皮素 和山柰酚的标准溶液,配制成四种成分浓度均为,和 /的标准血浆样品, 按样品处理方法处理后,取样品溶液“进样,记录色谱图。用%流动相配制 芦丁、金丝桃苷、槲皮素和山柰酚的标准溶液,配制成各成分浓度分别为, 和 /的标准对照样品溶液,取 各浓度的标准对照样品溶液加入内标溶液,混 合均匀,取“进样,得色谱图,比较血浆样品的峰面积与相应对照溶液的峰面 积,得到本方法的提取回收率,见.。.. .基质效应采用同一浓度的样品所得到的色谱图中芦丁、金丝桃苷、槲皮素 和山奈酚的色谱峰面积与样品所得到的色谱图的各样品峰面积的比值进行 比较, .。芦丁、金丝桃苷、槲皮素和山柰酚在 考察检测条件的基质效应。结果见 三个浓度,和 /时的绝对基质效应在.%之间,内标化合物的基质效应 为%,可见大鼠血浆中的内源性物质在被分析化合物的离子化过程中并不会 对被 分析化合物造成离子抑制或者增强作用。样品在同一浓度各个化合物的峰面 积的 在...%之间,说明不同大鼠血浆中的内源性物质对被分析化合物离子化过 程的影响没有显著性差异。 ... &.,,, × ./ % % % ..士. . .士. .士. . .士. . .士. . .士. ..士. . .士. ..士. . .士. ..士. . .士. . . .士. ..士. .士. . .士. ..士. . .士. . .士. ..士. . .士. . .士 ..士. . .士. . . 二 .士. . .士. .血浆样品的测定 实际进行样品分析时,样品处理和//法测试平行进行,未知样品测定 的测试周期连续 按“血浆样品前处理”项下操作,处理后的血浆样品以每个样品 进样,每个分析批制备一条标准曲线,同时制备低、中、高三个血浆药物浓度的质 量控制样品,每个浓度的质量控制样品进行双样本分析,根据每一批的标准曲线计 算质量控制样品和未知样本的浓度。上述质量控制样品中最多允许两个不同浓度的 样品超出理论值的%最低浓度为%,否则此批数据不被接受。若未知样本中被 测化合物的浓度超出了标准曲线的线性范围,则该样本应该用空白血浆稀释后再取 进行分析。 .. & .数据处理 采用 .版数据处理系统对所获得的数据进行处理分析,计算其药代动力学 参数。 结 果 中芦丁的代谢 灌胃给予大 /后,大鼠血浆中芦丁的药物浓度一时间曲线见 .;灌胃给予大鼠芦丁 /后,大鼠血浆中芦丁的药物浓度一时间曲线见 一。 . . . . 鲁 器 . 山 . . . ?鲁\?、一时? . ? .. . 吕\? 州??皇?暑?母.【皿 ? .. .... ?? 根据大鼠灌胃给予后的药时曲线,应用梯形法计算其药动学参数见 .版计算其药动学 一。根据大鼠灌胃给予芦丁单体后的药时曲线,用 参数见.。 .. .. 堕垫 . 。 .士. / .士. ./ ;埘: 】【:.;。: ..?..? . ??./ . .。。。/ . 吣??/ . .。 . / . // ///. . ?/ 中槲皮素的代谢 灌胃给予大鼠 /后,大鼠血浆中槲皮素的药物浓度时间曲线见 .;灌胃给予大鼠槲皮素 /后,大鼠血浆中槲皮素的药物浓度一时间曲 线见。 .. 一目\?工?目?一.【山 。州甜工? .. . ?\??州爵山町目?叮【山 .. .. 根据大鼠灌胃给予后的药时曲线,应用梯形法计算其药动学参数见 .版计算其药动 一。根据大鼠灌胃给予槲皮素单体后的药时曲线,用 学参数见.。 .. ? 脚。 .士. 。/ .士. ?./ ;: : . ? ;.: .. 一. ... .‘./ . .。。./ . .。? / . 。 . / . // . /// . ./ 中金丝桃苷的代谢 灌胃给予大鼠 /后,大鼠血浆中金丝桃苷的药物浓度时间曲线 见.;应用梯形法计算其药动学参数见一。 . ? .. .. .. . 眦。/ . . .砌./ ;: : ?. ;。: ..& 中山柰酚的代谢 灌胃给予大鼠 /后,大鼠血浆中山柰酚的药物浓度.时间曲线见 ;应用梯形法计算其药动学参数见. 。 . 一?昌\凹一口臣苫。。 . ? 一.. . ?..。 士 ? 眦。/ 士 ??互 .../: ;: ? . ;.;讨论 质谱检测方法 质谱在电喷雾离子源正离子和负离子工作模式下检测待测化合物的条件以产 生最大分子离子峰的强度。所有化合物在这两种工作模式下均可被离子化。通过比 较相同浓度的各化合物应用高效液相色谱分别与这两种工作模式的质谱联用所得 到的色谱图中对应的色谱峰的信噪比,可以发现对于芦丁、金丝桃苷、槲皮素和山 柰酚这四种化合物来说,用电喷雾离子源在负离子工作模式下得到的信噪比最高, 为了使分析方法达到最灵敏,定量分析这种活性化合物的实验中均采用此工作模.. & 式。扫描方式为多反应监测 方式,定量监测各化合物 离子反应。 内标物的选择 化合物的分子结构决定其理化性质,因此理想的内标化合物首选稳定同位素标 记的分析物,其次是化学结构类似物。本实验选用水飞蓟宾作为内标。水飞蓟宾属 于黄酮类化合物,因此结构上与芦丁、金丝桃苷、槲皮素和山柰酚比较相近, 在本 实验样品处理过程中及离子化趋势方面,水飞蓟宾与芦丁、金丝桃苷、槲皮 素和山 柰酚这四种化合物比较相一致。 服用后,芦丁、金丝桃苷、槲皮素和山柰酚的吸收动力学特点 灌胃给予大鼠 /后,芦丁在大鼠血浆中的峰浓度为. . ,平均血药浓度.时间曲线下面积。,加为. /,达峰时间?姒为. . . ./;金丝桃苷在大鼠血浆中的峰浓度胍为. /,达峰 . 时间。为. ,平均血药浓度.时问曲线下面积?拍为. ./; . ,平 槲皮素在大鼠血浆中的峰浓度为. /,达峰时间。为 均血药浓度.时间曲线下面积扣拍为.士. ./;山柰酚在大鼠血 . ,平均血药浓度时间 浆中的峰浓度脚。为. /,达峰时间觚为 . 曲线下面积?撕为. ./。 单体给药和复方给药后芦丁、槲皮素的药代动力学参数对比 中药复方中各种成分在体内互相作用可以影响药物成分的吸收、分布、代谢、 排泄等过程,进而影响其药效。 从前面的实验结果可知:中其他成分对芦丁与槲皮素的药代动力学行为 有很大的影响。服用芦丁和槲皮素纯品后,芦丁和槲皮素的达峰时间。分别 为 , 和 ;而服用后,芦丁和槲皮素的达峰时间分别为. 。实验结 果表明,中存在的其他成分加快了芦丁在体内的吸收而减慢了槲皮素在体内 的吸收。 由此可见,有效成分组给药时有效成分组中其他成分对此两种物质的吸收有 影 响。..& 参考文献 国家药品监督管理局、国家药品标准.消栓通络胶囊质量标准】.中国药品标 准,,: 高洪燕,刘吉晨.消栓通络片的药理作用【】.中国新医药,,:? 程秀娟,邸林,吴岩,等.消栓通络胶囊药效学研究【】.吉林中医药,,: ?. 杨朋彬,张晓丽.消栓通络胶囊与非诺贝特治疗高脂血症疗效对比观察】.吉 林大 学学报,,:? 贾冬,杜佳林,向绍杰.消栓通络精制胶囊药效学实验研究【.中国中药杂 志,,:?. 陈凤英.消栓通络胶囊对血液流变学影响】.医药论坛杂志,,:?. 洪英杰李有田消栓通络胶囊治疗脑血栓临床疗效观察.吉林中医药,, :?. 张冉,戴瑛,程新锐.消栓通络方有效成分组抗血栓作用及其机制研究【】. 中成 药,,:?. 张冉.消栓通络方活血化瘀的物质基础及作用机制研究.北京:中国医学科学 院/中国协和医科大学, 蔡凤群,张学方.消栓通络丸治疗脑梗塞的临床研究【】.中华临床医药杂志,, :?. , 李志,秦昌国.消栓通络片治疗冠心病例.湖南中医杂志, :一. 仲过生,黄志,方玉玲.消栓通络胶囊对糖尿病患者血清氧化低密度脂蛋白及 血浆 内皮素的干预研究.光明中医,,:?...第二部分 的药物动力学及代谢研究 月 吾 丹参为唇形科鼠尾草属植物丹参 .的十燥根及根筝,是最常 用的中药之一。 自从世纪年代以米,本学者就开始 研究丹参的化学成分?,.期主要研究丹参的脂溶性 二萜醌类化合物,该类化合物主要有:丹参闻日、丹参 酮 、丹参酮 、隐丹参酮。其中最主要的脂溶 性成分为丹参酮 ,其含量大约为约材的.~ .%。从世纪年代不始,丹参化学成分的研究 重点从脂溶性转向水溶性成分,首先报道了原儿茶 醛,但其存丹参中的含鼍很低,约为.~.%【。 年张德成】从丹参中分离得到斗参素,以后义陆续发现十几种水溶性成分,如 原儿茶醛,丹酚酸 、、、、、、、、、,迷迭香酸, 紫草酸,咖啡酸等。 现代药理研究表明,丹参具有保护瓶管内皮细胞,抗,心律失常,抗动脉粥样硬 化,改善微循环,保护心肌,抑制和解除血小板聚集,扩张冠脉、增加冠脉流量, 提高机体而、缺氧能力,抑制胶原纤维的产生和促进纤维蛋白的降解,抗炎,抗脂质 过氧化和清除白山基,以及保护肝细胞,抗肺纤维化等作用。丹参用于治疗心腑血 管疾病,如冠,亡嘶、高压、腑卒中、动脉粥样硬化等,同时还刚于退陛病变, 肝炎,肝硬化、慢性肾功能衰竭等击。目订有很多复方中药制剂,其自.一七十多种 以肘参为主要成分的复方制剂』。泛的应用丁临床上’。丹参的水溶性成分连脂浴 性成分共同发挥多种药理活性,如抗氧化,抗炎和白山基清除作用【一一。 酚酸类是丹参水溶性成分的主要组成部分,包括 、丹酚 酸、迷迭香酸和其它酚酸类【川。众所周知,酚酸类呈现强的抗氧化作用。丹参 叶对丹酚酸的药理研究进行的比较多,特别是丹酚酸在心腩损伤中的保护作用 】。’于丹酚酸,的药理作用研究明显滞后。主要原冈为丹酚酸在丹参 中的含量非常低,而上合成起来片常网难,这两个原冈增加了获得大量单体化合物 的难度。直到合成:艺得到解决。研究者开始.表示出了极大的关注,不 论在动物模型还是细胞模型,都呈现出了有益的药理作用,如对,实验性心忆 损伤的保护作用【】,大鼠阿霉素心脏毒性的保护作用,实验性肝损伤以及肝纤维..化的保护作用【。】。最近,本实验室发现可以降低血糖,改善糖代谢紊乱,降 低糖基化终术产物的水平,降低糖尿病大鼠的氧化应激状态。而且,可降低糖 尿病大鼠血液中血管假性血友病因子和肌酐水平,改善未梢循环及外周神经病变。 所有这些资料表明对糖尿病和糖尿病血管并发症具有一定的保护作用。然而, 相对于对药理作用的研究,其药动学研究就显得尤为滞后。据我所知,只有一 篇关于大鼠尾静脉注射丹参注射液后的药物代谢动力学特征【。因此在的 药物代谢动力学特征充分研究清楚之前,非常有必要开展更多的关于这方面的研 究。 为了帮助人们了解在体内的药物代谢动力学特征,需要建立一种有效的分 析方法用于体内药物浓度的定量分析。尽管很多分析技术用于植物药材中成分 的研究,但是仅有一个分析方法用于生物样品中含量的测定。而且,由于现有 的这一个分析方法存在着检测灵敏度低、选择性不强以及分析效率不高等缺点,限 制了它在复杂生物样品定量分析中的应用。在本文中,采用了氯霉素作为内标,首 次建立了一种快速、灵敏的测定生物样品中的./分析方法,对方法的 可靠性进行了全面的考查和验证,并应用于大鼠体内的药动学研究。 第一节在大鼠体内的吸收动力学研究 材料与方法 药品与试剂 纯度为% 北京科莱博医药开发有限责任公司 氯霉素内标物,纯度为%中国药品生物制品检定所 维生素 公司 甲酸色谱纯 公司 公司 乙腈色谱纯 北京化学试剂公司 二氯甲烷分析纯 北京化学试剂公司 氯仿分析纯 北京化学试剂公司 乙醚分析纯 北京化学试剂公司 盐酸分析纯 北京化学试剂公司 乙酸乙酯分析纯 以上所有溶剂均经抽滤、超声脱气处理津腾公司滤膜:水相,. ;有机 相,. ..仪器与设备 美国公司 高效液相色谱与美国应用生物系统公司 型三重四极杆质谱仪联用。质谱配有离子源以 ..数据处理系统。 及 . 氮气吹干仪 漩涡振荡器 北方同正 高速台式离心机 贝克曼公司 微量振荡器 江苏海门其林贝尔仪器公司 玻璃毛细管 华西医科大学仪器厂.电子天平 公司 微量移液器 公司 实验动物 大鼠,雄性,体重 ,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,许可证 ?,相对湿 编号:京.。自由摄食饮水,饲养环境温度控制在 度.%,通风干燥、安静, 光照周期。 给药方案与样品采集 灌胃给药健康大鼠只,雄性,体重 ,自由饮 。给药前禁食 水。灌胃给予,给药剂量为 ,于给药前及给药后., /,给药体积为 .,.,.,.,,.,.,,,, , 经眼球后静脉丛取血约. 置于预先准备的含有肝素的离心管中,离一 曲,制备血浆,并按 “分装成三份,于一保存直至分析。 静脉给药健康大鼠只,雄性,体重 ,自由饮 。给药前禁食 水。尾静脉给予,给药剂量为 ,于给药前及给药后 /,给药体积为 .,.,.,.,.,,.,.,,,, 经眼球后静脉丛取血 约. ,置于预先准备含有肝素的离心管中,离心 曲,制备血浆, 并按“分装成三份,于一保存直至分析。 大鼠血浆中的./定量分析方法的建立 .色谱与质谱条件 ..& 色谱条件 . ×. .., 色谱柱: ; .% . 流动相:/:,/, / 流速:. 进样量:“ 质谱条件:负离子检测 :/? :/ 离子源相关的参数:。 一. 化合物相关参数: 一 一一.在选择电喷雾离子化检测条件时,分别采用进行『、负离子模式对直接 导入离子源的标准化合物进行一级全扫描的比较,和在负离子方式下表现出 更明显的信号响应优势,而且在一级全扫描图谱中,基峰均为质子化的准分 子离子 峰.】‘。选择.】。作为母离子,分别对其进行得到各自的二级全扫描图谱 ?,的主要碎片峰为/ ,币,其中/ 的离子信号最强且 较稳定,可选定作为中的离子,类似条件下的碎片信息相对简单,主要 .【】。因此采用/ 和/ 碎片峰为/,离子的断裂行为见 ?的离子特征反应分别对和进行了质谱条件的优化仪器参数见 上,进一步提高检测的灵敏度与专一性。.. & ?? 虚:伽巧巧 舀 帅蛭巧 , ,? .。. .? 们锄 咖 ? 竺 ‘, ?巧 黝。 ? : 巧 州/ ? 诈卤 “ ’’。一..。.一? 幺/ . . 流动相中加入甲酸,可以抑带酸性化合物的电离而使其处于游离状态, 从而可以提高色谱峰的峰形和对称性。但是,过多甲酸的加入则会抑制化合 物的离 子化。因此,评估了流动相中不同浓度的甲酸对化合物离子化的影响。发现 流动相 中甲酸浓度越高,峰形和对称性越好。这就是所谓的液相一电解质效应? 。当流动相中的甲酸浓度超过.%,就可严重地抑制化合物的离子化。相对 于无甲酸的流动相,%。浓度的甲酸可以降氐的信号强度达到%。为了获得较 高的灵敏度,选用流动相中甲酸的浓度为.%。之后,本研究发现了一个有趣的现 象,复溶液的值能够影响色谱峰的峰形。复溶液中甲酸浓度越高,即值越小, 待测物的峰形以及对称性越好。因为进入色谱柱后,只有在非常酸的环境中它 才可以保留的更好,随后,它会在一个适合的环境中流出,这个值对在 质谱中的离子化效率并没有太大的影响。随着复溶液中甲酸的浓度加大为%, ,再加大甲酸的浓度,并不能进一 的峰形以及对称性就变得非常的好。见..步地提高峰形和对称性。基于这样的结果,本实验采用复溶液中甲酸的浓度为%, 而流动相中仅用痕量的甲酸,浓度为.%。 .//%,/. .% :/:,/, . . 标准溶液及内标溶液的配制 . 溶液的配制精确称取 ,用甲醇配成浓度为 /的储备液。 精密吸取该储备液适量,配制浓度为?‖的中间液,存储于.冰箱中备用。 内标溶液的配制精确称取作为内标的氯霉素. ,用甲醇配成浓度为 ‖的储备液。吸取该储备液适量,配制成浓度为“‖的内标液,存储于一。 冰箱中备用。 .血浆样品预处理 测定前将血浆样品解冻,取 /的溶液,再加入 ,加入肛浓度为 的溶液,混合均匀后加入 “内标甲醇溶液氯霉素, /和 “乙酸乙酯,振摇 ,离心 ,取上清液 转入另 一干净的试管中,下氮气吹干,残留物用 /:,/, ,离心 %溶解,涡旋振荡 ,吸取上清?用 于./分析,进样量为“。..汀 .分析方法的确证 分析方法的选择性取大鼠空白血浆 ,按“.血浆样品预处理项下方 法操作,获得空白样品质谱图,见 .,将一定浓度的标准液加入 空白血浆中,依法操作,获得相应的质谱图,见 .。其中和的 保留时间分别为.和. ;取大鼠给药后的血浆,依法操作,得相应的质谱图, 见 。实验结果表明,血浆中内源性物质不干扰和的测定。 . . ? ? 乎 州 【 。 空 ? 差洲 【.//?./ ; ;.. 标准曲线制备取大鼠空白血浆“,加入浓度为肛/的 ,得 到浓度为 /的大鼠血浆样品。用大鼠空白血浆依次稀释样品,得到相 当于大鼠血浆药物浓度为,,,,.,.,和. /。按“.血浆样品 预处理”项下方法操作,建立标准曲线。以待测物浓度为横坐标,待测物与内 标物 /进行回归运算, 的峰面积比值为纵坐标,用加权最.乘法 求得的直线回归方程即为标准曲线。典型的大鼠血浆样品标准曲线为. .,.。线性范围为.. /,定量下限为. /。 样品稳定性取大鼠空白血浆 ,按“标准曲线制备”项下方法分别配制 大鼠血浆低、中两个浓度分别为., /的质量控制样品,血浆 样品室温放置 后,测定样品浓度,以考察样品在室温约。条件下的稳定性。..每一浓度进行 样本分析。个浓度下血浆样品中的相对标准偏差均在规定范 。 围之内,表明血浆样品在室温下至少可稳定存放 同法配制低、中个浓度的质量控制样品,经液.液提取处理后,室温约 下放置 测定,以考察血浆样品经提取处理后的稳定性。每一浓度进 行样本分析。个浓度下血浆样品中的相对标准偏差均在规定范围之内,表 。 明血浆样品经提取处理后可稳定存放 配制低、中个浓度的质量控制样品,经反复次.冷冻,室温溶解 后,测定样品浓度,以考察样品在冷冻和冻融条件下的稳定性。每一浓度进行 样 本分析。个浓度下血浆样品中的相对标准偏差均在规定范围之内,表明血浆 样品在冷冻.融溶循环三次实验中无明显降解,基本稳定。 .,表明储备 同时考察储备液在.存放天,结果见 液基本稳定。 ?. 士 ? 坠曼璺 璺:璺量堡.士. . . / ? . 。 . . . . 士./ 士. 士.士. 一。兰 鱼 口 , 一。 ? ; ’ /, ×; . 。,/× .. & 方法的准确度与精密度按“标准曲线制备’’项下方法分别配制大鼠血 , 浆低、中、高三个浓度分别为., /的质量控制样品,每一浓 度样品进行样本分析,连续测定天,并与标准曲线同时进行。根据当同标准曲 线计算样品的浓度,与配制浓度对照,将样品的结果进行分析;求得本测 。结果表明,在三个不同浓度的血浆样 定方法的精密度与准确度,结果见 品中,测得的准确度和精密度分别在. %和.%之间,测定血浆中的分 析方法符合有关国际规范的要求【”。. . / 璺芝竺 皇堂堂 丛塑 墨望 里: 垒 ,.. . .. . . . . . . .. . . ... ... . . .. ,/× . ,% .. 提取回收率取大鼠空白血浆山,按“标准曲线制备”项下方法分别配制 大鼠血浆个不同浓度分别为.,.,.,,,, /的血 浆样品,按“血浆样品预处理”项下操作,每个浓度平行份样品进行分析,每 份 样品的回收率按其经提取后 样品的色谱峰面积与相应的空白血浆提取 物的添加样品样品所得色谱峰面积之比来计算。在排除血浆基质效应的情况 下,在很大浓度范围的样品中的回收率都较一致,处在.?.%的范围内, 而且每个浓度下的相对标准偏差都小于%。对每份样品中的同一浓度下的进 行 同样分析,回收率为.%% .,与的回收率接近。 .% /. . ..% . . ..% . . ..% . ..%. ..% . ..% . ..% . ..% 基质效应为了全面的研究和考察血浆中的基质效应与被分析物浓度的关系 以及不同血浆中的基质差异对相同分析物浓度测定的影响,采用不同个体来 源的大 鼠空白血浆的提取基质配制了一系列浓度的样品,并与之相对应 ,结果 的是不含相关基质.的纯标准样品样品同时进行分析比较【 见.。在样品中,//对所有样品中的和测定的 样 值都在...%的较小范围内,显示出了很好的分析重复性。相同浓度的 品的色谱峰面积均比 样品中的小,面积比值在的三个浓度样品中介于 .%。在中为%,表明在当前的样品提取方法、色谱分离条件和质谱检测 条件下,血浆样品分析存在着一定程度的“绝对”基质效应【?,血浆基质效应引起 样品所得的面积 了.%的离子化抑制,但在不同浓度下基质效应大体一致。.. & 的...%在不同浓度下均略大于 样品中的对应值,尽管这一差值并 不大,但却反映了同一浓度分析物在不同来源的样品之间可因基质改变而引起离子 化效率的差异,即“相对’’或“差异”基质效应的存在【。。除了最低浓度点外, 相对基质效应并没有明显的浓度依赖性。使用内标进行校下后的面积,值介于 .?.%之间,并没有明显的改善作用 .。但由于基质效应对于被分析物 的影响很小,可以忽略不计。 .总结了提取回收率、基质效应的分析结果,并结合,和样品的 样品的分析 结果进一步揭示出样品从提取到检测过程中的影响因素。如果认为 误差是由仪器参数引起, 还主要考虑了样品基质的影响,那么 样品的结果 除了这两者外则还加入了提取过程的因素。因此,测定值在 样品中的变异更 大...%。从 至 的变化文献上称为过程效率【,由于基质抑制效应 样品测定结果同样采用内标面积标准化 的存在,过程效率低于提取回收率。对 处理,发现变异程度几乎在各不同浓度水平都有一定程度的降低,变化范围 .,最低浓度的测定也符合生物样品定量分析中有关验证规 ...%之间 范的要求,说明的加入虽不能有效地消除基质效应的存在,但可以在一定程 度上 克服分析物可能在提取过程出现的变化。 . . 士 / . . .% . .% % .士. .%. .% . .% %.士. .% % .士. .%.% .%.% .% %