【doc】7和组织抑制因子-2表达与遗传性非息肉病性大肠癌患者肿瘤侵袭转移关系的研究

【doc】7和组织抑制因子-2表达与遗传性非息肉病性大肠癌患者肿瘤侵袭转移关系的研究 7和组织抑制因子-2表达与遗传性非息肉病 性大肠癌患者肿瘤侵袭转移关系的研究 2006年l2月19日第86卷第41翅au丛塑!!!竺::!t 基质金属蛋白酶-7和组织抑制因子一2表达与遗传性 非息肉病性大肠癌患者肿瘤侵袭转移关系的研究 顾国利王石林李捷雷魏学明黄蓉蓉 遗传性非息肉病性大肠癌(hereditary nonpolyposiscolorectalcancer,HNPCC)是一种显性 遗传性综合征].因其病因特殊,临床病理特点突 出[24.,HNPCC成为大肠癌研究的热点.虽然 HNPCC的发病年龄早,病理分化差,多原发癌多见, 但其预后却明显好于散发性大肠癌.原因 为[7]:在获得诊断时HNPCC比散发性大肠癌的侵 袭更弱,转移更少.基质金属蛋白酶_7(MMP一7)和 组织抑制因子.2(TIMP-2)是诸多参与大肠癌侵袭, 转移过程的重要因素之一.MMP一7通过分解基 底膜和细胞外基质造成肿瘤的侵袭,转移,而TIMP一 2则是其特异性抑制物.机体内活化的MMP-7/ 因此也 TIMP.2的平衡关系决定着MMP-7的活性, 影响肿瘤的侵袭,转移.我们采用免疫组织化学sP 染色法检测MMP-7,TIMP.2在HNPCC和散发性大 肠癌患者肿瘤组织中的表达,探讨其与HNPCC特 殊生物学行为的关系. 一 ,对象与方法 1.对象:选取1980年5月至2005年6月北京 空军总医院普通外科收治的HNPCC患者30例组成 HNPCC组;全部病例均符合AmsterdamII标准J. 随机选取同期收治的年龄?60岁,没有家族遗传倾 向和多原发癌的散发性大肠癌病例30例组成对照 组.HNPCC组和对照组病例的临床资料见表1. 选取两组病例的大肠癌组织石蜡块切片染色. MMP-7鼠抗人单克隆抗体工作液(克隆系1D2,编 号ZM-0334),TIMP-2鼠抗人单克隆抗体工作液(克 . 短篇论着. 隆系3A4,编号ZM-0431),SP试剂盒购自北京中杉 金桥生物公司.免疫组织化学染色由LABvision Autostainer360自动染色仪系统(福建迈新公司)程 控完成,显微镜下图像由OlympusDp70图像采集分 析仪进行采集.以上设备由空军总医院病理科 提供. 2.方法:采用免疫组织化学sP染色法,按说 明操作.TIMP一2组以pH9.0的1mmol/L依地 酸二钠(EDTA)进行抗原热修复,MMP-7组不需抗 原修复.磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作阴性对 照,已知阳性切片作阳性对照.MMP-7,TIMP一2均 定位于细胞质,依据染色强度和阳性细胞率来计算 评分.染色强度:0为无染色;1为染色弱;2为中等 染色强度;3为染色强.阳性细胞率:0为<1%, 1为<10%,2为<50%,3为<80%,4为?80%. 以染色强度与阳性细胞率之和计算评分,0,2分为 阴性(一),3,5分为阳性(+),6,7分为强阳性 (++).评分过程由两名高年资病理科医生独立 完成. 3.统计学分析:应用SPSS13.0统计软件进行 统计分析.数据用面?s表示,组间比较采用计数资 料的x检验,相关性分析采用Spearman等级相关 分析,P<0.05为差异有统计学意义. 二,结果 1.MMP-7,TIMP.2在HNPCC组和对照组中的 表达:MMP-7阳性表达主要在肿瘤细胞的细胞质, 部分细胞膜染色,肿瘤间质不染色或浅染.镜下可 表1HNPCC组和对照组病例临床资料 注:HNPCC为遗传性非息肉病性大肠癌 作者单位:100036北京,空军总医院普通外科 通讯作者:顾国利,Email:kT~o,.gl@163.tom 200612月19l_镕86转旃7MNot1MeIJJc】iD~emherL?,:0.vI86,n47 见肿埔细胞质内出现棕黄也粒(I】HNPCC 组MMP一7的阳性表达率为47%(I4/30).其.强阳 眭率为10%(3/30)对照组MMP-7的I性表达阜 为87%(26/30).中强阳比率为33%(10/30) 对照组VIMP-7阳性表达牢和表达强度叨显高于 HNPCC组(P(00I)(丧2)T1MP-2阳性表达在 肿瘤细胞的细胞质,肿瘤问质浅染镜下可见肿瘤 细胞匝内出现棕黄色颗粒(图2),其染色强度低于 M?’一7肿瘤细胞的表达.lrIMP.2肿瘤质的 染色强度高rMMI-7在肿瘤问质的表达HNPCC 组TIMP-2的阳性表达率为63%(I9/30).其中强阳 性率为I33%(4/30)刘J{f!组T]MP-2的刚性表达 率为20%(6/30),均为一般阳性(十)对照组 不MI)-2的表达享和襄逃强度明显低HNPCC 【(P(00I)(表3), 表2MMI’-7庄[INPCC组和剥中的袁过 蛆踟觳—堑查%)评州… IINPCC30I6II347(14/3(】)32?I5 “?3(14I1087f26/30]46?l6 注括性例例数.HNICC组H组MMI.-7? 性表造转=108P<0Ol 表3FIMP-2HNICC组和对l暖组中的表达 蛆剐硎数—.童口I率(%)”(…) IINPCC组3”I1l5463fI9/30)37?I6 ?组3?246n2(If6/30123?07 :q?性例牧/总删数,HNPQC与?I]MP-2 性丧J鞍,=il6r’00I 2?MP7TI?l一2与HNPCC组和对照组临床 病理特征的关系:在HN[CC纽和埘照组均显示: MMP-7T1MP-2的性表逃率与肿瘤n々侵袭深度和 转移与否膏切相关(P(0<)5),与瘤的大小和部 情无两纰巾侵犯浆膜外组纵和响转移眚的 MMI-7阳性丧丛牢明显高于侵弛限于浆膜及内 和无转移者(』<005)而MP-2在侵犯限J浆 膜发以内和无转移辑中的阳性率叫高于侵犯浆雌 外组织和有转移者(P(005)无淋结和远处转 移的病例巾,MMP-7往HNI’CC组的l件表达率明 显低]对照组(<005).而TIMP-2的阳性表达率 明显高j对照fl(P<005)侵犯浆膜外的病例 巾,I’IMP-2在I1NPCC组的裘达旰I性率高于对J!{{ (P(005)(表4) 表4IINPCC}ft对组k腑蚵患杆陆床病碰特征 与MWP-7T_MI’0柱选的关系 :’纽向盖鞍.P(o05.却丰H『坝鞍.P《 00 目l?jc荷腑?MMI?7的表逃cSP也x20011A:MMI,7在…(晦厦【_m啦标前乜粒丹封丑雌色间峨 , 维或涟);lHMMI’7表选酬胞质把膜丰出现棕黄色柑阃廊f漆或辈)闰2IINPCC臆青腑商-rIMP- 2舫壹 包’包200)2A:?MPt蠢逃(J装H现棒也瓢粒,阃质浅m):2B:TI0造船性c胞浆束山脚标黄色啊粒,目 n业挂1 2006年12月19Et第86卷第47期NailMedJChina,December19,2006,Vol86,No.47 3.MMP-7,TIMP-2在HNPCC组和对照组内表 达的相关性:HNPCC组有9例(30%)MMP-7,TIMP一 2同时阳性表达,MMP-7(+,++)/TIMP-2(一)有 5例(占17%),MMP-7(一)/TIMP-2(+一++)者 各有1O例(各占33%).对照组中有6例(20%) MMP-7,TIMP-2同时阳性表达,MMP-7(+,++)/ TIMP-2(一)者有2O例(67%).没有MMP-7(一)/ TIMP-2(+,++)病例.两组中MMP-7(+, ++)/TIMP-2(一),MMP-7(一)/TIMP-2(+,+ +)病例差异有统计学意义(P<0.01).MMP-7, TIMP-2在HNPCC组和对照组中的表达呈明显的负 相关(P<0.05),且对照组中负相关更显着(P< 0.01)(表5,6). 表5MMP-7与TIMP-2在HNPCC组患者中表达的相关性 表6MMP-7与TIMP-2在对照组患者中表达的相关性 三,讨论 HNPCC是一种由人类错配修复基因(mismatch repairgene,MMR)突变引起的常染色体显性遗传 病n.它的遗传病因特殊,临床病理特点突出, 生物学行为与散发性大肠癌截然不同.HNPCC预 后比散发性大肠癌好的原因就在于其在获得诊断时 的侵袭更弱,转移更少.MMP家族及其抑制物 TIMP在大肠癌侵袭,转移的复杂过程中起着非常重 要的作用u.其中MMP-7分子量最小,基质降解 功能强大,底物特异性广泛,同时受TIMP负调节的 作用较小.TIMP-2可抑制血管内皮细胞迁移,肿瘤 生长和血管生成,并可造成现有血管坏死.因此, MMP-7/TIMP-2的产生与激活的失平衡是导致大肠 癌侵袭,转移的关键因素之一.其比例的失衡较单 纯的MMP-7或TIMP-2水平的变化意义更大r引. 本研究发现:MMP-7,TIMP-2表达与大肠癌的侵犯 深度和转移与否密切相关;侵犯浆膜外组织和有转 移者的MMP-7表达明显高于侵犯限于浆膜和无转 移者.而TIMP-2表达则相反,两者间呈负相关.这 说明在MMP-7在大肠癌的侵袭,转移中起到促进作 用,而TIMP-2则是一个保护因素.这与国内外报道 一 致. 肿瘤的发生,发展过程存在着多种基因结构或 功能改变,先发生改变的上游基因可能是其下游基 因改变的原因.因此,上游基因在肿瘤的发生,发展 中可能起着更关键的作用.本研究发现:MMP-7和 TIMP-2在散发性大肠癌和HNPCC中的表达差异显 着.散发性大肠癌中MMP-7/TIMP-2的比例失衡明 显高于HNPCC组.这可能是造成HNPCC在获得 诊断时侵袭弱,转移少并最终导致其预后好的原因 之一.根据本段首的理论,我们认为引起上述变化 的原因可能与转化生长因子13(TGFI3)信息通路有 关.Akhu~t等u报道TGFI3参与诱导大肠癌中 MMP的表达并下调TIMP.TGFI3的上述作用需借 助肿瘤细胞膜上的TGFI3?型受体(T[3RlI)才能发 挥.T[3RlI是MMR的下游靶基因.因此,MMR突 变在造成HNPCC发病的同时,也将引起其下游靶 基因T[3RlI的突变失活引.缺乏了T[3RlI的介导, TGFI31对HNPCC肿瘤的诱导分化作用减弱,这可 能是导致HNPCC中MMP的表达减弱,TIMP上调. 并使HNPCC在侵袭转移方面的生物学行为与散发 性大肠癌截然不同的原因,这有待于我们继续研究. 总之,我们的研究提示,HNPCC中MMP-7的表 达明显低于散发性大肠癌,而其TIMP-2的表达则高 于后者.HNPCC中的MMP-7/TIMP-2的比例失衡 明显少于散发性大肠癌,这可能是导致HNPCC在 获得诊断时侵袭弱,转移少并最终导致其预后好的 原因之一.其更深层次的原因可能与MMR突变在 导致HNPCC发病的同时也与导致TBRlI的突变有 关.T[3RlI表达缺失将使TGFI3诱导HNPCC中 MMP表达的能力减弱并上调TIMP的表达.这有待 我们继续研究证实. 志谢空军总医院病理科提供的实验设备以及任力主任,胡益 云和李德昌主治医师的指导对研究工作的实施提供了帮助 参考文献 1ChungDC,Rust#AK.Thehereditarynonpolypesiscolorectal cancersyndrome:geneticsandclinicalimplications.AnnIntem 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通常这些方法在便秘治疗中是相继采用,但是缺乏 长期有效的证据uJ.应用电刺激是一种有前途的 促进结肠传输的方法.已有关于骶神经根的电刺激 研究J,但是这种电刺激必须借助于神经外科手 术,进行骶神经根的传人神经阻滞还会导致排便反 射的消失.另一种有潜力的治疗方法是直接进行结 肠电刺激(colonicelectricalstimulation,CES).我们 旨在采用不同参数CES包括长波宽长时程脉冲电 刺激和短波宽串脉冲电刺激,评估它们对结肠传输 的影响. 一 ,与方法 1.动物:雄性SD大鼠,由同济医学院实验动物 中心提供,体重250,350g.动物在标准条件下饲 养:12h白唇/夜晚;22oC,50%湿度;可以自由摄食 饮水.在进行实验前于饲养环境中适应至少1周. 作者单位:430022武汉,华中科技大学同济医学院附属协和医 院消化内科 通讯作者:刘诗,Email:gbm1lo@yahoo.com (收稿日期:2006-07—19) (本文编辑:高健) 2.手术步骤:大鼠手术前晚禁食,使用腹腔注 射1%戊巴比妥钠溶液麻醉(0.4ml/100g).行腹 部正中切口,暴露回盲部,在结肠盲肠交界处造一瘘 口,然后将导管(内径为0.86mm,外径为1.27mm) 一 端从瘘口插入近端结肠(距结盲肠结合处1cm), 并行荷包缝合将导管固定于造瘘口.在距造瘘口远 端1cm处结肠浆膜层埋置一对不锈钢心脏起搏电 极.电极线和导管另一端穿至前腹壁皮下沿右侧躯 体穿行,从颈后皮肤穿出.缝合腹壁正中切口. 3.实验:手术后3d,动物开始禁食48h, 最后2h同时禁水.动物随机分为3组,每次实验 间隔至少3d.3个研究组包括:非电刺激组(14只 大鼠),串脉冲电刺激组(14只大鼠),长脉冲电刺激 组(10只大鼠).通过导管将酚红注入近端结肠,收 集每10min大鼠肛门排出的酚红,持续至90rain用 来评估结肠传输.电刺激组大鼠在传输实验的前 40min通过电极给予结肠电刺激.串脉冲电刺激组 采用短波宽串脉冲电刺激,刺激参数为2S开,3S 关,频率40Hz,波宽4ms,波幅10mA.长脉冲电刺 激组采用长波宽长时程脉冲电刺激,刺激参数为20 cpm,波宽200IllS,波幅10mA.此参数是根据已有 的动物实验显示小肠电刺激对小肠传输有促进 作用. 4.测量分析结肠传输:50mg酚红溶于100ml