罗非鱼无乳链球菌分子血清型、耐药性以及快速

罗非鱼无乳链球菌分子血清型、耐药性以及快速 罗非鱼无乳链球菌分子血清型、耐药性以及快速 罗非鱼无乳链球菌分子血清型、耐药性以及快速 201X年以来，我国南方多个罗非鱼主养区连续爆发链球菌病，罗非鱼受感染率与死亡率均较高，个别发病率超过50%，发病鱼死亡率超过95%。链球菌病严重威胁了我国罗非鱼养殖业的健康发展。引起我国南方罗非鱼链球菌病的致病菌主要是无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)。无乳链球菌广泛分布于自然界中，革兰氏阳性，是人、牛和鱼等多种生物的重要致病菌之一。本实验室研究人员赶赴广东与海南省各罗非鱼主养区，采集发病鱼样本，开展了相关研究。本内容包括病原菌的分离与鉴定、药物敏感性试验;利用环介导等温扩增技术进行快速检测病原菌;致病菌分子血清型的鉴定;致病菌对喹诺酮类药物最小抑菌浓度的测定以及耐药基因的筛选。研究结果对罗非鱼链球菌病的有效防控、促进罗非鱼养殖业的健康发展具有重要意义。1罗非鱼无乳链球菌分子血清型与耐药性研究为研究罗非鱼无乳链球菌的血清型与耐药性之间的关系，本研究对201X,201X年从海南省各地罗非鱼养殖场中分离到的24株病原菌，采用常规细菌鉴定结果显示，病原菌革兰染色阳性、球形、短链状，β溶血，结合16S rRNA基因鉴定确认24株病原菌均为无乳链球菌。PCR法扩增菌株荚膜多糖(cps)基因鉴定其血清型，表明24株无乳链球菌血清型均为?a型。采用K-B纸片扩散法检测分离菌株对31种常用抗生素的敏感性，结果表明多数菌株对氨基糖苷类和喹诺酮类药物敏感率低，对强力霉素敏感。对于多数抗生素，201X年分离的菌株敏感率明显低于201X年分离的菌株。本研究表明近两年海南省罗非鱼无乳链球菌分子血清型与菌株耐药性之间无直接相关关系。该结论为罗非鱼无乳链球菌耐药性监测、血清分型及综合防控提供实验依据。2罗非鱼无乳链球菌环介导等温扩增技术(LAMP)快速检测以无乳链球菌溶血因子cfb基因为研究对象，首先针对cfb基因6个区域设计4条特异性引物，采取环介导等温扩增技术(Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP)，并利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)建立环介导等温扩增体系，在65?恒温温浴1h完成反应，然后向温浴扩增产物中加入SYBRGreen?，通过观察其颜色变化 判定结果。利用LAMP方法同时对无乳链球菌、海豚链球菌、金黄色葡萄球菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、浅绿气球菌、变形杆菌以及迟钝爱德华菌进行等温扩增，结果表明所建立的LAMP方法能够特异的检测出无乳链球菌。对LAMP方法的灵敏度进行检测，发现其对纯DNA检测的最低限度为10pg/反应，对纯细菌培养物的最低检测限度为20个/反应。LAMP检测方法的灵敏度是普通PCR方法的10倍以上。表明以cfb作为靶基因所建立的LAMP检测方法具有高度的特异性、敏感性以及稳定性，为罗非鱼无乳链球菌的快速检测提供了新的技术。3罗非鱼无乳链球菌对喹诺酮类的耐药性及与其耐药基因的相关研究为了解罗非鱼无乳链球菌体外对喹诺酮类药物耐药性及与其耐药相关基因gyrA和parC基因突变的关系，本实验通过微量稀释法测定了41株分离菌株对4种喹诺酮类药物的最小抑菌浓度(MIC)值，并克隆了相应菌株体内的gyrA和parC基因测序分析各耐药基因突变情况。结果表明:41株罗非鱼无乳链球菌分离菌株对左氧氟沙星、氟罗沙星、洛美沙星和依诺沙星等4种喹诺酮类抗菌药物的耐药率分别为2 2.0%、7 5.6%、7 3.2%和100%。9株菌对4种喹诺酮类抗菌药物均表现耐药，其中有6株菌发生了氨基酸突变。发生gyrA和parC基因突变的各有3株菌，另外3株菌则未发现突变位点，这说明无乳链球菌对喹诺酮类药物耐药性的产生可能还存在其他耐药机制。 摘要4-6Abstract6-10引言10-201 鱼类链球菌病国内外研究概况10-112 鱼类无乳链球菌研究概况11-12 2.1 无乳链球菌流行病学研究11 2.2 疾病的临床症状11-123 无乳链球菌的特性12 4.无乳链球菌血清型12-135 无乳链球菌的检测及鉴定13-16 5.1 细菌生理生化自动鉴定系统13 5.2 16S rRNA 基因序列测定与分析13 5.3 环介导等温扩增13-166 无乳链球菌的耐药性16-18 6.1 罗非鱼无乳链球菌耐药现状16 6.2 最小抑菌浓度的测定16-17 6.3 喹诺酮类抗生素的耐药基因及机制17-187 本研究目的与意义 188 研究方法及技术路线18-20 8.1 研究方法18-19 8.2 技术路线19-20第一章 罗非鱼无乳链球菌血清型及耐药性研 究20-311 材料与方法20-24 1.1 病鱼的采集及病原菌的分离纯化20 1.2 常用试剂及试剂盒20 1.3 培养基的制备20-21 1.4 缓冲液的配制21 1.5 细菌的生理生化鉴定21-22 1.6 细菌 DNA 的提取22 1.7 基于 16S rRNA 基因的 PCR 扩增22-24 1.8 分子血清分型24 1.9 药敏试验242 结果24-29 2.1 菌株形态和生理生化鉴定24-26 2.2 16S rRNA 基因鉴定26 2.3 血清型鉴定26-27 2.4 药敏试验结果27-29 3. 讨论29-31第二章 罗非鱼无乳链球菌 LAMP 快速检测方法的 建立31-381 材料与方法31-34 1.1 实验用菌株31-32 1.2 试剂及器材32 1.3 水煮法提取细菌 DNA32 1.4 引物的合成32-33 1.5 LAMP 反应33-34 1.6 样品检测342 结果34-36 2.1 特异性实验34-35 2.2 敏感性实验35 2.3 LAMP 荧光实时检测35-36 2.4 样品检测36 3.讨论36-38第三章 罗非鱼无乳链球菌对喹诺酮类药物的耐药性与耐药基因相关性研究38-441 实验材料与方法38-40 1.1 菌株38 1.2 试剂38-40 1.3 最小抑菌浓度的测定40 1.4 耐药基因的检测402 结果40-42 2.1 最小抑菌浓度的测定40-42 2.2 耐药基因的扩增423 讨论42-44全文44-45 参考文献 45-52附录52-55附录一 缩略词表52-53附录二 LAMP 反应扩增原理53-54附录三 在读期间发表论文情况54-55致谢55