左卡尼汀对脑缺血再灌注损伤的抗氧化作用及其机制研究.doc

左卡尼汀对脑缺血再灌注损伤的抗氧化作用及其机制研究.doc 左卡尼汀对脑缺血再灌注损伤的抗氧化作 用及其机制研究 【摘要】 目的:观察左卡尼汀对脑缺血再灌注损伤的保护作用，探 讨其作用机制。方法:健康雄性Wistar大鼠40只，随机分成4组: 假手术组、生理盐水对照组、左卡尼汀100 mg/kg治疗组及左卡尼 汀200 mg/kg治疗组，每组10只。采用线栓法制备大脑中动脉缺血 再灌注模型，缺血2 h，再灌注24 h，观察左卡尼汀对脑组织丙二醛 (MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)含量的影响，HE染色观察大鼠脑组 织的病理改变。结果:左卡尼汀可明显减少MDA的含量，升高 SOD活性，同生理盐水对照组相比，P<0.01。结论:左卡尼汀对 脑缺血再灌注损伤有保护作用，与提高脑组织中抗氧化酶活性、抑 制氧自由基产生及脂质过氧化反应有关。 【关键词】 左卡尼汀;脑缺血再灌注;丙二醛;超氧化物歧化酶 Abstract Objective:To investigate the protective effects of levocarnitine on cerebral ischemia reperfusion(I/R)injury in rats and analyze the mechanism of action of levocarnitine in preventing and treating ischemic cerebrovascular disease.Methods:Forty healthy male wistar rats were randomly allocated into four groups:sham operation group，saline controled group，treated with 100 mg/kg of levocarnitine group and treated with 200 mg/kg of levocarnitine group， each of ten rats.The models of the focal cerebral I/R rats were made by the middle cerebral artery occlusion(MCAO)except sham operation group.After ischemia for 2 h and reperfusion for 24 h， malondialdehyde(MDA)levels and superoxide dismutase(SOD) activity were measured in the cerebral tissues.The pathological feature of cerebral tissue was detected by HE staining.Results:Levocarnitine injection significantly suppressed MDA levels，prevented reduction of SOD activity in comparison with the saline controled group(P<0.01).Conclusion:The results demonstrated that levocarnitine has a potent neuroprotective effect against cerebral I/R induced injury to enhance the activity of the antioxidant system and decrease the incidence of free radical induced lipid peroxidation in rat brain. Key words levocarnitine;cerebral ischemia reperfusion;malondialdehyde;superoxide dismutase 本实验通过观察左卡尼汀对大鼠脑缺血再灌注脑组织超氧化 物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)水平的影响，探讨其对脑缺血再灌 注损伤的保护作用及可能的作用机制，为临床应用左卡尼汀治疗脑 梗死提供理论依据。 1 资料与方法 1.1 动物与试剂 选健康雄性Wistar大鼠(山西医科大学生理实验室提供)40只，鼠龄3,4个月，体重200,250 g。注射用左卡尼汀(珠海亿邦制药有限公司，批号:20090102);SOD和MDA试剂盒(南京建成生物研究所);普通试剂由山西医科大学实验中心提供。 1.2 方法 1.2.1 实验分组及给药方法 40只Wistar大鼠，随机分为假手术组(A组)、对照组(B组)、左卡尼汀100 mg/kg治疗组(C组)、左卡尼汀200 mg/kg治疗组(D组)，每组10只。B组制作模型前30 min予生理盐水1 mL腹腔注射;C组、D组制作模型前30 min分别以100 mg/kg、200 mg/kg左卡尼汀腹腔注射。 1.2.2 大鼠局灶性脑缺血(MCAO)再灌注模型制作 用改良Longa法[1]建立大鼠右侧大脑中动脉缺血再灌注模型。将大鼠用10%水合氯醛3 mL/kg腹腔麻醉，颈正中右旁开0.5,1 cm切口，钝性分离右侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉，结扎颈外动脉、颈总动脉近心端，在颈总动脉距离分岔口大约5 cm处用眼科剪剪开一小口，将直径0.236 mm的进口鱼线插入，以分岔口处开始测量距离，插入1.8,2 cm后固定鱼线，缝合。缺血2 h后将线栓拉出1 cm左右即可，形成再灌注。其中假手术组插入1.0 cm鱼线，其余步骤同实验组。神经功能缺陷评分按照Longa等[1]的5级4分法。 1.2.3 脑组织病理切片的制备及MDA和SOD含量的测定 各组大鼠缺血2 h再灌注24 h后行神经功能评分后颈椎脱臼处死，在冰盘上快速取脑，置0,4?生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，各组随机取2只大鼠右侧脑组织迅速固定，石蜡包埋后，在海马部位做矢状切片，厚约5 μm，HE染色，观察组织学变化。剩余右侧脑组织加入9倍量的0,4?生理盐水，在冰水浴中用玻璃匀浆器制成10%的脑匀浆，3 000 r/min离心15 min，取上清液检测MDA和SOD。严格按试剂盒说明书步骤要求操作，计算出MDA和SOD含量。 1.2.4 统计学方法 采用SPSS13.0软件包，数据以?s示，采用单因素方差进行统计学处理。P<0.05为差异有统计学意义。2 结 果 2.1 光镜下HE染色结果 A组大脑皮质及海马神经细胞形态基本正常。B组神经细胞 变性坏死明显，胞体肿胀，周围间隙增宽，结构不清，出现不同程度的核深染、核固缩、核溶解。C、D组神经细胞呈轻度缺血改变，变性坏死不明显，胞体呈轻度肿胀，神经细胞缺失较B组轻。 2.2 各组脑组织MDA、SOD含量比较 与A组比较，B组3种ATP酶的活性均明显降低，差异有统计学意义。C组、D组与B组比较差异有统计学意义。C组与D组比较SOD活力差异有统计学意义(见表1)。表1 左卡尼汀对大鼠脑缺血再灌注后脑组织SOD、MDA含量的影响 3 讨 论 脑缺血再灌注后导致缺血区自由基增多，过多的自由基与脑组织生物膜不饱和脂肪酸发生脂质过氧化连锁反应[2]，使脑组织生物膜受到损伤，从而引起细胞水肿、损伤直至死亡。MDA是脂质过氧化产物之一，其含量间接反映了细胞受自由基攻击的脂质过氧化程度，是目前公认的判别脂质过氧化的参数指标。SOD是体内最有效的氧自由基清除剂，对机体的氧化与过氧化平衡起着至关重要的作用，通过清除超氧阴离子自由基后保护神经细胞免受损伤。MDA、SOD活性高低可间接反映机体清除自由基的能力。 左卡尼汀又名左旋肉碱，是存在于机体组织内的一种特殊氨基酸，其基本生理功能是转运脂肪酸进入细胞线粒体，通过β 氧化进入三羧酸循环，为细胞提供能量。近年来发现左卡尼汀在体外和动物模型对治疗细胞缺血 再灌注损伤方面具有自身的优势和特点，是一类有效的细胞缺血 再灌注损伤的治疗药物。研究表明左卡尼汀通过阻断缺血性脑损伤病理生理机制的多个环节而发挥脑保护作用[3]，且通过新型有机阳离子转运蛋白2很容易通过血脑屏障[4]。Gokhan等[5]在四血管闭塞造成短暂性脑缺血模型中，左卡尼汀降低脑组织MDA，提高SOD、谷胱甘肽、海马CA1和CA3区神经元细胞数，表明左卡尼汀具有抗氧化性清除氧自由基的作用。Xie和Zeng[6]用含有左卡尼汀的K H液灌注心脏，发现左卡尼汀组ATP、SOD和糖原水平均增加，MDA、乳酸脱氢酶和肌酸磷酸激酶浓度下降，认为左卡尼汀对缺血再灌注有保护作用，可能是其防止能量损耗和抗氧化作用。此外，左卡尼汀通过维持线粒体通透性转换通道，保持线粒体呼吸链的正常功能，阻止线粒体自由基的产生，对神经细胞产生保护作用[7]。在低氧情况下，左卡尼汀通过激活转录活化因子Nrf2的表达，刺激产生大量的抗氧化基因和促进血红素加氧酶的分泌;通过激活酪氨酸A(TrkA)受体，扩大Nrf2抗氧化的能力，降低自由基生成、脂质过氧化和蛋白质氧化，提高谷胱甘肽的水平，从而起到抗氧化保护神经细胞的作用[8]。 本实验建立大鼠脑缺血再灌注模型，结果显示，生理盐水对 照组大鼠再灌注24 h后脑组织SOD活性较假手术组显著下降，而MDA含量显著升高，表明脑缺血再灌注后自由基大量生成，同时机体的自由基防御系统如SOD等抗氧化物功能受损，不能有效清除自由基，自由基大量堆积并攻击富含磷脂的细胞膜，使膜结构破坏，细胞肿胀坏死，脑组织发生脂质过氧化损伤，功能受损。而左卡尼汀治疗组与生理盐水对照组比较，脑组织SOD活性相对升高，MDA含量明显下降，说明左卡尼汀能清除自由基，提高脑组织中SOD活力，减轻脂质过氧化损伤，进而减轻再灌注损伤，保护神经细胞功能。 综上所述，左卡尼汀是一种有效的氧自由基清除剂，对脑缺血再灌注损伤具有保护作用，其机制可能与增加自由基清除酶SOD活性，抑制脂质过氧化反应，降低MDA含量有关。左卡尼汀属内源性物质，安全性高，不良反应发生低，目前临床上已广泛应用于透析、心绞痛、充血性心力衰竭、心源性休克等患者的治疗。本实验证实左卡尼汀能有效地清除脑缺血再灌注后的自由基，对缺血再灌注损伤的神经细胞产生保护作用，是一种有效的脑保护剂。因此，在目前对缺血性脑血管疾病尚无特效治疗措施的情况下，左卡尼汀的治疗作用值得进一步探讨。 【