链霉菌Streptomyces sp NJWGY3665制备多肽类抗生素安来霉素的研究（可编辑）

链霉菌Streptomyces sp NJWGY3665制备多肽类抗生素安来霉素的研究（可编辑） 链霉菌Streptomyces sp NJWGY3665制备多肽类抗生素 安来霉素的研究 . ? :. .南京工业大学学位独创性声明及使用授权的 声明 一、学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不 包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得南京工业大学或 其 它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所 做 的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 日 研究生签名: 期: .型二‘五, 丑一左 研究生硌盈坦:目 二、关于学位论文使用授权的声明 南京工业大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆、中国学术期刊光 盘版电子杂志社及清华同方光盘股份有限公司有权保留本人所送交学位论文 的复印件和电子文档,可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电 子文档的和纸质论文的内容相一致。允许论文被查阅和借阅,可以公布包 括刊登论文的全部或部分内容。论文的公布包括刊登授权南京工业大学 研究生部办理。 期:硅/?.鲨 研魁虢煎址导,箍名:蜱日博士学位论文 摘要 安来霉素是一种广谱、高效、安全的新型饲料添加剂,又名恩来霉素、恩霉 素、恩拉霉素、持久霉素,世纪年代由日本武田药品工业株式会社研发, 是一种多肽类抗生素。安来霉素在需氧和厌氧条件下对主要的革兰氏阳性菌具有 强大杀菌作用,在肠道内不被降解,无残留,无耐药性。作为一种动物专用抗生 素,安来霉素既可以满足人们对农产品安全性的要求,又可显著降低农产品加工 过程中的生产成本。因此,专家预测,安来霉素还会在一段相当长的时间内充当 促生长剂的主角。然而,目前关于安来霉素生产方面的研究仅日本和美国有相关 文献发表,中国却鲜有报道,国内对于安来霉素的研究还仅限于应用情况的调查 及综述。国内,安来霉素的生产还处于相对空白的阶段,其市场基本被美国先灵 葆雅动物保健公司垄断。因此,对安来霉素发酵过程的研究对于打破国外对该产 品的垄断具有重要的意义。 笔者从土壤中筛选得到的一株具有自主知识产权的安来霉素产生菌,通过分 子生物学方法对筛选获得的菌株进行了 序列鉴定,确定该菌株的 的同源性最高,最高同源性为 序列与链霉菌 %,将其命名为 .,并对其生理生化性质进行了研 究。 本文应用注入技术对 .进行了诱变选育,在确 定最佳注入剂量后,经过两轮离子注入,选育出株具有良好遗传稳定性的高产 突变株,安来霉素的发酵含量达到 /,较原始出发菌株提高了%。 ,摇 通过单因素试验优化得到的菌种最佳生长条件:培养温度?, 床转速 /; .最适生长培养基质量分数: .%、酵母粉%、葡萄糖%、淀粉%。根据安来霉素生物合成代谢 途径中的氨基酸组成情况,分别考察不同种类氨基酸对链霉菌 . 生长的影响,最终确定在培养基中添加.%的半胱氨酸对安来霉 素的生产起到明显的促进作用。安来霉素产生菌在优化后的培养条件下,效 价达 到 /以上,超过目前文献报道的最高值. /,达到了世界领先水平。 发酵罐实验, 在摇瓶发酵基础上,对 .进行了 通过测定生物量、葡萄糖含量,研究 .的分批发酵动 摘要 力学。结果表明菌体的生长、还原糖消耗和产物的合成过程基本符合微生物 次级 生物代谢产物的合成规律。在此基础上基于方程和.方程 建立相关模型,对最大比生长速率‖、安来霉素比生成速率。、维持系数 、细胞的生长得率系数等模型参数进行估算,该模型计算值与实验 数据拟合良好,基本反映了安来霉素产生菌分批发酵过程的动力学特征,该 模型 的建立为安来霉素发酵过程的和优化提供了相关数据。 首次将超声波提取法应用于安来霉素的提取,相比单纯的溶剂提取方法,笔 者使用的方法能够有效缩短提取时间,降低成本。对超声时间、提取时间、甲醇 浓度、料液比、、萃取次数等因素进行了单因素试验及正交试验,确定了提 取的最佳工艺条件。安来霉素粗品经大孔树脂纯化,可得高纯度的安来霉素, 用高效液相色谱检测其相对含量,可达%以上。目前只有本文的研究可以将安 来霉素、分开,并获得高纯度达的安来霉素。 由于链霉菌枝节繁冗,常通过测量链霉菌干重,按经验值判断菌体生长状况, 存在前期分析工作量大、检测周期较长、效率低下的问。为了有效解决这些问 题,首次将图像采集与处理系统应用于链霉菌的生产过程中,完成了基于达芬奇 技术的链霉菌图像采集与处理系统的硬件搭建工作与基于水平集的链霉菌图像 处理系统的软件部分的构建,实现安来霉素产生菌图像采集。通过预处理,水平 集分割算法以及菌体面积测算功能、分析安来霉素产生菌生长情况、实现发酵过 程检测与监控,从而为进一步优化菌类生长条件,为提高目标产物率奠定基础。 构建安来霉素的高效液相色谱和生物法定性定量检测体系,安来霉素在. / /的浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系.,采用生 物定量检测时,标准曲线的工作范围为.× /~.× ./,安来霉 素的最低检出限为. /。 关键词:安来霉素;含量提高;正交试验;多阶段发酵;纯化;;微生物法。博士 学位论文 , . ,, . .,, .?. ,’ ... , , ., . , . ?, .., . , ., .: , :。 , ? 。 ,/.., .%,% ,% %。, ...% , .. / /,., , ; ,, . ? , . . % ,, . .. , , ./ ., %., , .... .. /.× /; /; %., 博士学位论文 . ,, . ,. :; ; ; ;;; 博士学位论文 目 录 摘要??.??. 第一章文献综述 .抗生素的种类和结构?. .多肽类抗生素的研究进展??. ..多肽类抗生素的分类 ..多肽抗生素的生物学活性? ..多肽抗生素的合成? ..多肽抗生素的发展前景.饲用抗生素的应用于发展??.. ..饲用抗生素的应用? .饲用抗生素的促生长机制研究..饲用抗生素的应用前景.多肽类抗生素安 来霉素??.. .. 安来霉素理化性质 ,.安来霉素作为抗生素饲料添加剂的优点 ..安来霉素的生物合成..安来霉素的发酵研究.产抗生素微生物育种? ..诱变在产抗生素微生物育种中的应用?. ..诱变育种的方法?. .抗生素的分离纯化研究 ,.抗生素的提取??. ..抗生素的精制??。 .研究目的目录 第二章 安来霉素产生菌的筛选、鉴定、系统发育分析?.. .前言?一 .材料与方法..含菌土壤的采集与保藏?. ..筛选方法? ..培养基??. ..富集培养?.. ..种子培养条件??。 ..发酵培养条件??. ..形态观察?. ..生理生化特性??. .. 的扩增和序列分析??.. . 系统发育分析.结果与讨论?一 ..抗菌活性菌株的初筛测定结果?.. ..抗菌活性菌株的复筛测定结果?.. ..菌株的培养特征及生理生化鉴定.. ..菌株的分子生物学鉴定?. .小结第三章盯低能离子注入安来霉素产生菌的诱变选育??.. .前言?.. .材料与方法?.. ..菌种. ..培养基??. ..离子注入工艺与样品处理. ..筛选方法?. ..存活率的计算??. ..突变率的计算??.博士学位论文 .结果与讨论?.. .. 注入对菌株存活率的影响??. .. 注入对菌株突变率的影响??. .. 注入诱变筛选高产菌株 ..高产菌株遗传稳定性试验. .小结第四章 高密度培养及分批发酵动力学研究.. .前言.材料与方法..菌种. ..试剂?一 ..设备.. ..培养基??.. ..发酵条件?.. ..测定方法?. .的发酵培养基优化..链霉菌 ..氨基酸等小分子活性物质对发酵过程的影响?. ..发酵条件的优化?. ..安来霉素分批发酵动力学研究? .结果与讨论?.. ..碳源对安来霉素生成量的影响?. ..氮源对安来霉素生成量的影响?. ..无机盐对安来霉素生成量的影响. ..培养基组成的优化. ..氨基酸等小分子活性物质对发酵的影响. ..最适起始值的确定?.. ..最适培养温度的确定??. .最适转速的确定?.目录 ..最适接种量的确定. ..发酵条件的优化? ..安来霉素分批发酵动力学研究? ..链霉菌 .的小试发酵结果??.. .小结?.. 第五章安来霉素超声辅助提取研究.. ..前言?. .材料与方法?.. ..材料. ..提取步骤?. ..提取工艺优化??. ..安来霉素的纯化工艺??. ..检测方法?. .结果与讨论?.. ..超声提取法的优势. ..提取溶剂的确定?. ..超声功率的确定?. ..提取时间的确定?. ..提取剂浓度的确定.. ..提取溶剂体积的确定??. ..不同对提取效果的影响 ..提取次数的确定?. ..正交试验?. ..验证试验? .. 安来霉素纯化.小结??. 第六章 图像采集与处理系统的开发及检测方法的建立?.. .前言?..博士学位论文 .试验材料与方法??.. ..试验试剂?.. ..试验设备?一 ..菌种. ..硬件平台??. ..软件算法实现??. .. 法? ..微生物检测试验方法??. .结果与讨论?一 ..图像采集与处理系统的开发??.. .. 法? ..微生物检测法??. .小结..图像采集系统??. ..检测方法的建立?. 第七章结论与展望?.. 参考文献.. 致谢??.博士学位论文 第一章文献综述 .抗生素的种类和结构 抗生素是由微生物包括细菌、真菌、放线菌属或高等动植 物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其他活性的一类次级代谢产物,能 干扰 其他生活细胞发育功能的化学物质,其主要用途是抑制其它种类微生物的生 长或 将其杀死,而一般情况下对其宿主不会产生严重的副作用。目前临床常用的 抗生 素有微生物代谢产物以及用化学方法合成或半合成的化合物。目前已知天然抗生 素不下万种。 抗生素主要用于对抗人或动物体内的致病菌等病原体,可治疗大多数细菌、 立克次氏体、支原体、衣原体、螺旋体等微生物感染导致的疾病;但对于结构更 简单的病原体如病毒、朊病毒等所引起的传染病则几乎没有任何疗效。除了 抗细菌性的感染外,某些抗生素还具有抗肿瘤活性;有些抗生素还具有免疫抑制 作用。抗生素不仅用于医疗,还应用于生物科学研究、农业、畜牧业和食品工业 等方面。在畜牧业和农业中非治疗用途的抗生素,称为生长促进剂。目前,随着 生产技术水平也不断提高,全世界的抗生素产量逐年增加,全球发现的抗生素己 有】万多种,其中实现工业化生产的有多种。 抗生素主要有以下几个主要类别: 伊内酰胺类抗生素. 侈.内酰胺类抗生素是一种种类很广的抗生素,其中包括青霉素及其衍生物、 头孢菌素、单酰胺环类、碳青霉烯和青霉烯类酶抑制剂等。基本上所有在其分子 结构中包括‖.内酰胺核的抗生素均属于‖.内酰胺类抗生素。它是现有的抗 生素 中使用最广泛的一类。‖.内酰胺类抗生素被用来进行预防和治疗受此类抗生素打 击的细菌的感染力。过去声.内酰胺类抗生素只被用来对付革兰氏阳性菌,但是通 过发展,可以对付不同的革兰氏阴性菌的广谱伊内酰胺类抗生素提高了其作用范 围。 氨基糖苷类抗生素 氨基糖苷类抗生素是一类分子中含有一个环己酸型的配基、以糖苷键与氨基 糖相连有的与中性搪相结合的化合物?,在临床主要用于对革兰氏阴性菌、绿 脓杆菌等感染的治疗。于世纪年代曾经非常广泛地使用,但是由于此 第一章文献综述 类药物常有比较严重的耳毒性和肾毒性,使其应用受到一定限制,正在逐渐淡出 一线用药的行列。 大环内酯类抗生素 大环内酯,或称巨环内酯,是一组其作用在于结构内的“大环”的药物一般都 是抗生素,这个大环亦即是一连结一个或多个脱氧糖多是红霉糖及去氧糖胺 的内酯环。内酯环可以是由、或个单元组成。大环内酯属于天然产物中 的多烯酮类。大环内酯用于治疗诸如呼吸道感染及软组织感染之类的细菌感染, 其抗菌范围较青霉素稍大,因此大环内酯可代替青霉素用于对后者过敏的病者身 上。 四环素类抗生素 四环素类抗生素因其氢化并四苯母核而得名。本类药物抗菌谱广,对革兰氏 阴性菌、革兰氏阳性菌、螺旋体、衣原体、立克次氏体、支原体、放线菌和阿米 巴原虫都有较强的作用。但近年来,其应用受到耐药的影响。 葸环类抗生素 蒽环类抗生素是具有,,,.四氢.,.丁省醌,,,.., 一 或叫葸环酮为配基于或一位与一种或多种不同糖相连 的糖苷类化合物。至今已报道的葸环类化合物已在种以上哆 放线菌素类抗生素 放线菌素分子中含有肽链及附型结构的发色夏。天然产生的放线菌素 有很强的细胞毒作用,因此人们一直在们对其进行结构,希望获得较理想的衍生 物。 多烯大环内酯类抗生素 多烯大环内酯类抗生素是具有大环内酯的一类抗生素,多为碱性亲脂性化合 物。对革兰氏阳性菌及支原体抑制活性较高。大环内酯基团和糖衍生物以苷键相 连形成的大分子抗生素。由链霉菌产生的一类弱碱性抗生素。从年被报道 以来,发现并通过结构鉴定的已有三十多个。 安莎霉素类抗生素 安莎霉素以一个脂肪链连接着一个芳香核的两个不相邻的位置 构成典型的提桶柄形状。与其他临床应用的抗生素比较,其研究开发的历史 并不博士学位论文 长。但因其显著的生物学活性,目前这类抗生素得到越来越多的重视。 多醚类抗生素 多醚类抗生素的分子里含有众多的环状醚键。在它们的分子里具有直链的碳 的主骨架,插入含氧的杂环。在分子的一端带有一个游离的核基、.甲基、. 乙基。一系列的含氧的官能团包括醚基、羧基、羟基和羰基,以及存在有半 缩醛和半缩酮。莫能菌素就是一个饱和的多醚类抗生素,它在畜牧 业和农业上获得了重要的用途。 多肽类抗生素 具有多肽结构特征的一类抗生素。一般 多肽类抗生素 具有抗细菌或抗真菌的作用,此外有些多肽类看守所还对原虫、病毒及癌细 胞有 一定的抵抗作用。 .多肽类抗生素的研究进展 多肽抗生素是指相对分子质量通常在×以下,具有抗菌活性的多肽类 物质。人们一开始将这类具有抗菌活性的多肽称为“ ”抗细 菌肽。后来经过研究发现有些“抗细菌肽”同时还具有抗真菌等其它微生物的功 能。随着研究的进一步深入,研究人员发现这类多肽还具有抗寄生虫、病毒、癌 ”多肽抗生素。多肽类 细胞等功能,最终研究者将其命名为“ 抗生素具有分子质量小、热稳定性好、微量、抗菌谱广甚至抗病毒及抗肿瘤的特 点,更重要的是大多多肽类抗生素对正常真核细胞无毒性或毒性很低,因而对多 肽类抗生素的研究对于克服日益严重的抗生素耐药问题、开发新型抗病毒及抗肿 瘤药物有着重要的意义。 ..多肽类抗生素的分类 按照化学机构的不同,多肽类抗生素可分为以下类: 具有螺旋结构的线性多肽 年,等【从美国天蚕蛹中分离得到一种多肽类抗生素, 这种多肽抗生素含有个氨基酸残基,不含半胱氨酸,其端能形成近乎 完美的双亲螺旋结构,具有强碱性,而端则可形成疏水螺旋,两者之间有甘 氨酸和脯氨酸形成的铰链区,多数多肽的端被酰胺化,酰胺化对其抗菌活性第一章文献综述 具有重要作用。此后,人们相继从家蚕、柞蚕、果蝇、麻蝇等动物中分离到 这类 ,这证明了 多肽抗生素。年,等人从猪小肠中分离到了 类多肽类抗生素可能在动物中广泛存在。对革兰阳性菌、阴 性菌都具有很强的杀伤力,而对真菌和真核细胞没有毒性。目前己被 人工合成并己商品化。 也是早期发现的的一类具有双亲螺旋结构的多肽抗生素。人们最 开始是在蟾蜍的皮肤中分离得到的【】,后来随着研究的深入,在哺乳动物的 神经 及组织中也发现了其类似物。对革兰阴性菌、阳性菌、真菌、原生动 物都有杀伤作用,但其对革兰阴性茵的活性比要低很多。 富含某种氨基酸的线性多肽 这种多肽类抗生素其分子结构为延伸的螺旋结构,不含半胱氨酸,同时富含 某一种氨基酸残基,常见的残基有:脯氨酸,精氨酸,色氨酸等。 ,其分子 人们从蜜蜂中分离得到一种富含脯氨酸的多肽抗生素 中含有个氨基酸残基,其中脯氨酸含量高达%,精氨酸含量达%。 其一级结构中具有和的典型。对某些特定革兰阴性菌 具有很强的活性,同时,对某些革兰阴性的植物病原菌和肠杆菌科的致病菌 的高 杀伤力。正因如此,在植物抗细菌病基因工程和食品工业中有着良好 的应用前景。 是来源于果蝇的一种富含脯氨酸的多肽抗生素】,其结构与 有一定的相似性。但是,在其位的苏氨酸羟基上存在一个一二糖 链:.乙酰半乳糖胺半乳糖。 是等人从人的腮腺和下颌腺分泌物中分离得到了~组 含有大量组氨酸的多肽抗生素,其长度在~个氨基酸残基不等。对 引起口腔感染的多种微生物具有活性。 是来源于牛中性粒细胞的多肽抗生素,因其结构中个氨基酸 中包含了个色氨酸而得名。对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都具有很 强的杀菌活性。 含有一个二硫键的多肽 第个被发现的含一个二硫键的多肽是,它来自来源于牛中性粒细博士学位论 文 胞【。它的个氨基酸中含有个精氨酸。第和第位的氨基酸残基 间形成二硫键。研究发现对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都有活性。含 ~个二硫键的多肽抗生素非常少见,但是这类抗生素均具有很强的抗菌活性。 含有两个或两个以上二硫键的多肽 是这一类多肽的典型代表,最初人们在哺乳动物的组织中发现了 .。这类抗生素一般含有个氨基酸残基,结构中个保守的 半胱氨酸形成了个分子内二硫键。此外,其第、第位的精氨酸,第位 的甘氨酸也是保守的。仅.能够形成层的片层结构,这个片层结构通 过个二硫键以及.与.之间的盐桥来稳定。目前,已被人 工合成并实现了商品化。可以再较低离子的强度下起作用,但其活性 较弱,对多种细菌及真菌都具有显著的杀伤作用,其对革兰 阳性菌的活性比革兰阴性菌强。但对真核细胞具有一定的毒性。 ‖.含有个氨基酸残基,其结构中含有个二硫键和一个 精氨酸。 源自昆虫的其末端与。.相似,但是只有两个片层结 构,并通过一段螺旋来稳定结构。这类多肽类抗生素主要对革兰阳性菌起作 用, 而对真菌没有作用。 源自植物的一般含有~个氨基酸残基,能够形成个二硫键、 个片层结构以及一个【螺旋结构。这类抗生素只对真菌起作用而对细菌不起 作用。不同植物对有不同的抗真菌谱。 是一类来源于植物的多肽抗生素,含有个氨基酸残基,其 中有.一个半胱氨酸,可以形成一个二硫键。其二级结构中有个反平行的 螺旋结构及个反平行的片层结构。能够抑制多种植物致病细菌和 真菌,但对假单孢菌属和欧文氏菌属的细菌没有作用。 羊毛硫抗生素 羊毛硫抗生素是指一类由细菌产生的,通过基因编码,在核糖体 中合成,经翻译后加工形成的含有一些特殊有机基团的多肽抗生素。目前, 研究 最广泛的羊毛硫抗生素是。它来源于乳酸菌,其成熟多肽是由个氨基酸组 成的,结构中含有羊毛硫氨酸、甲基羊毛硫氨酸等特殊基团。主要对革兰阳 第一章文献综述 性菌起作用。目前,已被广泛应用作食品保鲜剂【】,及其类似物在医药 上的应用研究也是人们研究的热点。 ..多肽抗生素的生物学活性 多肽抗生素对细菌的杀伤作用 大部分的多肽抗生素都具有抗细菌的作用。目前研究者们认为,多数可形成 双亲螺旋结构的多肽抗生素,如:、、等,在细菌 的细胞膜上形成离子通道,引起细菌胞内物质的外漏,从而达到杀死细菌的 目的。 研究人员通过对的研究发现,当在脂质体中存在胆固醇时, 对其的裂解作用减弱。这解释了为何这类多肽对真核细胞不起作用 【。而类多肽抗生素对细菌的作用机制可能是通过与膜上的手性分子 相互作用进而杀死细菌,而非裂解机制。 多肽抗生素对真菌的杀伤作用 许多多肽抗生素除了具有抗细菌的活性外,同时还具有抗真菌的作用。 等?】通过研究衍生物,发现其末端【螺旋区域的个氨 基酸顺序与抗真菌活力有关。不同来源的多肽类抗生素对不同的真菌的抗性 也不 同。如来源于蛙类的及和哺乳动物的对一些人类致 病真菌具有杀伤作用。而一些来源于植物的多肽抗生素,如植物、 等对多种植物致病真菌具有杀伤作用。 多肽抗生素对原虫的作用 某些多肽抗生素能够有效地杀灭寄生于人类或动物的寄生虫。如的 类似物可以杀死疟原虫:一种和的杂合肽能够杀死莱 什曼鞭毛虫。 多肽抗生素对病毒的作用 目前的研究发现,多肽抗生素存在种不同的机制,能够对病毒起到抵抗作 用。第一种是多肽抗生素直接与病毒相结合发挥作用。如瑾., .等就通过这样的方式对疱疹病毒的作用;第二种是多肽类抗生素能够 抑制病毒的繁殖。第三种机制是,多肽类抗生素通过模仿病毒的侵染过程,干扰 病毒从而起到作用。如及其类似物的结构与烟草花叶病毒核衣壳与 相互作用的区域具有相似性,这样及其类似物就能够干扰病毒的博士学位论文 组装而对病毒产生作用。 多肽抗生素对癌细胞的作用 研究发现,肿瘤细胞相对于正常细胞相对多肽抗生素更敏感,但是对引起这 种差别的原因目前还不不能完全解释清楚,研究者们初步认为造成这一现象的可 能有以下几个因素【】:?由于肿瘤细胞的高代谢引起细胞膜电位的改变;?肿 瘤细胞膜外表面含有更高的酸性磷脂;?肿瘤细胞的细胞骨架或胞外基质的变 化。研究者已经发现与其类似物,与其类似物, ?及的杂合肽及其类似物都对肿瘤细胞具 有选择性杀伤作用。 ..多肽抗生素的合成 化学合成法 为了能够进一步了解研究多肽抗生素的作用机制,人们通过通过固相合成的 方法获得了很多天然多肽抗生素及其类似物。目前,研究最为广泛的是带正电荷 的具有双亲螺旋结构的多肽。为了研究多肽抗生素一级结构的保守性,人们改变 或增删多肽某些位置的氨基酸。在研究双亲螺旋结构的多肽抗生素与细菌细胞膜 的相互作用的关系时,发现利用.型氨基酸合成天然多肽的对映体,这种对映 体与天然多肽具有相同的生物活性。这一现象更证明了双亲螺旋结构在该类多肽 的生物活性中具有重要作用。为了筛选抗菌活性更高及抗菌谱更广的多肽抗生 素,研究人员合成了一系列的杂合肽。目前的研究重点在于寻找更短的具有抗菌 活性的小肽。利用化学合成法能够轻易地改变多肽的一级结构,通过加入特殊氨 基酸对多肽进行修饰,然而化学合成法面临的最大困难在于成本太高,这阻碍了 化学合成法的进一步发展。 基因工程合成法 利用基因工程的方法生产多肽抗生素是降低生产成本的一条有效途径。但是 多肽抗生素对原核细胞的毒性在一定程度上限制了其在原核表达系统中的应用。 而真核表达系统的较低表达效率也是其工业化生产的一个障碍。为了克服多肽抗 生素对细菌细胞的毒性,人们采用融合表达或选择对多肽抗生素具有抗性的株系 进行原核表达。最早于年在大肠杆菌中融合表达了基因。 年,等【将,,/杂合肽基因分别第一章文献综述 与个不同的载体蛋白相融合,并在大肠杆菌中进行表达。对表达产物的产量、 细胞定位、蛋白降解情况进行了较为系统的研究。对其中的一些融合蛋白进行化 学裂解或酶解后,得到了具有抗菌活性的小肽。年,等】利用链霉 菌表达系统分泌表达了的融合蛋白,裂解后得到了有活性的产物。 , 年等在酵母中成功表达了具有正确二硫键配对的绿蝇 年,掣】利用多角体病毒表 产量最高可达每培养基。 达系统在昆虫细胞系中表达了的融合蛋白,末端未见酰胺化,后来 利用活体昆虫进行表达,产量提高了倍,并且部分产物被酰胺化。在国内, 谢维等【】在大肠杆菌中表达了家蚕多肽抗生素。年,、沈俊卿等在 酵母中表达了的类似物。 ..多肽抗生素的发展前景 目前多肽类抗生素广泛应用于工业、农业、畜牧业及医药等方面。抗菌肽作 为饲料添加剂可安全有效地增强牲畜的抗病能力。当前全球面临细菌耐药性的问 题,然而多肽类抗生素不易产生耐药性,这使得多肽类抗生素在医药方面的 应用具有极好的前景。同时,多肽类抗生素对癌细胞的作用也是人们开发新型抗 病毒及抗肿瘤药物的焦点,目前已经有研究人员试图将抗菌肽与合适的靶向部位 联合制备重组蛋白以期得到理想的抗肿瘤导向药物【。 目前。用于功能研究的抗菌肽多来自化学合成,国内外的研究人员都致力于 利用基因工程技术表达成本较低的多肽类抗生素。但是将常用的表达系统如大 肠埃希菌表达系统、酵母表达系统、昆虫细胞.杆状病毒表达系统及表达 系统等,应用于多肽类抗生素时,均存在明显的问题,严重影响多肽类抗生素 的表达量。因此,人们希望对多肽类抗生素的结构与功能进行更深入的研究,并 借助融合表达载体、合理构建杂合肽及重组肽等技术来实现这一目标。 .饲用抗生素的应用于发展 .饲用抗生素的应用 畜牧业是农业的主要组成部分之一,与种植业并列成为农业生产的两大支 柱。 在我国乃至全球,畜牧业都是经济的重要支柱之~。在发达国家畜牧业产值均占 农业总产值的%以上。在我国,畜牧业是现代农业的重要组成部分,同时畜牧博士学位论文 业的发展也是建设社会主义新农村的客观需要。近年来,畜牧业在农村经济乃至 整个国民经济和社会发展中的地位日益突出。“十一五”期间,在我国畜牧业发展 目标中明确提出:生产结构进一步优化,畜牧业科技进步贡献率提高到%以上; 到年,肉类、蛋类和奶类产量分别达到万吨、万吨和万吨; 畜牧业产值占农业总产值的比重达到%;饲料产量万吨,产值亿 元。自年以来,伴随着半合成、合成抗生素研究的飞速发展【】,抗生素作 为饲料添加剂,对集约化畜牧业的发展做出了重大贡献【。 饲用抗生素是指:在以改善健康动物的营养状况并促进动物的生长发育为目 的的,添加于动物饲料中的,具有抗菌活性的微生物代谢产物。研究表明,抗生 素对动物生长和生产性能的提高具有明显的促进作用,因此,许多国家的畜禽业 都长期应用抗生素添加剂【】。 ..饲用抗生素的促生长机制研究 抗生素的促生长作用机理已有相关学者进行研究,目前得到的结论【: 动物在生长过程中受到抗生长因子的影响,所谓抗生长因子即是环境中不 使动物产生临床症状但却能抑制动物生长的环境因子。而抗生素可通过抑制环境 中的抗生长因子产生的亚临床症状而促进动物生长,但是迄今为止对环境中产生 亚临床症状的因素及其定量分析却是非常困难的。肠道微生物与宿主之间存 在共生关系,而大部分抗生素是针对革兰氏阳性菌设计的,因而有人推测,抗生 素能抑制消化道有害微生物的增殖,减少有害微生物对维生素、氨基酸等必需营 养物质的破坏和消耗,从而增加了宿主的可利用养分,另外,有些抗生素能提高 机体内有益菌群的生长,如链霉素能提高雏鸡体内某些酵母菌的生长,从而促进 禽体内必需营养物质的合成。这些变化均有利于营养物质的吸收利用,但这个推 测只是针对部分试验适用。抗生素抑制或杀灭某些病原菌或寄生虫,从而对 细菌性或寄生虫性疾病起预防和治疗作用,当动物服用低于治疗剂量的抗生素时 有助于幼年动物免疫力的产生,尤其对机体免疫系统尚不健全,对疾病抵抗力较 弱的幼龄畜禽效果更加显著。 ..饲用抗生素的应用前景 长期、广泛、不加选择地使用抗生素饲料给细菌性疾病的控制和治疗带来了 极大的麻烦和困难‘】。细菌耐药性和药物残留等问题日益突出,也给人类的健康 第一章文献综述 带来潜在的威胁。由于饲用抗生素可能对人类健康与环境造成的危害,有些国家, 已经开始限制饲用抗生素的应用。瑞典、丹麦、欧盟相继全面禁用饲用抗生素。 美国已经成立抗生素耐药性检控体系,负责监控抗生素的耐药性。我国的抗生素 工业起步较晚,抗生素作为饲料添齐的应用也较晚。但是近年来,我国已经将 畜产品安全作为畜牧业发展的重点,出台了相应的法规、标准以畜产品安全。 限制并规范饲用抗生素的使用是基于畜产品安全的需要,同时也是是保障人 类健康与环境的需要。但是目前的科学研究发现,全面禁用饲用抗生素条件还不 成熟【】。 首先,美国大学的研究证明,在全面禁止使用饲用抗生素的最初几 年,土霉素的耐药性先降低后升高,说明完全禁用抗生素并不能达到消除抗生素 的耐药性的目的。同时大量的研究及临床经验也可以表明,耐药性与人医抗 生素 的使用及滥用有关。其次,对饲用抗生素的全面禁用,不仅会对畜牧业造成巨大 的损失。同时,禁用饲用抗生素使动物处于亚疾病状态,影响畜牧产品的品质, 增加氮、磷等营养成分的排放,对环境造成污染。第三,目前广泛研究的的抗生 素替代物之中,没有任何一种,可在抗菌,促生长的效果及经济效果上全面取代 饲用抗生素。 事实证明,饲用抗生素能够提高动物的生长及繁殖性能,满足人们对畜产品 的需求,为畜牧业的发展带来巨大的推进作用;但同时,我们也不可以忽视,饲 用抗生素可能给人类健康及环境带来的危害。因此,当前饲用抗生素的发展,既 要加强对饲用抗生素的作用机制、药理、毒理及残留的研究,不断监测饲用抗生 素的耐药性和残留,以筛选和研制高效、安全的动物专用抗生素。 .多肽类抗生素安来零素 安来霉素又名恩来霉素、恩拉霉素、持久霉素,商品名为恩 拉鼎,是一种多肽类抗生素,世纪年代由日本武田药品工业株式会社首次 .发酵 研发【】,通过土壤中分离出来的放线菌 产生,因其强大的杀菌作用而被命名为,之后世界卫生组织 确定其通用名为安来霉素‘。年日本正式批准该药为抗生素饲料添加剂。 年,日本武田药品工业株式会社向中国农业部申请登记该药,并被批准使 用。年,先灵葆雅公司成功地将生产基地转移至我国,生产安来霉素预混 博士学位论文 剂,供应全球市场】】。 ..安来霉素理化性质 安来霉素的盐酸盐为白色或微黄色结晶性粉末,分子量约为,融点为 ?,在?分解,易溶于稀盐酸、二甲基甲酰胺,可溶于甲 醇、含水乙醇,难溶于丙酮,不溶于醋酸、苯、氯仿 。强大的革兰氏阳性菌 抗 性,安来霉素分子是由种氨基酸的个单体组成的巨大内酯环?,脂肪酸侧 链通过酰胺键与内酯环连接图.。根据其末端脂肪酸种类不同,分为安来 霉素和安来霉素。安来霉素在不同的溶 剂中,紫外检测显示不同结果。以%的甲醇作为溶剂时,其最高紫外吸收峰出 现在 和 处;以 /盐酸溶液作为溶齐,在 和 处出现最高峰】;以 /氢氧化钠溶液作为溶剂时,在 和 处出现最高紫外吸收峰。安来霉素在固态下可以稳定存在,在为.~., ?的液态环境中可以稳定存在天以上;而在.以下和.以上,安来 霉素很容易发生降解,在?的 /的盐酸溶液中~ 后,安来霉素 会被水解。 图安来霉素的结构 ..安来霉素作为抗生素饲料添加剂的优点 安来霉素是一种广谱、高效、安全的新型抗生素饲料添加剂,具有以下优点第一章文献综述 【】:?在饲料中具有极佳的稳定性,在加工颗粒料的过程中仍保持活性;?在需 氧和厌氧条件下对主要的革兰氏阳性菌均具有强大杀菌作用;?在肠道内不被降 解,保持原有的抗菌活性;?与临床上现有的抗生素或抗菌药之间无交叉耐药性; ?细菌的耐药性产生非常缓慢,且耐药性不稳定、易丢失;?口服不被肠道吸收, 不会产生药物残留问题。此外,安来霉素对乙肝病毒抗原和乙肝抗原 曲也有较好的抑制效果【。 ..安来霉素的生物合成 由于安来霉素与其类似物雷冒拉宁和万古霉素曾为人类治疗革兰氏阳性菌 感染疾病最后的“防线”等革兰氏阳性菌治疗抗生素作用机制不同,可抑制革兰 氏阳性菌细胞壁合成的多个步骤,目前尚无耐药菌株出现,而安来霉素产生菌的 细胞壁不被破坏【】,其代谢过程引起人们的关注。 等研究报道了安来霉素结构中的持久双杀霉素合成途径,但并 未提出如何应用生物技术手段对合成过程进行改进来提高持久双杀霉素的 生成 量。年,等【通过同位素示踪研究了安来霉素的合成过程涉及鸟 氨酸、瓜氨酸、精氨酸的循环网络,报道了其重要稀有氨基酸持久双杀霉素 的合 成途径,如图.所示。博:学位论文 乙酰谷氨酸 乙警赚 激酶 【一一 . ?: 乙蕺谷氨酸 半醛脱氢酶 【 一一、 等旦 篱 、.乙酰鸟氨酸 乙酰谷氨酸一乙酰鸟 、 乙酰转氨酶 , 删 鸟氯酸 太:艘’。 一 ’\ / 旒?四 ?? ?, .?.?。, / / \ \ 图.持久双杀霉素的合成途径.等克隆并分析了 年, 美国俄勒冈州立大学 中安来霉素的生物合成基因簇。经分析表 . 明,安来霉素生物合成基因簇包括个开放阅读框,长度为 的安来霉素 、 、 ,其结构如图 合成基因簇由四个基因构成,分别为 所示。 等人七对安来霉素的脂肪酸侧链进行研究,并明确了其合成 途径。第一章文献综述 溜日匕匀冷冷中臼:二参日瞎臼了群拈 瑚 ? “ 拍 匕??一????????.?????螽藏豳麟圜翻翻嘲毒睡陟 ,, ? “ 钉‘ 拈 柏,村?圈圈叫畛枷???..???盐 图安来霉素合成基因簇及侧翼基因结构【 .?..安来霉素的发酵研究 “等在研究中详细阐述了安来霉素产生菌的菌种形态及发酵条件,试 验发现从土壤中分离得到的菌株会形成多刺的螺形孢子丝、灰色的气生菌 丝。发 酵培养基为可溶性淀粉%、玉米浸泡液%、 .%、 %,值为 。 .,在。下发酵 等用同位素示踪法分析安来霉素生物合成 过程中的流分配情况,确定了组成安来霉素的各种氨基酸,并给出发酵生产 中的种子培养基为:淀粉.%、谷类浸泡液.%、 .%,值为.; .%、 发酵培养基为葡萄糖.%、淀粉.%、谷类浸泡液.%、麸皮.%、 。 .%、.%,培养条件为。、 /,值为.,培养 同时 等还研究了持久双杀霉素的合成过程,其中涉及鸟氨酸、瓜氨 酸、精氨酸的循环网络,在非血红素铁加氧酶的作用下,以精氨酸为底物合成持 久双杀霉素。 吲等对菌种进行诱变处理,使发酵液中安来霉素的浓度达到 等‘每头孢替安与一些抗生素混合,研究混合物对耐甲 /。 氧西林金葡球菌的抗性,结果发现安来霉素与头孢替安起到协同作用,可以抑制 所有菌株的生长。 年,巴西学者【对不同抗生素饲料添加剂作用下动物肠道内的菌群情 况做过相关研究,结果表明,添加安来霉素可促使其迅速增重,并且提高肉料比; 年美国俄勒冈州立大学 等【 克隆了 中 安来霉素的生物合成基因簇,并对这些基因进行了序列分析,结果表明: 基因簇中的.分别编码非核糖体肽合成酶中的个、 个、个和个模块,并指出非核糖体合成酶系?在安来霉素的合成过程 中起到关键作用,文中对于的检测方法有所提及。年,等【对安 博士学位论文 来霉素的合成基因簇进行描述,确定其由 碱基组成,包括个开放阅读 框,其中有个基因编码非核糖体氨基酸合成酶。年,?等】人对 安来霉素生物合成过程中的卤化时间及作用进行研究,试验中通过敲除安来霉素 产生菌的得到突变株,敲除安来霉素产生菌的并转入雷末拉宁的 得到突变株,未敲除并转入得到突变株,通过表达后得知, 突变株产生了双氯安来霉素,突变株得到单氯安来霉素,突变株得到三氯 安来霉素。 刘铁军等【】研究了培养基灭菌后溶磷和发酵过程值等对杀真菌素链霉菌 一.合成安来霉素的影响,通过发酵尾气成分 的测量和,等参数的分析,发现培养基灭菌后溶磷质量浓度控制在 /。 发酵单位最高可达 ../,控制发酵过程值为., 胡江林,王永星等【】公开了一种发酵生产安来霉素的方法,其主要是将杀真 菌素 .的孢子液在液氮环 链霉菌 境下冻存,然后按~%的接种量将种子液接种到发酵培养基中进行发酵。发 酵结果比传统工艺有所提高,安来霉素最大产量达到 /以上。 李荣杰等提供了一种用于提高安来霉素产量的发酵培养基新配方和新方法, 其主要为葡萄糖.%~.%、玉米淀粉,%~.%、玉米蛋白粉。~.%、棉 籽饼粉.%~.%、尿素.%.%、磷酸二氢钾.%~.%、氯化钠.%~ ..。发酵培养基在恒温培养的 .%和碳酸钙.%~.%,其余为水, 发酵过程中,往发酵液中补水,改善发酵液的溶氧量,提高安来霉素发酵水平。 %。 在发酵培养过程中经适时适量补水后,安来霉素发酵水平的提高可达约 .产抗生素微生物育种 ..诱变在产抗生素微生物育种中的应用 从自然环境中分离得到的抗生素产生菌的野生型菌株,其生产能力通常很 低。为了满足工业需求,经依靠自发突变累积的有益突变是远远不够的,在工业 生产中,提高抗生素产量最重要的途径是通过育种改良生产菌种,而最有效的方 是诱变【到,通过人工诱变的方法诱发微生物基因突变,人为改变遗传结构和功能, 再利用特定的筛选方法,选育出产量高、性状优良的突变株。经过诱变选育后,第一章文献综述 野生型菌种的生产能力往往可提高几十至几百倍使其能在尽可能短的周期内符 合工业化大生产的需要【。通过诱变选育能够改善抗生素产生菌的生长特性,从 而优化发酵工艺条件,缩短发酵周期,增加设备以及原料的利用率,降低生产成 本【引。同时,研究显示通过诱变和原生质体融合等方法可以激活微生物在 自然条 ,来加 件下不表达或是极低水平表达的序列,从而找到新的抗生素种类【 快抗生素的筛选,满足人们对抗生素的需求。此外,人们利用人工诱变方法,使 抗生素产生菌失去产抗生素或其中间体的能力,获得抗生素生物合成的各种不同 障碍型突变体。利用这些突积累的中间代谢产物或支路代谢产物,分析产生菌和 突变株的代谢产物的化学结构上的差异,找出这些代谢产物在合成过程中的相互 关系,研究抗生素的生物合成途径。 ..诱变育种的方法 常见的诱变方法分为三种:物理诱变、化学诱变和生物因素。物理诱变通常 采用物理辐射中的各种射线,包括紫外线、射线、磁场、丫射线、快中子、 激光射线、微波等。其中对效果较好并获得广泛应用的有紫外线、射线、丫射 线的快中子。近年来,随着重离子束的获得,离子辐照诱变育种也成为诱变育种 的一种新方法【】。主要利用碱基类似物、烷化剂和叮啶类移码突变剂等化学诱变 剂对出发菌株进行处理,筛选高产突变株。生物诱变剂则有转导诱发突变、 转化 诱发突变及转座诱发突变。 .紫外线诱变 紫外诱变技术是诱变和筛选优良菌株的常规育种方法,其操作安全简便,被 广泛地应用于微生物诱变。中的嘌呤和嘧啶可以吸收的紫外线光谱, 因此能诱发生物突变的有效波长范围是.。紫外辐射使分子形成 嘧啶二聚体,阻碍碱基正常配可能引起突变或死亡。另外嘧啶二聚体的形成,还 会妨碍双链的解开,因而影响的复制和转录【。 .激光诱变 年提出了小剂量辐射对生物有刺激作用的理论之后,激光应用 于生物领域就倍受人们的关注明。激光辐射可以通过产生闪、热、压力和电磁场 的综合作用直接或间接地影响生物有机体,引起、染色体畸变效应,酶的 激活和钝化以及细胞的分裂和细胞代谢活动的改变等】。不同种类的激光辐射 生物有机体,所表现出的细胞学和遗传学变化也不同,这给生物诱变育种提供了 博士学位论文 有利条件【。激光诱变微生物技术与其它诱变方式相比,具有能量密度高、靶点 小、单色性和方向性好、诱变当代即可出现遗传性突变等特点。而且激光诱 变具 有操作简单、安全、变异率高、辐射损伤轻等优点,因此激光诱变育种在工业微 生物育种中得到广泛应用。 .亚硝基胍诱变育种 亚硝基胍为土黄色结晶物质,为强致癌物质,为高效诱变剂,在合适条 件下,死亡率低而诱变突变率高,如当死亡率在%时可诱发大肠杆菌不能利用 乳糖的突变株,突变率达.%。对每一细胞可有诱发一次至多次突变的效 力,故有超级诱变剂之称【。 .微波辐射诱变育种 微波是一种频率在到之间的电磁波,它具有波动性、高频 性、热特性和非热特性。微波能够刺激水、蛋白质、核苷酸、脂肪和碳水化合物 等极性分子快速振荡,这种震动能引起摩擦,使得单薄孢子悬液内分子间 强烈摩擦,孢内分子氢键和碱基等化学力受损,使得结构发生变化 从而发生变异【引。微波还能透射到生物组织内部使偶极分子和蛋白质的极性侧链 以极高的频率振荡,增加分子的运动,导致热量的产生,迫使氢键、疏水键和范 德华力重新分配,改变蛋白质的构象与活性【。微波诱变育种的研究及应用相当 广泛,涉及到很多领域【引。微波诱变设备简单、方法易行、操作安全,诱变 效果 良好,具有广泛的应用前景。 .原生质体融合育种技术 年,匈牙利的首次将原生质体融合技术应用于微生物中 成功将白地霉营养缺陷型突变株的原生质体进行融合。目前,原生质体融合诱变 育种技术已作为一项十分有用的技术广泛应用于工业微生物菌种选育中。原生质 体融合是将两个亲株细胞壁分别通过酶解作用剥除,使其在高渗环境中释放出原 生质膜包被着的球状原生质体。然后将两个亲株原生质体在高渗条件下混合,由 聚乙二醇助融,使之相互凝聚,通过细胞质融合,发生两套基因组之间的接触、 交换、遗传重组,在再生细胞中得到重组体.】。原生质体融合技术一般分成 五大步骤:直接亲本及其遗传标记选择,双亲本原生质体制备和再生,亲本原生 质体诱导融合,融合重组体筛选,遗传特性分析和测定【】。 .离子束诱变育种 离子束诱变育种是由中国科学院等离子体物理研究所余增亮研究员等创建第一章文献综述 的。研究人员认为,低能离子与生物相互作用既有能量沉积、质量沉积、动 量传 递过程,又有粒子注入、电荷交换的过程,这些过程的联合作用,引起强烈的生 物学效应唧】。离子束诱变技术己成为我国自主知识产权的定向遗传育种的新方法, 新途径【?。 离子注入生物,首先,入射离子同靶原子发生碰撞,导致原子激发、电离和 能量损失,同时慢化的原初入射离子以高斯分布形式沉积下来。这是辐射生物体 内物质的最初过程,即物理阶段;随着能量的传递、原子的解离及入射离子的沉 积,与靶分子所交换的能量急剧地被释放出来,由此形成一个电离密度相对高的 电离峰。如果电离峰正好停留在生物体的遗传物质上则会引起的断裂、重 排,导致染色体的结构变异。该段称为化学阶段:最后一个阶段是生物学阶段, 分子损伤不能通过细胞的代谢功能得以修复,表现为细胞死亡或突变。离子注入 后,质量沉积有可能会使分子的结构成分被取代或补充,导致遗传性变异。 大量的研究结果表明,荷能离子被注入生物体后,所表现的生物学效应具有局部 性、双重性和不易修复性】。一般在射线辐照下,细胞存率与剂量大小呈典 型的指数下降曲线,但离子注入存在细胞存活率与离子注入剂量先降后升再降的 马鞍形下降曲线,解释了低能离子注入具有生理损伤小,突变率高的原因?。 离子束诱变育种与传统的辐射法及化学诱变剂相比,突变率高,突变谱宽, 损伤轻,遗传稳定的特点,离子注入除了与~般辐射一样由于能量作用引起 链断裂外,还由于质量、能量、电荷的三因子协同引起大量受体原子移位、重组, 形成新的分子结构和基因,产生丰富的基因突变【】。离子束诱变具有正突变株高 的特点,为工业微生物育种筛选高效菌株提供了更广阔的空间【。 离子注入育种技术作为一种新兴的交叉学科技术,显现了巨大的优势。离子 注入集化学诱变和物理诱变于一身,变异幅度大、突变率高、操作简单、适用于 多种微生物,并且还可以和其它方法结合对菌种进行复合诱变,加之离子束介导转 基因的可能性,使其在微生物育种中更具有目的性和针对性。随着研究程度的 深入,研究范围的拓宽,相信离子注入法在微生物育种中能发挥巨大的作用【。博士学位论文 .抗生素的分离纯化研究 ..抗生素的提取 抗生素的分离提取是整个发酵工业的下游技术,但这一步是非常关键的,常 规的方法有:离子交换法,沉淀法、溶媒萃取法,吸附法和膜过滤技术等。 萃取法是生物工业中一种重要的分离提取方法【】。用于有机酸、氨基酸、抗 生素、维生素、激素和生物碱等生物小分子的分离和纯化】。膜分离是利用 具有一定选择性透过特性的过滤介质进行物质的分离纯化【。目前各种膜分离 技术也迅速发展并在分离纯化过程中得到越来越广泛的应用】,成为最重要的 分离技术之一。超滤膜分离过程简单、无相变、无溶剂污染、易保持生物分子活 性,已得到广泛应用】。利用反渗透可对液体混合物进行分离。近年来 乳状液膜也开始应用于抗生素的提取中【。亲和层析则是利用偶联亲和配基的 亲和吸附介质为固定相亲和吸附目标产物】,离子交换法是借助于固体离子交 换剂中的离子与稀溶液中的离子进行交换,以达到提取或去除溶液中某些离子的 目。 ..抗生素的精制 发酵滤液在经过预处理及粗粗提取后,还要进一步提纯。抗生素种类繁多, 结构复杂,在进行抗生素分离纯化时,因根据抗生素的特点来建立具有针对性的 工艺。目前抗生素纯化的主要技术有色谱、大孔吸附、萃取等。 色谱法可分为分配色谱、吸附色谱、排阻色谱及离子交换色谱法】。 分配色谱法,是利用溶液中被分离物质在两相中分配系数不同,以使组分分 离。常用的载体有硅胶、硅藻土、硅镁型吸附剂与纤维素粉等。吸附柱色谱法, 以分配平