基质细胞衍生因子1在骨髓间质干细胞归巢到急性梗死心肌中的作用
基质细胞衍生因子1在骨髓间质干细胞归巢
到急性梗死心肌中的作用 2007年6月第33卷第6期Jian~suMedJ,June007'13310. 基质细胞衍生因子1在骨髓间质干细胞
归巢到急性梗死心肌中的作用
庄瑜陈鑫石开虎徐明
【摘要】目的探讨基质细胞衍生因子1(SDF_1)在骨髓问质干细胞(MSCs)归巢到急性梗死
心肌中的作用.方法以免疫组化检测SDF-1在心肌梗死1,2,4,7,14,28d后的大鼠及非心肌梗死
大鼠心肌中的
达差异;于心肌梗死4d后予以SDF-1,抗SDF-1抗体进行干预,同时经尾静脉注射
BrdU标记的MSCs,3d后检测梗死区MSCs的归巢量,28d后检测大鼠心功能状况,以及梗死区及
其周围的血管密度;另设心肌梗死及非心肌梗死阴性对照组.结果SDF-1在心肌梗死后第1天即
升高并达到峰值,以后逐渐下降,第14天恢复至正常水平.心肌梗死组干细胞归巢量明显大于非心
肌梗死对照组.SDF-1处理组大鼠心肌梗死区干细胞归巢量,心功能水平及血管密度大于抗SDF-1
抗体处理组及心肌梗死对照组(P<O.01).结论心肌梗死后早期梗死区SDF-1表达水平升高;
SDF-1能够促进MSCs归巢并改善心功能,促进毛细血管增生可能为其改善心功能的
之一.
【关键词】心肌梗死;骨髓间质干细胞;归巢;心功能;基质细胞衍生因子一1 【中图分类号1R541【文献标识码】A【文章编号10253—3685(2007)06—0579—04
TheefofsI,F-1onmy瑚IsteIIlIlsl10IIliI-gtomyocardialin瞄siteZNGy",
CttF_,NXin,SHlKaihu,eta1.DepartmentofThoracic&CardiovascularSurgery,AffiliatedNanjing
FirstHospital,Nan]ingMedicalUniversity,Naing210006,CHINA
[AStract]ObjectiveToinvestigatetheeffectofstromalcell-derivedfactor-1(SDF-1)on mesenchymalstemcells(MSCs)homingtomyocardialinfarctsiteMethodsSDF-1expressionwas
measuredbyimmunohistochemistryinshamoperatedorinfarctedheartsonthe1st,2nd,4th.7th,14th
and28thdayaftermyocardialinfarction(MI).MSCsfromdonorratswere1abeledwithBrdU.)F_
1,anti-SDF-1antibodyorsalinewasinjectedintoperi-infarctmyocardium4daysafterMI.Then.a
totalof5×
10cellsin2.5m10fPBSorequalvolumePBSalonewereinjectedthroughthetai1veim ThenumberoflabeledMSCsintheinfarctedheartswascotmted3daysafterinjection.Cardiac functionandbloodvesseldensitywereassessed28daysafterinjection.ResultsMyocardialS】)F_1
expressionincreasedandpeakedonthefirstdayafterM1anddecreasedthereafter.whichremained
unchangedinshamoperatedhearts.TheMSCsinthehostheartsweremoreabundantintheMI groupsthanthoseinthenon-MIgroup.whichweremoreintheSDF.1injectedgroupthanthoseinthe
anti-sDF-1antibodyandsalineiniectedgroups(P<0.05).Cardiacfunctionwasimprovedmorein
SDF-1injectedgroupthanthatinanti—
SDF-1antibodyandsalineinjectedgroups(P<0.01).
NeovascularizationinSDF-iectedgroupsignificantlyincreasedthanthatintheothergroups(P<
0.01).ConclusionMyocardialSDF-1expressionincreasesonlyintheearlyphaseafterMI.S
DF-1
mayenhanceMSCshomingtoinjuredheartandimprovecardiacfunctionbypromoting
neovascularization.
[KeywordslMyocardialinfarction;Mesenchymalstemcells;Homing;Cardiacfunction;
Stromalcell-derivedfactor-1 IJiangsuMedJ,血ne2007,33(6):579.582.1 近年来干细胞移植成为治疗心脏病的研究热
点,研究提示骨髓间质干细胞(MSCs)移植能够改
善心脏功能.但移植的MSCs必须归巢到梗死区才
作者单位:210006南京医科大学附属南京第一医院心胸外科 责任作者:陈鑫E-mail:stevecx@jlonline.corn
?
论着?
可能发挥其治疗作用.归巢是一个复杂的过程,研
究提示基质细胞衍生因子一1(SDF-1)在这个过程中 发挥了重要作用卜引.本研究观察了心肌梗死后不
同时段SDF-1的表达变化,探讨其在心肌梗死后
MSCs归巢中的作用.
MedJ,June2007,VoI33.
材料与方法
一
,实验材料
健康雄性F344大鼠(上海斯莱克实验动物有
限公司),体重(240?20)g.胎牛血清(Gbico),IM_ DM培养液(Gbico),SDF-1(peprotech),兔抗大鼠
SDF-1a抗体(USBiologica1),BrdU(Sigma),绵羊
抗大鼠BrdU抗体(USBiologica1),驴抗绵羊IgG 抗体(BethylLaboratoriesINC),兔抗大鼠VIII抗
体(北京中山生物公司),山羊抗兔IgG抗体(北京 中山生物公司).
二,方法
1.MSCs的分离,扩增与标记F344大鼠乙醚 过度麻醉致死,无菌条件下获取双下肢股骨,含 10胎牛血清,双抗(青霉素100U/ml,链霉素100 U/m1)的IMDM培养液冲洗骨髓腔获取全部骨髓, 吸管反复吹打收获的骨髓成细胞悬液.1500r/min
离心10min去除上清和脂肪.PBS液洗涤2,3 次.将得到的细胞用上述培养液调整成2×10. cells/L培养液,接种到50ml培养瓶中,37~C,59,6 CO,95湿度培养.24h首次换液,弃掉未贴壁细 胞,以后每隔3,4天换液1次.细胞70,80 融合后0.125胰蛋白酶室温消化3,4min,2000 r/min离心5min弃上清,细胞沉淀按1:2比例传 代;通过此方法去除造血系细胞.培养21,28d后 的细胞即可移植.
待移植细胞以3/*mol/L的BrdU培养24h后, 用PBS重悬调整成2×10.cells/ml,置于冰上等待 移植.
2.心梗模型大鼠乙醚麻醉诱导后,氯胺酮 100mg/kg腹腔注射持续麻醉,气管插管呼吸机 (ALC—V8型动物呼吸机,上海奥尔科特公司)支持 呼吸,心电图仪行心电监测.左侧开胸切口,在房室 边缘下方,左心耳与动脉圆锥交界处进针以6-0 Prolene线缝扎左前降支.结扎后可见左室前壁失 去原有光泽,变苍白,并出现搏动减弱,心电监测见 ST段及Q波改变,证实制作心肌梗死模型成功. 观察3,5min,循环稳定后关胸,继续饲养.非梗死
组仅做开胸手术.
术后5h所有心梗大鼠行超声心动图检查,左 室射血分数<50者进入实验,>50者排除. 3.动物分组及处理方法大鼠随机分为检测 组(一65)与处理组(一64).检测组分别于心肌 梗死前及心肌梗死后1,2,4,7,14,28d随机处死5 只行SDF-1蛋白表达量检测(一5),同期设立假手 术对照组(一5).处理组再分为4小组(一16):梗 死大鼠+SDF-1组,梗死大鼠+抗SDF-1组,梗死 大鼠+生理盐水组及正常大鼠+生理盐水组.心梗 模型建立4d后,梗死大鼠+SDF-1组于心肌梗死 区及周围5个区域均匀注射重组SDF_1(400ng/m1)
各10l,梗死大鼠+抗SDF-1组经尾静脉注射抗 SDF-1抗体(2/*g/m1)1ml,梗死大鼠+生理盐水组 于心肌梗死区及周围5个区域均匀注射生理盐水各 10l,正常大鼠+生理盐水组于心肌梗死区及周围 5个区域均匀注射生理盐水各10l.各组大鼠于1 h后,将标记好的MSCs(5×10.个细胞)经尾静脉 注入.干细胞移植72h后,每组随机挑选8只大 鼠,戊巴比妥钠(50mg/kg)腹腔注射麻醉后,经主 动脉注入质量分数为10的氯化钾2ml,使心脏停 搏于舒张期.剩余大鼠继续饲养4周后采用相同的 方法处死.大鼠处死后立即开胸取出心脏. 4.SDF-1蛋白表达的免疫组化检测4多聚 甲醛磷酸盐缓冲液固定心脏,脱水,石蜡包埋,4/*m 厚,间隔100/*m与心脏长轴垂直切片,按试剂盒说 明操作.利用ImageproPlus5.0图像分析系统,随 机选择梗死区及周围10个200倍视野,测定SDF一1 阳性面积(PA)及累积光密度(IoD),结果以平均光
密度值(MOD)表示,MOD=IoD/PA. 5.BrdU阳性细胞计数标本固定切片方法同 上,进行BrdU标记MSCs的免疫组化染色.每张 切片随机抽取梗死区及周围10个200倍视野,计数 每个视野内细胞核BrdU阳性MSCs的平均数. 6.血管密度检测标本固定切片方法同上. 免疫组化检测VIII因子表达,每张切片随机抽取梗 死区及周围10个200倍视野,计数每个视野内血管 数目的平均数.
7.心功能测定梗死模型建立前,细胞移植前 及细胞移植后28d行大鼠心脏超声(SoNOS5500 超声心动图机,11.5MHz探头)测量心肌缩短分数 (FS),射血分数(EF),所有指标均测量三个心动周 期,取其平均值.检查前予氯胺酮50mg/kg镇静. 三,统计学处理
计量数据均以均数土
差(?s)表示,以 SPSS13.0分析软件进行方差分析,P%0.05为差异 有显着意义.
结果
一
,梗死区SDF-1的表达量
2007年6月第33卷第6期ILjQQZ2Q12? SDF-1梗死后第1天即升高并达到峰值;以后 逐渐下降,第14天恢复正常(图1).
二,不同处理组MSCs的归巢量
SDF-1处理组MSCs归巢量明显多于其他组, .2s
.2
s
参?
..5
0
正{l}ld2d4d?dI4d28d 梗死后时间
与正常对照组比较,P<O.O1 与假手术对照组比较,#P<O.O1 图1心肌梗死后SDF-1表达量的变化
梗死鼠+sDF—l蛆梗死丈黛+执一sDF—l蛆梗死丈鼠+生理盐枣组节丈鼠+生毫盐
水组
与正常大鼠+生理盐水组比较,P<O.O1 与梗死大鼠+生理盐水组比较,#P<O.O1 与梗死大鼠+抗SDF-1组比较,P<O.O1 图2不同处理组MSCs归巢量
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与正常大鼠+生理盐水组比较,P<O.O1 与梗死大鼠+生理盐水组比较.#P<O.O1 与梗死大鼠+抗SDF-1组比较,P<O.O1 图3不同处理组新生血管密度
SDF-1抗体处理组MSCs归巢量不如生理盐水处理
组.正常对照组仅少量MSCs归巢(图2). 三,血管密度
MSCs移植联合SDF-1心肌注射的大鼠新生血 管密度高于其他梗死大鼠.而抗SDF-1抗体干预 组大鼠不如生理盐水组.正常对照组大鼠新生血管 明显少于其他组(图3).
四,心功能(表1)
各组大鼠梗死前,梗死后及细胞移植28d后的 EF及FS变化MSCs移植联合SDF-1心肌注射 的大鼠心功能恢复优于其他梗死大鼠.而抗SI)F一1 抗体干预组大鼠心功能不如生理盐水组,但两者间 尚未发现统计学差异.正常对照组大鼠心功能变化 不大.
表1各组大鼠EF及FS变化(%)
与模型建立前比较,*P<O.01与细胞移植前比较,#P<O.01与细移植前比较,?
P<o.01与正常大鼠+生理盐水组比较,
AP<O.O1与梗死大鼠+SDF1组比较,AP<O.O1
讨论
干细胞移植是治疗缺血性心脏病的又一选择, 有多种细胞亚型及移植方法可供选择,但是它们都 涉及到一个中心问题,移植后的干细胞能否归巢到 目标组织中.这与干细胞自身特点及目标组织中的 局部反应,各种细胞因子的表达有密切关系. SE}F-1属于CXC类趋化因子,心肌梗死后早期 表达明显升高_】.],主要表达于造血干细胞表面;其唯 一
受体为CXCR4.Kahn等[4]实验发现SDF-1能促 进表达C)R4的CD34+细胞迁徙,归巢.而Bhakta 等[5]在体外实验中通过对MSCs转染CXCR4基因,
增加MSCS表面Q(CR4的表达,大大增加了SDF-1 对MSCs的趋化作用.Yigang等[6]在一项大鼠性别 错配心脏移植,心肌梗死动员干细胞的试验中亦观察 到了类似的结果:SDF-1于急性心肌梗死后24小时 .
达到峰值,并可能通过与CXCR4的作用促进骨髓干 卤
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UMedJ,June2007,Vol33,N0.6 细胞归巢到梗死心肌组织中.所有这些均揭示了 SDF-1在1VkSCs归巢中的趋化作用.
Ma等[1]在SD大鼠心肌梗死模型中发现:心肌 梗死后第1天梗死区SDF-1的含量显着升高并达 到峰值,随后逐渐下降,但持续时间较本实验为短.
这提示心肌梗死后SDF一1的表达存在一个明显的 时间窗,若要利用SDF-1的效应来治疗心肌梗死, 就要把握住这个时间窗;除非重建梗死区SDF-1的 表达.Askari等[2]已经在Lewis大鼠中发现SDF-1 的表达在心肌梗死后56天恢复正常,而在梗死区重 新建立SDF-1表达后诱导了动员的CD117+千细胞 归巢到梗死心肌中.
本研究中,与其他三组相比,梗死区注射S【)F_1 后明显增加了静脉移植MSCs的归巢及新生毛细血 管数,同时心功能也有改善.这提示心肌梗死后外 源性SDF-1能够促进MSCs归巢并改善心功能. 生理盐水注射组可见较多的MSCs归巢及新生毛细 血管,同时心功能也有明显改善.提示心肌梗死后 存在内源性SDF-1促进了MSCs的归巢..而注射 了SDF-1抗体的大鼠中,MSCs归巢量,新生毛细血 管数及心功能虽有提高,但还不如单纯生理盐水注 射组大鼠.这提示促进MSCs归巢的因子可能不止 SDF-1一种,同时还存在其他类似作用的因子;或者 注射的抗体未能完全阻断SDF-1的趋化作用;确切 机制仍有待于进一步的研究.
本研究观察到正常无梗死组大鼠中也有少量移 植的MSCs出现在心肌内,并有血管新生,其原因可 能为注射生理盐水时造成心肌部分刺伤,产生了炎 症反应,诱导了部分移植的MSCs迁徙到炎症区域; 但这部分MSCs并未对大鼠心功能产生明显影响. Abbott等..也发现无心肌梗死小鼠中无论有无 SDF-1的表达,都仅有少量的骨髓千细胞迁徙到心 肌中,与心肌梗死组有明显差异;提示千细胞归巢不 只是需要SDF_1的趋化作用,心肌梗死区域的存在
本身就具有重要作用.
与MSCs的归巢相对应的是我们观察到: MSCs数量愈多,心肌中新生的血管密度愈高;与 Ma等[1]的实验结果相似.这提示归巢到梗死区移 植的MSCs能够促进血管新生,而血管新生可以增 加梗死区及周边区域血液供应,可能挽救梗死后的 顿抑或冬眠心肌,抑制梗死后心肌细胞进一步凋亡, 改善心肌重构,从而改善心功能.
心肌梗死发生后,损伤局部存在炎症反应,可生 成多种细胞因子如白细胞介素8(IL-8),单核细胞 趋化蛋白1(MCP-1),SDF一1,肿瘤坏死因子 (TNF),转化生长因子(TGF)等,同时血管内皮细 胞多种黏附分子表达上调,促进了炎症细胞的浸 润,同时也对血管新生产生了重要作用[.本实 验也观察到心脏周围炎症粘连组织中也有BrdU十 细胞,新生血管较多,这也提示炎症反应不只趋化炎 症细胞,对MSCs产生损害作用,炎症反应后产生的 细胞因子等对移植的MSCs也有趋化作用,这也可 能是正常组大鼠心肌中检测到MSCs的原因之一. 这提示MSCs移植联合炎症调节治疗可能是一个可 行的治疗方案.
综上所述,心肌梗死后早期梗死区SDF一1的表 达明显增高.而SI)F一1可以促进MSCs归巢到损 伤心肌中并且提高心功能,促进血管新生可能为其 改善心功能的机制之一.
参考文献
E13MaJ,Gej,ZhangS,eta1.Timecourseofmyocardial
stromalcell-derivedfactor1expressionandbeneficialeffects
ofintravenouslyadministeredbonemarrowstemcellsinrats
withexperimentalmyocardialinfarctionEJ].BasicResearch
inCardiology,2005,100(3):217—223.
[2]AskariAT,UnzekS,PopovicZB,eta1.Effectofstromal—
cell-derivedfactor1onstem-cellhomingandtissue regenerationinischaemiccardiomyopathy[J].Lancet,2003, 362(9385):697—703.
[3]AbbottJD,HuangY,LiuD,eta1.Stromalcell-derived factor-laplaysacriticalroleinstemcellrecruitmenttothe heartaftermyocardialinfarctionbutisnotsufficienttoinduce homingintheabsenceofinjury[J].Circulation,2004,I10 (21):3300—3305.
[4]KahnJ,BykT,Jansson-SjostrandL,eta1.Overexpressionof CXCR4onhumanCD34+progenitorsincreasestheir proliferation,migration,andNOD/SCIDrepopulation[J]. Blood,2004,103(8):2942—2949.
[5]BhaktaS,HongP,KocQThesurfaceadhesionmolecule CXCR4stimulatesmesenchymalstemcellmigrationto stromalcell—derivedfactor-1invitrobutdoesnotdecrease apoptosisunderserumdeprivationE1].CardiovascRevasc Med,2006,7(1):19—24.
1-6]YigangW,KhHH,NaumanA,eta1.Evidenceforischemia inducedhost-derivedbonemarrowcellmobilizationinto cardiacallografts[J].JMolCellCardiol,2006,41(3):478—
487.
[7]FrangogiannisNG,SmithCW,EntmanME.Theinflammato—
ryresponseinmyocardialinfarction[J].CardiovascRes, 2002,53(1):31—47.
[8]FrangogiannisNG,MendozaLH,LewallenM,eta1.Induc—
tionandsuppressionofinterferon-inducibleprotein10in reperfusedmyoc4rdialinfarctsmayregulateangiogenesis[j].
FASEBJ,2001,15(8):1428—1430.
(收稿日期:2006-09—26)(供稿编辑:周宝泉)