大白鼠提睾肌缺血再灌注后血管内皮细胞的凋亡基因表达

大白鼠提睾肌缺血再灌注后血管内皮细胞的凋亡基因表达 大白鼠提睾肌缺血再灌注后血管内皮细胞 的凋亡基因表达 【关键词】 睾丸 关键词: 睾丸;内皮，血管;细胞;脱噬作用;缺血再灌注 摘 要:目的 研究大白鼠提睾肌缺血再灌后血管内皮细胞的凋亡基 因表达. 方法 以免疫组织化学SP法对大白鼠提睾肌缺血再灌注后血管 内皮细胞Bcl-2，Bax及p53的表达进行观察. 结果 大白鼠提睾肌缺血 再灌注的血管内皮细胞Bax及p53阳性细胞率(分别为83%和87%)明显 高于Bcl-2和对照组(分别为34%和7%)，(P<0.01)，再灌注6h阳性 细胞最多. 结论 大白鼠提睾肌缺血再灌注可引起血管内皮细胞凋亡，并 可能在微循环障碍中起重要作用. Keywords:testis;endothelium， vascular;cells;apoptosis;reperfusion Abstract:AIM To study apoptotic gene expression of the endothelial cells in cremaster ischemia-reperfusion of the rat.METHODS Expression of Bcl-2，Bax and P53in endothelial cells of cremaster ischemia-reperfusion of the rat was investi-gated by means of immunohistochemical SP method.RE?SULTS Positive expression rate of Bax(83%)and P53(87%)was much higher than that of Bcl-2(34%)and con-trol(7%，P<0.01)and reached the hightest level6h after reperfusion.CONCLUSION Ischemia-reperfusion of the cremaster could induce the apoptosis of the endothelial cells and might play an important role in microcirculation disorder. 0 引言 在血管创伤、组织或器官移植中，因术后微循环障碍而使手术失败者 时常发生.术后微循环障碍的产生因素目前认为是血管内皮细胞损伤及其 引发的一系列病理生理改变，其中包括血小板和白细胞的凝集，产生微血 栓、释放促凝因子及缩血管因子等.造成血管内皮细胞损伤的因素很多， 除内毒素、自由基、外科创伤、Ca2+ 超载等外，细胞凋亡已开始受到许 多学者的关注，认为异常的细胞凋亡也可引起血管内皮细胞的损伤及死亡 ,1-3, .在外科创伤修复、组织和器官移植手术中，血流的暂时阻断和 血管吻合后的再灌注是否会引起血管内皮细胞的损伤和凋亡，参与术后微 循环障碍，此方面还未见报道.因此，我们用大白鼠提睾肌微循环缺血再 灌注模型，研究了细胞凋亡相关基因bcl-2，bax及p53在血管内皮细胞 的表达，以探讨缺血再灌注后的血管内皮细胞的凋亡改变及其对微循环的 影响和作用. 1 材料和方法 1.1 动物模型 成年雄性SD大鼠35只，体质量(250?30)g，由本校实验动物中心标准饲养室提供.其中30只平均分为再灌注0.5h，1h和6h3个实验组，另5只动物用做对照实验.实验组动物以10g・L-1 ，ip戊巴比妥钠溶液麻醉后，切开一侧腹股沟区皮肤，显露提睾肌，从提睾肌外侧分离至其根部，寻找发自髂动脉的腹壁阴动脉及所有到提睾肌之小动脉，穿粗线结扎完全阻断血流0.5h后，松开结扎线，恢复血流，分别于再灌注后0.5h，1h及6h经主动脉插管灌流固定，依次灌入9g・L-1 生理盐水150mL和40g・L-1 多聚甲醛250mL，将同侧提睾肌整体取下，置固定液后固定备用.对照组动物除不做血管阻断外，其他操作同实验组. 1.2 试剂 Bcl-2，Bax及p53鼠抗单克隆抗体是MBI公司产品.链霉菌抗生素―过氧化酶免疫组织化学染色超敏试剂盒购自福州迈新公司. 1.3 方法 与血管纵轴垂直切取提睾肌组织块、脱水、包埋及石蜡切片，片厚5μm.切片经脱蜡和水化后，依次以双氧水阻断剂和正常血清室温孵育10min，Bcl-2，Bax(1?40)和p53(1?100)单克隆抗体室温孵育60min，生物素标记第二抗体和链霉菌抗生物素―过氧化酶室温孵育各10min.各步骤间均以0.01mol・L-1 PBS漂洗10,15min.最后以DAB反应5,10min.自来水冲洗终止反应.除p53切片外，其余均以苏木精复染.切片脱水、透明和封片，光镜下观察.对照组动物标本实验方法同实验组.用PBS做阴性对照. 1.4 结果判定及统计学分析 条状血管内皮细胞胞质出现棕黄色颗 2及Bax阳性细胞，血管内皮细胞核出现棕黄色颗粒为p53阳粒状为Bcl- 性细胞.观察10个连续切片血管密集处的5个400倍视野，计数平均100个细胞中的阳性细胞作为凋亡指数，以反映凋亡程度.所得各组数据以x ?s表示，采用χ2 检验分析. 2 结果 2.1 Bcl?2，Bax和p53在血管内皮细胞的表达 Bcl-2和Bax阳性细胞位于血管内皮细胞层，棕黄色阳性颗粒位于胞核两侧窄条状胞质及胞膜内外侧.阳性细胞多者可在血管内皮细胞层形成一整圈棕黄色结构(Fig1).p53阳性产物主要位细胞核，充满棕黄色颗粒的胞核呈椭圆状或 但在胞质及核膜两侧也可见到阳性产物.在提睾梭形突入血管腔(Fig2). 肌再灌注各时间组，p53和Bax的阳性细胞数量明显高于Bcl-2(P<0.05，Tab1).出现阳性表达的血管以中、小血管和肌束间毛细血管为主，血管常呈束状分布. 表1 Bcl-2，Bax及p53在血管内皮细胞的表达 略 2.2 缺血再灌注后不同时间阳性表达比较 Bcl-2，Bax及p53在缺血再灌注各时间组的表达随时间的延长有所增加，特别是Bax和p53虽然在再灌注0.5h即可出现一定量的散在阳性细胞，但在再灌注1h，阳性细胞 明显增多，至再灌注6h阳性细胞数量达到高峰(P<0.01，Tab1)，呈束状中、小血管和肌束间毛细血管，从横断面或纵切面上观察阳性细胞十 分密集，几乎所有内皮细胞全为阳性. 图1 , 图2 略 3 讨论 有研究表明，组织细胞的缺血再灌注损伤是由氧自由基激活并Ca2+ 超载等引起的.但还发现组织细胞缺血再灌注的缺氧可引起ATP水解酶升高而加速ATP水解，使其不能直接利用，从而造成细胞的功能和形态的损伤,4, .另外，Ca2+ 超载还是细胞凋亡的诱导因素,1, .血管内皮细胞的损伤除上述各种原因外，细胞凋亡是近几年受到重视的重要细胞生物学特性，并在细胞的损伤和死亡过程中起重要作用.本实验结果显示，大白鼠提睾肌缺血再灌注各时间内Bax和p53的阳性表达明显高于Bcl-2，而在对照组则阳性细胞很少(P<0.01).研究证明，Bcl-2和Bax通常以二聚体的形式存在，Bcl-2/Bax的比率决定细胞的凋亡与否，高水平的Bcl-2表达说明存在大量的Bcl-2/Bax杂合体，从而能维持细胞的活性，而高水平的Bax表明存在更多的Bax同源体，故能诱导凋亡.p53是一个重要的凋亡调节物，其靶基因就是bcl-2和bax，它的大量表达可诱发凋亡,5-9, .本实验的Bax和p53高表达恰与此规律相符，大鼠提睾肌缺血再灌注可造成血管内皮细胞的过度凋亡.因此提示，在血管损伤修复后的微循环障碍与缺血再灌注后血管内皮细胞损伤和凋亡有关.Bax和p53在 中、小血管和毛细血管的高表达可以说明，缺血再灌注后，最易受到影响 的是向组织细胞提供养分的末端血管，故可能是造成组织器官移植后坏死 及手术失败的重要原因之一. 再灌注0.5h，虽有阳性细胞，但数量不多，再灌注1h后，阳性细胞 明显增多，至再灌注6h达最高水平，特别是Bax和p53更为显著.该结果 提示，血管缺血再灌注血管内皮细胞凋亡发生早且发展迅速，有关血管的 手术中如何防止凋亡的产生和延缓其加剧可能是缓解微循环障碍，提高手 术成功率的重要因素之一.目前对缺血再灌注损伤的防治方法包括中西医 治疗，缺血预处理等,10, ，但缺血再灌注损伤的机制尚未完全清楚， 有关问题还有待深入研究. 参考文献: ,1,O’Brien PJ，Li Go，Locke M，Klabunde RE，Lanuzzo CD.Compensatory up regulation of cardiac SR Ca2+ -Pump by heat-shock counteracts SR Ca2+ -channel activation by ischemia/per-fusion ,J,.Mol Cell Biochem，1997;73:135-143. ,2,Abello PA，Fidler SA，Bulkley GB，Buchman TG.Antioxidants modulate induction of programmed endothelial cell death(apop-tosis)by endotoxin ,J,.Arch Surg，1994;129:134-141. ,3,Wu RQ，Meng XJ.Effect of the endothelial cell on the MODS ,J,，Zhonghua Shiyan WaikeZazhi(Chin J Exp Surg)，1999;16(1):94-95. ,4,Nieminen A L，Saylor AK，Herman B，Lemasters JJ.ATP de-pletion rather than mitochondrial depolarication mediates hepa-tocyte Killing after metabolic inhibition ,J,.Am J Physiol， 74. 1994;267:67- ,5,Xiong CY，Zhang ZC.Apoptosis ,J,.Shengming Kexue(Chin Bull Lif Sci)，1999;11(Suppl):37-41. ,6,Zhang BC，Zhang XH，Wang Z，Huang GS.Expression of Bax and P53 protein in the tissues of liver cirrhosis and hepatocellu-lar carcinonma ,J,.Di-si Junyi Daxue Xuebao(J Fourth Mil Med Univ)， 1997;18(6):567-569. ,7,Zhang HZ，Fan QY，Wang WL，Liu B.Significance of bcl-2， MDM2and nm23gene expression in giant cell tumors of bone ,J,.Di-si Junyi Daxue Xuebao(J Fourth Mil Med Univ)，1999;20(12):1054-1056. ,8,Tang QH，Wang H，Chen BQ，Cong YP，Shao GX，Lei F，Wang WY.Expression and significance of anti-apoptotic gene bcl-2in renal cell carcinoma ,J,.Di-si Junyi Daxue Xuebao(J Fourth Mil Med Univ)， 1999;20(2):141-142，145. ,9,Yan RL，Wang JB，Hui HX，Xin XY，Chen BL.Expression and significance of proapoptosis gene bax in epithelial ovarian tumour ,J,.Di-si Junyi Daxue Xuebao(J Fourth Mil Med Univ)，1998;19 (3):322-324. ,10,Pan Y，Ai YF.Experimental study on the effects of ischemic preconditioning on the survival areas of skin flap ,J,.Di-si Jun-yi Daxue Xuebao(J Fourth Mil Med Univ)，1999;20(11):959-961.