不同浓度腹透液对大鼠腹膜间皮细胞单核细胞趋化蛋白-1的影响

不同浓度腹透液对大鼠腹膜间皮细胞单核细胞趋化蛋白-1的影响 不同浓度腹透液对大鼠腹膜间皮细胞单核 细胞趋化蛋白-1的影响 CHINESEJ.DIAL.&ARTIF.ORGANSVo1.19No.2JUN.2008 不同浓度腹透液对大鼠腹膜间皮细胞 单核细胞趋化蛋白一1的影响 王荔,夏天 【摘要】目的探讨非感染状态下,腹透液(PDF)对腹膜问皮细胞(PMCs)产生单核细胞趋 化蛋白一1(MCP一1)的影响,及其与持续性不卧床腹膜透析(CAPD)相关性腹膜硬化的关系. 将40只大鼠随机分为5组,除正常对照组外分别给予1.5%,2.5%和4.25%PDF及NS腹腔注 射.40ml/d,第15天取标本检测PMCs中MCP一1mRNA达,血清和PDF中MCP一1浓度,腹膜纤维 连接蛋白(FN)的表达.结果3个腹透液实验组PMCs中MCP一1mRNA表达,4.25%腹透液组高 于2.5%组和1.5%组,差异具有显着性(P<0.05);PDF中MCP一1水平和腹膜中FN表达,4.25% 腹透液组最高,但与2.5%和1.5%组比较差异没有显着性.血清中的MCP一1水平在5组中未见 显着差异(P>0.05),且均低于PDF中.FN水平与PMCs中MCP一1mRNA表达和PDF中MCP一1蛋 白质水平均呈正相关.结论高浓度PDF可使PMCs中MCP一1mRNA表达升高.MCP一1升高可能 是CAPD相关性腹膜硬化的原因之一.大量Ns灌入腹腔也可导致腹腔炎症状态. 【关键词】腹膜透析;腹膜硬化;问皮细胞;单核细胞趋化蛋白;纤维连接蛋白 中图分类号:R459.5文献标志码:A文章编号:1005—0809(2008)02—0014—05 EffectsofDifferentC0ncentrati0nsofPeritonealDialysis FluidonMCP-1ExpressionandSecretionofRats PeritonealMesothelialCells WANGLi,XIATian (TheSecondHospitalofTianjinMedicalUniversity,死nnjin300211,China) 【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheeffectofPDFonMCP一1producedbyPMCinnon —infectionsitua— tionsandtheassociationswithCAPDrelatedperitonealsclerosis.MethodsThestudywasperformedon40maleS— Drats,whichwererandomlydividedinto5groups(n=8)andinjectedintraperit0neallywith40ml1.5%,2.5%, 4.25%PDFandNSdailyfor2weeks,andthe5thgroupgavenosolutionascontro1.Onthe15thday,aftera4-hour dwell,theratswereputtodeath,dialysatesamplesandsertunwerecollectedtomeasuretheMCP一1proteinlevelsU— singanELISAkit,peritoneumtissueweretakentocharacterizetheMCP一 1mRNAexpressionbyISHandtheFNaccu— mulationbyICH.ResultsInthe3PDFexperimentalgroups,theMCP一 1mRNAexpressionof4.25%groupwas higherthanthoseof2.5%groupand1.5%group.andthedifferenceswerestatisticallysignificant(P<0.05).The MCP一 1proteinlevelsofPDFandtheFNlevelsofparietalperitonealtissuewereincreasedin4.25%groupcompared withthoseof1.5%and2.5%groups.butthedifiereneehadnostatisticsignificance.TheMCP一1proteinlevelsof 作者单位:300211天津,天津医科大学第二医院 通讯作者:王荔,E—mail:winniewa"gl"977@yahoo.corn.cn 透析与人工器官2008年6月(第19卷)第2期 seruminthewhole5groupsshowednosignificantdifference(P>0.05),andthevaluesofth emwerelowerthanthat ofPDFrespectively.ThecorrelationanalysisbetweenFNandMCP一1ofPDF,andFNandMCP一1mRNAshowedpos— itivecorrelation.ConclusionThestudyconfirmedthathighglucoseconcentrationPDF(4.25 %)causedthehigher levelofMCP一1mRNAexpressionofPMCs.WecanconcludethattheincreasedexpressionofMCP一1maybeoneof thereasonsinducingCAPDrelatedperitonealsclerosis.AlargeanlountofNSinjecteintmper itoneallymayalsoindu— cingpreinflammatorysituationofperitonealcavity. 【Keywords】peritonealdialysis;peritonealsclerosis;mesothelialcells;monocytechemoattractantprotei n一1;fi— hronecti? 持续性不卧床腹膜透析(continuousambulatory perilonealdialysis,CAPD)是终末期肾脏病(end—stage renaldisease,ESRD)患者有效治疗的措施.然而,腹 透液生物不相容性所致的腹膜硬化,仍然是CAPD失 超滤并最终使患者退出腹膜透析的重要原因,其发生 机制尚不完全清楚.CAPD使腹膜问皮细胞增殖,多 种趋化因子,生长因子,黏附分子活化在其中发挥着重 要作用.单核细胞趋化蛋白一1ll(MCP一1)是由单核细 胞,内皮细胞等产生的一种趋化因子.来源于问皮细 胞的MCP一1可激活单核细胞发挥炎症作用,又可刺激 问皮细胞和/或纤维母细胞产生细胞外基质(extracel— lularmatrix,ECM),并通过影响ECM的形成促进纤维 化的发生l.腹膜硬化时ECM的组织学成分包括纤 维连接蛋白(fibroneetin,FN),层粘连蛋白(1aminin, LN)和胶原等.目前MCP一1与腹膜硬化的关系及作用 机制尚不清楚.本研究通过大鼠CAPD模型了解短期 内不同浓度腹透液(PDF)对大鼠腹膜问皮细胞 (PMCs)MCP一1及FN的影响,探讨非感染状态下,腹 透液对腹膜问皮细胞产生MCP一1的作用,及其与 CAPD相关性腹膜硬化的关系. 1材料与方法 1.1建立CAPD模型 雄性S—D大鼠(北京维通利华)40只,体重250, 300g,按体重分层随机分5组,组问体重无差异(F值 0.833,P=0.484),每组8只.分别予1.5%,2.5%, 4.25%腹透液(DianealPD-2,Baxter),40ml/d腹腔灌 液,模拟CAPD环境,另设NS对照组及空白对照组, 常规饲养大鼠,共2周.于第15天给予40ml灌入腹 腔后,保留4h,将动物处死,分别留取大鼠腹膜组织, 血清及腹腔残留液. 1.2HE染色 常规HE染色. 1.3原位杂交染色 1.3.1探针序列(天津灏洋生物制品科技有限公司) 序列:R212GTCGGCTGGAGAACTACAAG AGAATCACCAF058786;探针序列:5一GGTGA TTCTCTTGTAGTTCTCCAGCCGAC. 1.3.2原位杂交染色石蜡切片脱蜡至水,放打孔 液中室温浸泡10min,0.1MPBS洗涤.加复合消化工 作液室温孵育3min,0.1MPBS洗涤.人0.1molfL 枸橼酸缓冲液微波修复5min.加预杂交液,37~C孵育 过夜,0.2×SSC洗涤.加杂交液(含探针),37oC孵育 2,3h,分别2×SSC,0,2×SSC洗涤.加封闭液室温 孵育20min,0.1MPBS轻洗.加小鼠抗地高辛抗体 37~C孵育40min,0,1MPBS洗涤.加高敏链霉亲和素 过氧化物酶复合物37~C孵育40rain,0,1MPBS洗涤. DAB显色,苏木素复染,镜下观察. 1.4免疫组化染色(一步法) 石蜡切片脱蜡至水,人0.1mol/L枸橼酸缓冲液 微波90—00~C修复5min.加3%过氧化氢室温浸泡10 rain,0.1MPBS洗涤.滴加一抗(已标记HRP)浓缩液 l:200稀释,37~C孵育90min,0.1MPBS洗涤.DAB 显色,苏木素复染,镜下观察. 1.5ELISA法 MC—ELISA试剂盒(美国Bioscourse公司)采用双 抗夹心法测定,用酶标仪(奥地利DIGISCANSA1000) 检测大鼠血清及PDF光密度(OD值),带人曲线, 计算出MCP一1浓度. 1,6结果判定 MCP一1mRNA原位杂交阳性信号位于胞浆,以不 含探针的杂交液做阴性对照.FN免疫组化的阳性信 号位于基底膜和细胞外基质,以不含一抗的PBS液做 阴性对照. 原位杂交和免疫组化的结果用显微照相系统(13 本OLYMPUS)拍照,每个标本10张,用图像分析软件 (IPP)分别计算累计光密度值(IOD),求平均值. 1.7统计方法 一 15— CHINESEJ.DIAL.&ARTIF.ORGANSVo1.19No.2JUN.2008 数据用?s表示,组问数据比较用ANOVA分 析.检验水准双侧=0.05.采用SPSS11.5统计软 件进行数据处理和统计学分析. 2结果 2.1HE染色 光镜下见PMCs呈梭形,胞浆粉染,核大,椭圆形, 兰紫色,呈单层连续分布于大鼠腹膜腔面.问皮下结 缔组织厚度及炎性细胞浸润程度不同,问皮细胞层次 无明显变化.(见图1,图2)图44.25%腹透液组(C4400×(脏层腹膜)MCP一1表达 (++)) 图12.5%腹透液组(B8100×)图5NS对照组(I)3400×(脏层腹膜)MCP.1表达(++)) 图2NS对照组(D8400×) 2.2原位杂交染色 PMCs分布于大鼠腹膜腔面,梭形,胞浆内不均匀 黄色颗粒即为阳性信号(见图3,图4,图5,图6).空 白对照组PMCs中几乎无MCP一1mRNA表达,4.25% 腹透液组PMCs中MCP一1mRNA表达水平高于2.5% 组和1.5%组,而NS组高于3个实验组,且组间差异 具有显着性(F值7.512,P<0.001). 图6l性对照 2.3免疫组化染色 PMCs基底膜黄染,ECM中不均匀黄色颗粒为阳 性信号(见图7,图8,图9).空白对照组FN的表达水 平极低,4.25%组壁层腹膜中FN的表达水平高于 2.5%组和1.5%组,而NS组高于3个实验组,但组间 差异没有显着性(F值1.172,P=0.340). 图31.5%腹透液组(A5400×(脏层腹膜)MCP-1表达(+))图7NS对照组(D9400×(壁 层腹膜)F表达《++)) 一 16— 透析与人工器官2008年6月(第19卷)第2期 图84.25%腹透液组((27400×(壁层腹膜)FN表达(++))图9阴性对照 表1四组大鼠MCP一1和MCP一1mRNA水平以及FN水平的比较(?s) 与4.25%组比较?:P<0.05,??:P<O.001;与Ns组比较:P<O.o5,$:P<O.001;与空白组比较?:P<O.05,??:P<O.001. 2.4ELISA结果葡萄糖浓度的PDF对PMCs的MCP一1表达和分泌的 3个实验组中4.25%组PDF中MCP一1水平最高,影响,以及MCP一1与FN的关系.结果高浓度腹透液 而Ns组中也明显升高,且与实验组比较差异具有显组PMCs的MCP一1mRNA表达明显升高,这提示PMCs 着性(F值9.546,P<0.001).血清中的MCP一1水平的MCP一1mRNA表达与PDF浓度有关,短期内即可产 在5组中未见显着差异(F值1.336,P=0.276).四生效应. 组大鼠MCP一1和MCP.1mRNA水平以及FN水平的比葡萄糖诱导MCP.1mRNA上调的机制尚不完全清 较见表1.楚.体外研究发现,高糖代谢产物二酰基甘油(DG)可 2.5相关性分析激活蛋白激酶C(PKC).Haslinger等以特异性PKC 壁层腹膜中FN与腹膜间皮细胞MCP一1mRNA和激活剂可增加MCP一1合成近2倍;以特异性PKC抑制 PDF中的MCP一1均呈正相关(r=0.772,P<0.001;r=剂可完全阻断高糖对MCP一1的诱导,提示高糖诱导合 0.637,P<0.001),与血清中MCP一1无相关性.成MCP一1与PKC途径的介导有关.高糖使MCP一1表 3讨论 目前,在非感染状态下,PDF是使PMCs表达多种 前炎症因子,细胞因子和黏附分子的主要原因.PDF 浓度升高,作用时间延长和剂量加大可使上述因子表 达增高.Haslinger等发现葡萄糖可独立上调 HPMCsMCP—lmRNA及其蛋白质的表达,并且与时间 和剂量有关.离体实验表明高浓度葡萄糖可使PMCs 中MCP一1表达上调,而MCP一1与单核细胞趋化和 ECM增多有关,可能是CAPD相关性腹膜硬化的原因 之一.本实验模拟CAPD过程,比较透析2周时不同 达的增加还可能与核因子一KB(NF—KB)的激活有关. Kato等发现,经脂质A刺激后鼠的PMCs产生MCP. 1显着升高,用NF—KB抑制剂可减少MCP.1mRNA的 表达,用细胞外信号调节激酶(ERK),c.Jun氨基端激 酶(JNK),P38的抑制剂则无此效应.PDF中的葡萄 糖代谢产物AGEs,与其受体结合后产生氧自由基,活 化P21ras/MARK,使NF—KB发生氧化应激反应而被激 活,增加MCP一1的基因转录J. 本研究结果显示,PDF中MCP一1蛋白质水平在 4.25%腹透液组最高,但3个实验组间差异没有显着 性.可能因CAPD时间较短所致.血清MCP一1蛋白 一 17— CHINESEJ.DIAL.&ARTIF.0RGANSVo1.19No.2JUN.2008 质水平在各组问未见明显差异,且均低于PDF中的浓 度.我们推测PMCs中MCP一1表达程度不仅与PDF 浓度有关,而且PMCs是透出液中MCP一1的主要来源. 血清中MCP一1可能与腹膜问皮细胞无关,可能是问皮 细胞以外的来源.这一结果支持CAPD时腹膜问皮细 胞对MCP一1的分泌是局部的,可能主要影响腹膜的病 理生理,而对其他系统影响不大.本实验中,NS对照 组中MCP一1mRNA表达水平和PDF中的MCP一1蛋白 质浓度最高,表明Ns可促进MCP一1mRNA合成及分 泌,这与Styszynski等的研究结果一致.原因可能 是NS中Na+和C1一浓度与PDF中Na+和Cl一浓度 不同,PMCsMCP一1的表达是否与晶体渗透压有关,或 NS与葡萄糖对其影响不同尚不清楚.可能葡萄糖比 Ns抑制腹膜炎症反应和问皮增殖.人的腹膜腔中仅 有约50m1的润滑液,向腹腔中灌入任何液体包括 PDF和NS都可能导致腹膜组织局部结构的改变,都 是非生理的,有害的.我们的动物实验也说明了这一 点. 实验结果显示,FN在腹膜中的表达水平,虽然3 个实验组问差异无显着性,但在相关性分析中,FN与 MCP一1mRNA和PDF中MCP一1蛋白质均呈正相关. 推测MCP一1是FN的上游因子,MCP一1升高使ECM成 分之一FN增多,从而参与了CAPD相关性腹膜硬化 的发生. 通过短期CAPD大鼠模型动物实验,我们推断高 浓度PDF导致CAPD相关性腹膜硬化,可能与腹膜问 皮细胞表达和局部分泌MCP一1增多有关.由于实验 周期短,3个实验组中MCP一1蛋白质水平和FN的表 达尚未见显着性差异,MCP一1与FN问的作用机制仍 不清楚,须在今后的研究中进一步探讨. 参考文献 一 18— 2345678