血管紧张素转化酶基因插入_缺失多态性与新生儿危重症和胰岛素敏感性关系的研究

血管紧张素转化酶基因插入_缺失多态性与新生儿危重症和胰岛素敏感性关系的研究 血管紧张素转化酶基因插入_缺失多态性与新生儿危重 症和胰岛素敏感性关系的研究 北京大学 博士学位论文 血管紧张素转化酶基因插入/缺失多态性与新生儿危重症和胰岛 素敏感性关系的研究 姓名:韩彤妍 申请学位级别:博士 专业:儿科学 指导教师:叶鸿瑁 20050501北京大学博士论文 血管紧张素转化酶基因插入/缺失多态性与 新生儿危重症和胰岛素敏感性关系的研究 北京大学第三医院儿科 研究生 韩彤妍 导 师 叶鸿瑁 教授 副导师 王新利 副研究员 中文摘要血管紧张素转化酶(angiotensin converting enzyme,ACE)基因插 入/缺失 insertion/deletion, I/D多态性引起的肾素-血管紧张素系统(renin angiotensin system,RAS)活性差异,与人类健康和疾病的有着广泛的联系。本课通过 检测 ACE 基因 I/D 多态性,分析其与新生儿危重症和新生儿胰岛素敏感性的 关系。课题分两部分进行。 第一部分研究ACE基因I/D多态性与新生儿危重症的关系。按新生儿危重病 例评分标准将入NICU的新生儿于入院第1d分为非危重病组(237例)、危重病 组(98例),同时设正常对照新生儿116例。提取DNA后进行基因分型并检测血 清ACE水平。危重病组DD基因型比正常对照组和非危重病组多,DD基因型患 儿入院第1d的危重病评分较低,DD基因型需要呼吸机辅助治疗的病例较多, 出现代谢性酸中毒和低血钠、低血糖的例数也较多,而罹患新生儿湿肺、新生 儿呼吸窘迫综合征和早产儿动脉导管未闭的病例也较多。DD基因型的血清 ACE水平显著升高,而且血清ACE水平与入院第1d的危重病评分呈显著负相 关。以上结果表明ACE基因/缺失多态性与新生儿危重症有相关性,DD基因型 患儿有相对高的血清ACE水平,表现为病情相对重,心肺功能适应性相对差。 第二部分研究202例新生儿ACE基因I/D多态性与胰岛素敏感性的关系。用 3 北京大学博士论文 HOMA指数来评价胰岛素敏感性,小于胎龄儿胰岛素敏感性比适于胎龄儿胰 岛 素敏感性相对差,DD基因型的HOMA指数相对高,提示DD基因型比II和ID 基 因型的胰岛素敏感性相对差。在孕周无差异的情况下,DD基因型出生体重最 轻,II基因型出生体重最重,ID居中。说明ACE基因型与低出生体重、成人 胰 岛素抵抗和代谢综合征有关。 关键词 ACE基因I/D多态性,新生儿危重症,血清ACE水平,胰岛素敏感性4 北京大学博士论文 Relationships between angiotensin converting enzyme gene insertion/deletion polymorphism and illness severity and insulin sensitivity of neonates MD. Candidate: Han Tongyan Tutor: Professor Ye Hongmao Associate Tutor: Associate Professor Wan Xinli ABSTRACT Recent studies indicate that the angiotensin converting enzyme ACE gene insertion/deletion I/D polymorphism influence renin?angiotensin system RAS activity and, thus, may have an impact on the health status and disease processes. We investigated whether the illness severity and insulin sensitivity of neonates were influenced by the ACE genotype. The study was divided into two partsIn the first part, the relationship between ACE gene polymorphism and illness severity of neonates was studied. According to the Neonatal Critical Score draft, the neonates admitted to NICU were divided into non-critical group n237 and critical group n98, and a normal control group n116. DD genotype frequency was increased in the critical group compared with the non-critical group and normal control group and was significantly associated with lower critical score. More DD subjects needed mechanical ventilation support and the incidence rates of metabolic acidosis, hypoglycemia and hyponatremia were also higher in DD group. More DD subjects developed neonatal respiratory 5 北京大学博士论文 distress syndrome NRDS and wet lung syndrome. The incidence rate of patent ductus arteriosus PDA was higher in preterm with DD genotype. The ACE activity was higher in carriers of the DD genotypeAnd a negative correlation was observed between ACE activity and the critical scores. Thus, ACE gene I/D polymorphism associated with increased illness severity of neonates. The DD genotype, encoding higher ACE activity, may adversely influence the illness severity of neonatesIn the second part, the relationship between ACE gene polymorphism and insulin sensitivity was studied in 202 neonates. The homeostasis model assessment HOMA was used to estimate insulin sensitivity. The neonates who were small for gestational age had relatively impaired insulin sensitivity compared with the neonates who were appropriate for gestational age. The DD carriers, with higher HOMA, had a relatively impaired insulin sensitivity compared with ID and II. As to the birth weight, the DD carriers were the lightest and the II carriers were the heaviest. This may explain the association of DD genotype and insulin resistance and metabolic syndrome in adults 【Key words】 ACE gene I/D polymorphism, Neonatal critical case, Plasma ACE activity, Insulin sensitivity 6 北京大学博士论文 中英文缩略词对照 ACE angiotensin converting enzyme 血管紧张素转化酶 I/D Insertion/deletion 插入/缺失 renin angiotensin system 肾素-血管紧张素系统 RAS angiotensinogen 血管紧张素原 AGT angiotensin ? 血管紧张素? Ang? angiotensin? 血管紧张素? Ang? systemic renin angiotensin system 循环肾素-血管紧张素系统 SRAS local renin angiotensin system 局部肾素-血管紧张素系统 LRAS bradykinin 缓激肽 BK ARDS acute respiratory distress syndrome 急性呼吸窘迫综合征 NRDS neonatal respiratory distress syndrome 新生儿呼吸窘迫综合征 BPD bronchopulmonary dysplasia 支气管肺发育不良 neonatal intensive care unit 新生儿重症监护病房 NICU nitrous oxide 一氧化氮 NO arginine vasopressin 精氨酸加压素 AVP adrenocorticotropic hormone 促肾上腺皮质激素 ACTH prostaglandin E 前列腺素 E PGE 2 2 2 patent ductus arteriosus 动脉导管未闭 PDA insulin resistance 胰岛素抵抗 IR IUGR intrauterine growth retardation 宫内发育迟缓 ACEI angiotensin converting enzyme inhibitor 血管紧张素转化酶抑制 剂 SGA small for gestational age 小于胎龄儿 7 北京大学博士论文 AGA appropriate for gestational age 适于胎龄儿 PICU pediatric intensive care unit 儿童重症监护病房 HOMA homeostasis model assessment equation 内稳态模式评估公式 ponderal index 出生体格指数 PI insulin-like growth factors 胰岛素样生长因子 IGF 8 北京大学博士论文 文献综述 血管紧张素转化酶基因插入/缺失多态性与 新生儿危重症和胰岛素敏感性的关系 血管紧张素转化酶(angiotensin converting enzyme,ACE)基因插入/缺失 insertion/deletion,I/D多态性引起的肾素-血管紧张素系统(renin angiotensin system,RAS)活性差异,与成人期疾病关系的研究已经进行了十余年。ACE [1] [2, 3] [4] 基因I/D多态性与扩张性心肌病 、冠心病 、原发性高血压 、高血压性左 [5] [6, 7] [8] [9, 10] [11] [12] 室肥厚 、糖尿病 、肾脏疾病 、结节病 、哮喘 和铍中毒 等多种 疾病关系的探讨,提示我们RAS、ACE基因I/D多态性与人类健康和疾病存在 广 泛联系,推动我们开展其与新生儿疾病关系的研究。 1、 RAS、ACE 基因与 ACE RAS的主要成份包括血管紧张素原(angiotensinogen, AGT)、肾素(renin)、 ACE、血管紧张素?angiotensin ?,Ang?、血管紧张素?(angiotensin?, Ang?)及其各型受体。除了循环RAS(systemic RAS,SRAS)在机体心血管 [13] [14] 系统、水电解质平衡以及内环境自稳态调节中发挥作用 ,研究证实在心脏 、 [15] [16] [17] [18] [19] [20] [21] 肺 、脑 、肾 、眼睛 、血管 、骨骼肌 、T淋巴细胞和白细胞 等 [22-25] 多器官和组织存在局部RAS(local RAS,LRAS) ,其中各成分的产生不 [26] 依赖于循环前体物质,这些物质通过自分泌、旁分泌和胞内分泌 作用影响局 [27] [28] [29] 部组织的生长 、代谢 、炎性反应 及其他生理过程。 ACE基因位于17号染色体长臂2区3带(17q23),属于单拷贝基因,长21kb, [30] 由26个外显子和25个内含子组成 。在ACE基因存在多个变异位点,近年来倍 受瞩目的是位于ACE 基因16内含子长度为287bp的Alu序列的插入(insertion, 9 北京大学博士论文 [31] I)或缺失(deletion,D) 。因为16内含子起始部位14bp的核苷酸序列与末 端的14bp序列相同,这种重复序列的结构可能是产生ACE基因缺失型的起源, 即在细胞减数分裂时,后边14bp的重复序列取代了前一序列,造成其中的287bp [32] 序列排除在外的缺失结构 ,使ACE基因呈现插入/缺失(I/D)的限制性片断 长度多态现象,即存在I和D两种等位基因以及三种基因型:DD 纯合子、ID 杂 [31] 合子和II纯合子,遗传方式为常染色体显性遗传 。不同种族间等位基因频 率 [33] 和基因型频率都有差异,高加索人D等位基因频率是50.0% ,非洲美国人为 [34] [35] [33] 60.4% ,亚洲人是39.0% ;DD基因型频率在高加索人是35.0% ,亚洲人 [35] 是20.0% 。 ACE是一种含锌的金属肽酶,系统名称为肽基-二肽水解酶EC,3-4-15-1 [36] [37] 。其分子量为150~180 KD,由1306个氨基酸组成 ,含2个结构相似的功 能区。ACE是RAS的关键酶,不仅可以使十肽的Ang?脱去组氨酰亮氨酸,生 成强大的、作为血管加压物质的八肽Ang?,直接引起血管收缩和间接刺激 醛 [38] 固酮的释放从而引起水钠贮留 ,还可以同时水解缓激肽(bradykinin,BK) 羧基末端的苯丙氨酰精氨酸,使之失去舒血管作用,因此具有另一个名字?激 [20] 肽酶?(kininase ?) 。ACE 在机体的血压、水电解质稳态方面的调节起着 [4] [39,40] 重要的作用 ;能使参与炎性作用的BK、P物质等多肽性物质灭活 ,因此 ACE是RAS以及激肽-缓激肽系统的重要调节因素,影响人体多种生理机能。 2、ACE 基因 I/D 多态性与 ACE个体间RAS活化程度差异与ACE基因I/D 多态性有关,ACE基因型影响ACE [41] 的浓度和生物活性 。 1990年Rigat等研究80例高加索人种健康个体的ACE 基因 I/D多态性和血清ACE水平,证实ACE浓度与基因多态性存在密切联系:ACE 10 北京大学博士论文 [33] 水平变化受ACE基因的调控 ,DD、ID和II三种基因型携带者的血清ACE水 平分别为493、393和299 μg/L(P0.01);不同基因型使高加索人种血清ACE [33,42] 水平产生个体间差异达43%~47% ;对正常人群的研究发现,在心脏和白 [14,21] 细胞,DD基因型个体与II基因型个体相比,组织ACE浓度增高达75% 。[33] ACE基因如何调控ACE水平?Rigat等认为与转录有关 。ACE基因第16 内含子中Alu的重复序列插入(I等位基因)降低ACE基因转录速率,使ACE 合 成减少,因而降低RAS的活性。Ukkola等认为I等位基因是增强子的抑制物, 它 [43,44] 影响其他基因位点使产物蛋白构象改变,从而使酶活性减弱 。而Keavney 等认为I/D多态性只是出现在ACE基因的一个内含子上,一般内含子并不直接影 响基因编码的蛋白质的性质,因此,这一多态性可能是其它具有重要功能的基 [45] 因位点的标记 。Rieder等提出该基因多态性可能与一个上调ACE表达量的(S [46] 等位)基因存在紧密连锁不平衡 。 3、ACE 基因 I/D 多态性与肺损伤 [47] 越来越多的证据支持 RAS 活化在肺损伤时起作用 。肺循环是 RAS 活化 [48] [49] 的重要靶器官,肺局部 RAS 活化通过影响血管渗透性 、血管张力 、成纤 [50] [51] 维细胞活性 和缩短肺泡上皮细胞生存时间 以及其它组织(如骨骼肌、心 [52] 肌或血管壁)的局部 RAS 的作用 ,调节系统炎性反应、组织低氧反应和代 [53] 谢底物的利用 。 动物实验结果表明,肺内小动脉平滑肌中有 ACE 基因的表达,并检测到 [54] ACE 的活性 。低氧 6 小时后 ACE 基因表达的变化并不明显,但随后的 12、 24、48 小时明显增加,并呈时间依赖性;在低氧 24 小时后肺内小动脉平滑肌 中 ACE 活性较低氧前显著增加。研究提示低氧可促使肺内小动脉平滑肌中的 11 北京大学博士论文 [54] ACE 基因表达增加 ,使 ACE 的合成增加、ACE 活性上升,当然低氧也可 能使 ACE 分子结构发生变化而引起活性增加,Ang?的生成随即增加,通过 相应的受体介导使肺内小动脉平滑肌增殖、肥大,引起或促进低氧性肺动脉 高压的形成及发展。 Marshall 等首次对 ACE 基因型和成人急性呼吸窘迫综合征( acute [29] respiratory distress syndrome,ARDS)发生、发展的关系进行了研究 。他们 将 96 例诊断为 ARDS 的病人设为实验组,另设 3 组对照:88 例发生呼吸衰竭 (非 ARDS)的病人,174 例行冠状动脉分流成形术的病人和 1906 例健康人。 ARDS 组病人携带 DD 基因型频率明显高于三个对照组;D 等位基因与 ARDS 组增高的病死率有关:II 是 1/9(11.1%),ID 是 12/43 (27.9%),DD 是 24/44 (54.5%)(P0.02)。上述 D 等位基因和 ARDS 之间的关系提示 ARDS 初始 阶段 RAS 活化的作用,研究者因此提出 ACE 基因型的研究将可以预测低氧 肺 损伤的疾病进展及转归。 研究发现在 ARDS 时,肺泡灌洗液的 ACE 活性升高而循环 ACE 活性降 [56] 低 ,这一局部 ACE 活性的增高可能通过影响血管通透性、内皮细胞生存 [57] 时间和纤维母细胞活性而影响急性肺损伤的病程 。 新生儿呼吸窘迫综合征(neonatal respiratory distress syndrome,NRDS) 和支气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasia,BPD)都是新生儿的肺 损 [58] 伤性疾病 。在 NRDS 急性期,肺血管阻力增加、肺内出现右向左血液分流 和显著的低氧血症,发生与 ARDS 相似的病理生理变化。BPD 是常发生于早 [59] 产儿呼吸机治疗后的慢性肺损伤 。BPD 的发生以急性炎性介质浸润、不同 程度的肺组织纤维化和肺泡实变为特征,这些病理变化最终导致早产肺发育 [59] 受损 。因为研究证实在炎症和 RAS 活化之间、肺纤维化和 ARDS 结局之间 12 北京大学博士论文 [29] 存在联系 ,据此推断,ACE 基因 I/D 多态性与新生儿肺损伤之间可能存在 联系。 英国的 Harding 等对 148 例新生儿重症监护病房(neonatal intensive care unit,NICU)中孕周 29~32 周、体重 1356~1761g 的危重早产儿进行生后早 [60] 期心肺血管适应性的研究 。他们将 ID 和 II 基因型患儿合并为 ID+II 组,与 DD 基因型患儿组进行比较。研究发现 DD 基因型的患儿需要较高的吸入气氧 浓度(最高吸入气氧浓度 DD 为 39%、II+ID 为 0.21%,P 0.039;最低吸入 气氧浓度 DD 为 27%、II+ID 为 21%,P 0.046;DD 基因型患儿碱剩余的 负值明显增加(DD 为-5.0,ID+II 为 0 ,P 0.024);而且为了维持血压在 正常范围,DD 基因型的患儿更多的需要血管活性药物(P 0.037。他们因 此提出 DD 基因型的早产儿与另外两种基因型早产儿相比心肺功能适应性较 差。 美国 Yanamandra 等研究平均孕周 26.4?0.1 周、平均出生体重 869?12g、 经呼吸机治疗的 245 例早产儿,分析 ACE 基因 I/D 多态性与 BPD 发病率 之间 [61] 的关系 。在研究中,所有的患儿生后都需要呼吸机辅助呼吸,228/245 例 93%患儿经外源性肺表面活性物质治疗,其中 DD 基因型 88/245 例(35.9%), ID 基因型 107/245 例(43.7%),II 基因型 50/245 例(20.4%)。这些早产儿被 分为生后 28d 和 36 孕周时的氧依赖和非氧依赖组、达 36 孕周前死亡组和非 死亡组。研究发现,ACE 基因 I/D 多态性对 BPD 的发病率(生后 28d 或 36 周校正孕周时的氧气依赖)或病死率都没有影响。出现这一无相关性结果的 原因,一方面可能是因为对于 BPD 发病率来说,基因因素的影响远不及成熟 度的影响大;另一方面,可能是由于人种的差异(研究中多数是美洲人种, 高加索人种很少,而已有的研究证实美洲人种 ACE 基因 I/D 多态性与 ACE 水 13 北京大学博士论文 平之间没有相关性)。 4、ACE 基因 I/D 多态性与心血管疾病 数年来,研究者们发现RAS在循环系统内稳态上起重要作用,因此ACE基 因I/D多态性在很多成人研究中被称为“心血管疾病的候选基因”。成人疾病的 研究发现DD基因型病人的血管平滑肌张力较其他两种基因型携带者高,对 一 [62] 氧化氮(nitrous oxide,NO)的血管舒张作用反应迟钝 。D等位基因携带者 循环ACE水平的增加,促进脑垂体分泌精氨酸加压素(arginine vasopressin, AVP)和促肾上腺皮质激素(adrenocorticotropic hormone,ACTH),兴奋交感 神经释放去甲肾上腺素,收缩血管;血管局部ACE水平增加,引起局部Ang? 活性增加,其活性增加不仅使BK失活,NO生成减少,血管收缩;而且可以增 加NADH/NADPH氧化酶活性而提高超氧化物水平,并因此降低NO生物活性 [63] ;另外,虽然Ang?在血液循环中的半衰期仅为数分钟,其能促使血管内皮 细胞分泌作用更强而持久的内皮素-1而继续发挥缩血管作用。 新生儿出生后肺呼吸建立,PaO 急剧升高,刺激细胞膜去极化,导致血管 2 平滑肌细胞内游离钙离子浓度升高和内皮素-1生成增加;与此同时,反应性氧 代谢产物促使血管中层平滑肌和外膜产生、释放前列腺素E (prostaglandin E , 2 2 [64] PGE ),动脉导管产生NO样血管舒张因子 。随着PGE 生成减少和破坏增加, 2 2 血栓素大量进入动脉导管,管壁肌肉强烈收缩,动脉导管关闭。早产儿对氧刺 激关闭动脉导管的敏感性低,对PGE 和NO松弛动脉导管的敏感性高,而且早 2 产儿动脉导管平滑肌的收缩能力较足月儿差,易于发生动脉导管未闭(patent [64] ductus arteriosus,PDA) 。 但是,有研究提出动脉导管是否关闭不仅取决于血液中血管舒张与收缩因 14 北京大学博士论文 [65] 子的水平,而且受肺动脉压力和血氧饱和度的影响 。Solari等的研究将13例 并发肺动脉高压的先天性膈疝新生儿设为实验组,与9例没有肺动脉高压的先 [66] 天性膈疝新生儿对照组进行比较 。结果发现对照组II、ID和DD基因型频率分 别是55%、33%和11%,而实验组是15%、15%和70%,DD基因型在并发肺动脉 高压的先天性膈疝组显著增高(P0.05)。研究者解释这一发现认为由于DD 基因型的Ang?刺激血管平滑肌细胞的增殖、分化,在发生“重塑”的肺小动 脉管壁的ACE表达增加,从而产生肺动脉高压。并且,根据Harding等DD基 因 [60] 型的早产儿血氧饱和度相对低的发现 ,DD基因型因为肺动脉压力相对高而 血氧饱和度相对低,而影响PDA的发病率。 5、ACE 基因 I/D 多态性与胰岛素敏感性 胰岛素敏感性降低是胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)的基础,胰岛素 抵抗的定义是机体对胰岛素反应呈亚正常状态,表现为空腹血浆胰岛素水平增 [67] 高和对葡萄糖负荷的不正常的胰岛素反应 。大量的关于胎儿宫内营养状况与 成人期慢性疾病关系的研究提出生命早期的胰岛素敏感性降低与成人期胰岛 素抵抗密切相关,常见于出生时低体重的成年人,是成年期糖尿病、脂质代谢 [6] 异常、高血压和动脉粥样硬化等疾病的代谢基础 。 RAS在胎儿、新生儿的生长和发育过程中起关键作用。研究者们发现在胎 [68] 盘滋养层有RAS受体 ,通过与受体结合,RAS不仅在胚胎植入和胎盘形成 过程起重要作用,而且调控胎盘血流和前列腺素的合成,胎盘RAS功能的紊乱 [69] 会导致胎儿宫内发育迟缓(intrauterine growth retardation,IUGR) 。Forsyth 等发现正常新生儿生后3个月体内的ACE活性不仅与出生体重呈显著负相关(r[70] -0.52;P0.001),而且与胎盘重量有相关性(r -0.30;P 0.02) 。 15 北京大学博士论文 [71] 同时,RAS在胰岛素释放和调节胰岛素敏感性方面发挥着作用 。成人研 究证实血管紧张素转化酶抑制剂(angiotensin converting enzyme inhibitor, ACEI)将提高胰岛素受体的敏感性。但是,迄今为止,ACE基因I/D多态性与 胰岛素敏感性之间相关的关系机理尚未明确。有研究提出胰岛素介导葡萄糖摄 [72] 取及代谢而产生的扩血管作用是其中间机制 。其作用的第一条途径是:糖代 + + + 谢产生乳酸,导致细胞酸化,激活 Na -H 泵,引起细胞内 Na 增高,通过 + + + + + Na -K -ATP酶,K 置换掉Na ,使细胞内K 增加,导致细胞高度极化,通过电 2+ 压依赖通道抑制Ca 内流,减弱平滑肌收缩;第二条途径是:细胞内糖升高, [72] 导致cGMP增加,NO合成增加 。另外一个有争议的问题是究竟哪种等位基因 与胰岛素敏感性受损有关。Perticone等发现I等位基因的表达,使全身ACE活性 下降,增加骨骼肌葡萄糖摄入量及糖原贮存,并增加葡萄糖代谢酶的活性,对 提高胰岛素敏感性起积极促进作用;而DD基因型的ACE水平较高,Ang?长期 维持在较高水平,作用于其受体,引起周围血管收缩,血管平滑肌增殖,血管 内皮损伤,导致骨骼肌摄取、利用葡萄糖的水平下降,易于发生胰岛素敏感性 [73] 受损 。但是Palmieri等发现I等位基因携带者胰岛素敏感性受损的发生率更高 [74] 。这一争议的可能解释是ACE基因多态性只是另外某个相近基因的标记,这 [75] 个基因与血糖代谢异常或胰岛素敏感性相关 。 Cambien等就ACE基因I/D多态性与成年时小于胎龄儿胰岛素抵抗进行研究 [76] 。他们选取出生时足月小于胎龄儿(small for gestational age,SGA)的年轻 人作受试者,以出生时足月适于胎龄儿(appropriate for gestational age,AGA) 的年轻人作对照。当用胰岛素曲线下面积的对数值作为胰岛素抵抗的指数时, 发现SGA组胰岛素抵抗指数明显高于AGA组(SGA组是5.468 ? 0.044,AGA组 是5.288 ? 0.039,P 0.003。在SGA组,II基因型的空腹血糖水平与胰岛素水 16 北京大学博士论文 平呈显著正相关(r 0.539,P 0.0009),而在另外两种基因型没有这种相关 关系,反映了SGA组II基因型的相对胰岛素抵抗。在SGA组三种不同基因型之 间比较时发现, II基因型携带者葡萄糖负荷后30min的胰岛素水平明显高于其他 两种基因型 P 0.05,这一结果提示II基因型的个体更有可能发生胰岛素抵 抗。在SGA组,胎龄越小,II和ID基因型的胰岛素曲线下的面积越大,但在DD 基因型没有类似关系,这提示DD基因型减弱较短孕周和低出生体重产生的远 期影响,因此认为ACE基因I/D多态性与小于胎龄儿的成年期胰岛素抵抗有关。 [77] Akisu等将20例IUGR的足月儿与24例正常新生儿进行比较 。 IUGR组新生 儿的总胆固醇显著高于对照组。两组的Apo-A 的水平相近,但IUGR组Apo-B 1 的水平显著增高。因为ApoB /A 的比值、Apo-B/LDL-C的比值是预测动脉硬化 1 1 的指数,研究发现IUGR组的这两个指数均显著升高(IUGR组分别是0.81?0.32, 0.84?0.21;对照组分别是0.51?0.63,0.68?0.27;P 均小于 0.05)。在IUGR组, II、ID和DD三种基因型频率分别是20%、65%和15%,而在对照组三种基因型 频率38%、33%和29%,IUGR组的ID基因型明显升高。 由此可见,在小于胎龄儿、胰岛素敏感性和ACE基因型三者之间的关系中, 大多数研究证实了小于胎龄儿易于出现胰岛素敏感性受损,但是ACE基因型与 胰岛素敏感性受损和ACE基因型与小于胎龄儿之间的关系仍然存在争议。 6、ACE 基因 I/D 多态性与炎性反应 研究指出受ACE基因调控的ACE与炎性反应之间呈正反馈关系:炎性反应 [78] 刺激临近细胞的ACE表达增加 ,同时刺激单核细胞趋化因子和粘附因子的局 [79] 部表达 ,使更多的炎性细胞聚集而释放更多的ACE,Ang?刺激血管内皮细 [80] 胞释放趋化因子,促进中性粒细胞聚集 。因此,在多个组织器官中,局部ACE 17 北京大学博士论文 [81] 表达起到基础促炎性反应作用,而炎性反应程度与重症疾病的结局有关 。 英国的 Harding等对儿童重症监护病房(pediatric intensive care unit, PICU) [82] 的患儿的研究,证实了炎性反应与 ACE 基因 I/D 多态性之间的联系 。他们 观察 110 例患脑膜炎双球菌性脑膜炎的高加索人种患儿(61 例男性,年龄 4.11?0.45 岁),其中 34 例为 DD 基因型,另外 76 例携带 I 等位基因。与对 照组相比,DD 基因型预示着病死率增加 14%(P0.038),需要强心药物 P =0.030 和呼吸机辅助呼吸(P=0.040)的患儿相对多,而且 PICU 住院时间 更长(P=0.020)。他们又发现根据疾病结局将患儿分为三组后,在不需要 PICU 监护治疗的患儿中 DD 基因型频率是 6% 1/18 例 ,在 PICU 监护治疗 存活的 84 例患儿中 DD 基因型频率是 33%(28/84 例),而在 PICU 监护治疗 死亡患儿中 DD 基因型频率是 45%(5/11 例),DD 基因型频率呈显著增加趋 势(P=0.010)。由此可见,ACE 基因型与感染性疾病的严重程度有关,与 另外两种基因型相比,DD 基因型的患儿病情更重。 最近在美国进行的一个对极低出生体重儿的研究没有发现 ACE 基因 I/D 多态性与细菌感染发病率之间的关系。Baier 等研究 295 例经呼吸机治疗的体 重小于 1250g 的早产儿,DD、ID 和 II 三种基因型一次或多次细菌感染的发病 率分别是 52/113 例(46%)、66/128 例(52%)和 28/54 例(52%),没有统计 [83] 学显著差异(P=0.618) 。三种基因型发生细菌感染败血症的死亡率分别 是 10%、9% 和 14%,也没有统计学差异(P=0.764)。他们分析可能由于研 究中的高加索人种数量很少(234 例美洲人种,58 例高加索人种和 3 例西班 牙人种),并因此推测如果进行较大人群的高加索人种的研究可能会有不同的 结论。 18 北京大学博士论文 7、小结 综上所述,本文介绍了ACE及其基因插入/缺失多态性与肺损伤、心血管疾 病、胰岛素敏感性和感染性疾病关系的相关研究,已有的研究证实了RAS作为 循环激素系统和局部内分泌系统,促使着血管内皮细胞、心肌细胞、成纤维细 胞对刺激因子的信号感知、传递和发生生物学效应。ACE基因作为RAS的重 要 基因参与其调节,可能与肺损伤性疾病、心血管功能、代谢性疾病和机体的炎 性反应有密切的关系,随着对ACE基因插入/缺失多态性逐步深入的认识,其与 新生儿疾病关系的研究也将越来越深入的开展起来。 19 北京大学博士论文 前言 血管紧张素转化酶(angiotensin converting enzyme,ACE)基因位于17号 染色体长臂 2区 3带(17q23),其16内含子长度为287bp的 Alu序列的插入 (insertion,I)或缺失(deletion,D)使ACE基因呈现插入/缺失(I/D)的限 制性片断长度多态现象,即存在I和D两种等位基因以及三种基因型:DD、ID 和II。 ACE基因调控ACE的血浆浓度和活性。 ACE是肾素-血管紧张素系统(renin angiotensin system,RAS)的关键酶,在机体的血压、水电解质稳态方面的调 节起着重要的作用,是RAS以及激肽-缓激肽系统的重要调节因素,影响人体多 种生理机能。 ACE 基因多态性引起 RAS 的活性差异与成人期疾病关系的研究已经进 行了十余年。ACE 基因 I/D 多态性与扩张性心肌病、冠心病、原发性高血压、 高血压性左室肥厚、糖尿病、肾脏疾病、结节病、哮喘和铍中毒等多种疾病 关系的探讨,提示我们 RAS、ACE 基因 I/D 多态性与人类健康和疾病存在广 泛联系,但是在这一领域的儿科研究还很少,而针对新生儿的研究更少。本 课题针对 ACE 基因 I/D 多态性进行研究,分析由于 ACE 基因型的不同而产生 的血清 ACE 水平及 RAS 活性差异与新生儿危重症之间的关系,探讨 ACE 基 因 I/D 多态性与新生儿疾病发生、发展的关系。 生命早期的胰岛素敏感性降低与成人胰岛素抵抗密切相关,出生时的低 体重是成年期胰岛素抵抗和代谢综合症(脂代谢异常、高血压和动脉粥样硬 化等)的基础,ACE、RAS 在胰岛素释放和调节胰岛素敏感性方面有重要作 塞族用,有关 ACE 基因 I/D 多态性与低出生体重及胰岛素敏感性之间的关系 尚存在争议。本课题对 ACE 基因 I/D 多态性与低出生体重及新生儿胰岛素敏 感性之间的关系进行研究,探讨其对胰岛素敏感性的影响。 20 北京大学博士论文 血管紧张素转化酶基因插入/缺失多态性与 新生儿危重症关系的研究 1、资料与方法 1.1 研究对象 1.1.1 入选时间:2002 年 1 月至 2005 年 2 月。 1.1.2 入选方式:按出生时间顺序,可顺利获得血样标本的新生儿进入研究。 1.1.3 分组方式:?正常对照组:本院妇产科出生的正常新生儿;?非危重病 [84] 组:生后 24h 内进入 NICU 的新生儿,按新生儿危重病例评分标准 判定为 非危重病例;?危重病组:生后 24h 内进入 NICU 的新生儿,按新生儿危重病 [84] 例评分标准 判定为危重病例。 1.2 应用标准 1.2.1 新生儿危重病例评分标准:对进入NICU新生儿在入院24h内,检查心率、 收缩压、呼吸、动脉血pH 值、动脉血氧分压、血钾、血钠、血尿素氮、红细 [84] 胞压积、胃肠道表现(有无腹胀或消化道出血 等。并按参考文献 进行新生 儿危重病例评分:分值 ? 90 分为危重,分值90 分为非危重;用镇静剂及麻醉 剂后不进行评分;选24h内最异常检测值进行评分;不吸氧条件下测PaO ;首 2 次评分,若缺项( ?2),按上述草案中评分标准折算评分。符合以下单项指标 [84] 一项或以上者可确诊为新生儿危重病例 :需行气管插管者;严重心律紊乱 者; 弥漫性血管内凝血者;反复抽搐,经处理后抽搐仍持续24h以上不能缓解者; 昏迷患儿、弹足底5次无反应者;体温 ?30 ?或 41 ?者;硬肿面积 ?70 %者; 血糖1.1mmol/ L者;有换血指征的高胆红素血症者;出生体重 ?1000g者。 [85] 1.2.2 疾病诊断标准 :对新生儿呼吸窘迫综合征(NRDS)、新生儿湿肺、动 21 北京大学博士论文 脉导管未闭(PDA)以及酸碱失衡和水电解质代谢紊乱,均符合《实用新生儿 学》(第三版)诊断标准。 1.2.3 观察项目:孕周依据母亲末次月经推算的预产期结合新生儿简易胎龄评 估来确定,出生孕周小于37周者诊断为早产儿,出生体重小于1500g者诊断为 极低出生体重儿。正常对照组新生儿出生后测体重、身长;进入NICU新生儿 测体重、身长,并持续监测脉搏、呼吸、血压、经皮血氧饱和度,定期进行血 糖、血气、电解质检查。准确记录母孕期情况、围产期情况、呼吸机的使用、 转出NICU的天数、住院天数和转归、出院诊断等项目。 1.3 实验方法1.3.1 ACE 基因分型 1 常备实验仪器及设备:高压灭菌锅,Eppendorf 离心管(1ml,0.1ml), 移液器 (0.5~10 μL,0.1~2.5 μL,0.1~1 μL,2~20 μL,100~200 μL 和 200~ 1000 μL),Tip 头(10ul,20ul,200ul,1000ul),三角瓶(500ml,50ml), 量筒(20ml,100ml)。 2 常备试剂及配制 ?1M Tris-Cl(PH 8.0) Tris 碱 121.1g,加蒸馏水 800ml,加浓入 HCl 42ml,混匀,溶液冷却至室温 2 后以浓 HCl 调节 PH 值至 8.0,加蒸馏水定容至 1000ml,在 1.05kg/cm 高 压下 蒸汽灭菌 20min,-20?保存。 ? 0.5M EDTA(PH8.0)溶液 Na EDTA ?2H O 186.1g,加蒸馏水 700ml,边搅拌边加入 NaOH 固体,调节 PH 2 2 2 至 8.0,加蒸馏水定容至 1000ml,在 1.05kg/cm 高压下蒸汽灭菌 20min。 22 北京大学博士论文 ?TE(Tris/EDTA)缓冲液 1M Tris-Cl 1ml,0.5M EDTA 0.2ml,加蒸馏水定容至 100ml,分装后在 2 1.05kg/cm 高压下蒸汽灭菌 20min,室温保存。 1.3.1.1 DNA 提取 1.3.1.1.1 实验仪器及设备 超净工作台-北京昌平长城空气净化工程公司 台式离心机-Eppendorf Centrifuge 5415 DK-8B 电热恒温水浴箱-上海精宏实验设备有限公司 1.3.1.1.2 实验试剂 1 无水乙醇2 异丙醇 3 超纯去离子水(RNase-Free ddH O) 24 全血基因组DNA提取试剂盒Wizard(Wizard Genomic DNA Purification kit, A1120)美国普洛麦格公司产品,含如下试剂: 细胞裂解液 100ml 核裂解液 50ml 蛋白沉淀液 25ml DNA 水化液 50ml Rnase 液 1.25ml 1.3.1.1.3 全血基因组(300?L)DNA 提取步骤 1 取足跟血 300?L(肝素抗凝)。 2 将 900?L 细胞裂解液加入 1.5ml 微量离心管。 3 轻摇盛血管直至完全混合;将血移至含细胞裂解液的管中。颠倒管 5~6 次混合。 23 北京大学博士论文 4 室温孵育 10min(其间颠倒 2~3 次)以裂解红细胞。以 13000~16000 转 离心 20 秒。 5 弃去尽可能多的上层物质而不碰到可见的白斑。大约会有 10~20?L 残余 液。(如果血液是冰冻的,重复上述步骤 1~4 直至斑点为白色。可能会丧失 一些 DNA。) (红细胞或细胞碎片可能与白细胞同时可见。加入斑点中只包含红细胞,去 除上层物质后加入额外部分细胞裂解液,然后重复步骤 4~5。) 6 涡漩混匀管液,直至白细胞重新悬浮(10~15 秒)。 7 在悬浮细胞的管中加入核裂解液 300?L。吹吸溶液 5~6 次裂解白细胞。 溶液变得粘滞。如果混匀后仍可见细胞块,37?孵育直至团块消失。如果 1h 后仍可见,再加入核裂解液 100?L,并重新孵育。 8 任选:加入 Rnase 溶液 1.5?L 至核裂解物中,颠倒混匀管 2~5 次。37? 孵育 15min,冷却至室温。 9 加入 100?L 蛋白沉淀液至核裂解物中,涡漩 10~20 秒。涡漩后可能见小 蛋白块。 10 13000~16000 转离心 3min(应当可见深棕色蛋白块)。 11 将上层液转移至洁净的 1.5ml 含 300?L 异丙醇的微量离心管中。 12 颠倒轻摇溶液直至白色线样 DNA 形成可见团块。 13 13000~16000 转离心 1min。 14 倒出上层液并加入 300?L 的 70%乙醇至 DNA 中。轻轻颠倒管数次,清 洗 DNA 块及微量离心管管壁,13000~16000 转离心 1min。 15 仔细吸出乙醇。此时 DNA 斑块松散,应避免吸到斑块。倒置管至洁净吸 纸上并在室温下干燥 10~15min。 24 北京大学博士论文 16 加入 DNA 水化液(TE 缓冲液)100?L 入管中。4?过夜溶解 DNA。 17 DNA 保存于 2~8?。 1.3.1.2 人基因组 DNA 的 PCR 扩增 1.3.1.2.1 实验仪器及设备 PCR扩增仪:GeneAmp PCR System 9700,加拿大Applied Biosystems公司。 1.3.1.2.2 实验试剂 2+ Taq DNA 聚合酶、10×PCR Buffer(含 Mg )、dNTP 混合液(各 2.5mM)均 为宝生物工程(大连)有限公司产品。1.3.1.2.3 PCR 引物 1