[DOC] 高效液相色谱法同时测定饲料中的雌二醇和甲基睾丸酮

[DOC] 高效液相色谱法同时测定饲料中的雌二醇和甲基睾丸酮 高效液相色谱法同时测定饲料中的雌二醇 和甲基睾丸酮 2011,20(6)福建测试FujianAnalysis&Testing 高效液相色谱法同时测定饲料中的雌二醇和甲基睾丸酮 曾文灿 (福建省测试技术研究所.福建福州350003) 摘要:本文建立了一种用高效液相色谱法同时饲料中雌二醇和甲基睾丸酮的新方法.饲料样品经乙酸乙酯提取, 采用液液萃取法净化浓缩,经液相色谱分离后用二极管阵列器检测.在0.510.0m脓度范围内,两种激素呈良好的线 性关系,相关系数均大于0.9997.在添加水平0.1,2.0mg/k~围内,雌二醇的平均回收率为71%,86%,甲基睾丸酮的平 均回收率为76%,91%,相对偏差均小于9.6%.雌二醇,甲基睾丸酮最低检出限(s/N=3)均为0.03m#kg,定量限 (s,N=l0)为0.1mg/kg.该方法灵敏度高,测定结果准确,适用于饲料中雌二醇和甲基睾丸酮的同时检测. 关键词:雌二醇;甲基睾丸酮;高效液相色谱;饲料 中图分类号:0657.72文献标识码:A文章编号:1009—8143f2011)06—0011-04 SimultaneousDeterminationofEstradiolandMethyltestosteroneinAnimal Feedsby HighPerformanceLiquidChromatography ZengWen--can (FujianInstituteofTestingTechnology,Fuzhou,Fujian,350003,China) Abstract:Amethodforthesimultaneousdeterminationofestradiolandmethyhestosteroneinanimalfeedsbyhish performanceliquidchromatography(HPLC)wasdeveloped.Thetargetcompoundswerefirstextractedwithethylacetateand thenpurifiedbyfollowingliquid-liquidextractionprocesses.TheresiduesweredeterminedbyHPLCwithadiodearray detector.Thestandard~~urvesofestradiolandmethyhestosteroneshowedgoodlinearityintherangeof0.5~10.0mg/L,andthe correlationeoetticients(r)werehigherthan0.9997.Atthespikedlevelsrangefrom0.1to2.0ms/ks,theaveragerecoveriesof estradiolandmethyltestosteronewere71%一86%and76%一 91%.respectively.TherelativestandarddeviatiOils(RSDs)were bothlessthan9.6%.Thedetectionlimits(【DD,S/N=3)ofestradiolandmeth yltestosteronewereboth0.03mg/kgandthe quantificationlimits(LOQ,S/N=10)wereboth0.1mg/kg.Thismethodissensitive,accurateandsuitableforthesimultaneous determinationofestradiolandmethyhestosteroneinanimalfeeds. Keywords:estradiol;methyltestosterone;highperformanceliquidchromato graphy;feeds 性激素类药物能促进动物机体蛋白质同化,加 快增长和骨骼钙化,提高食欲,促进动物生长发 育【n.在饲料中滥用性激素类药物将影响畜牧业的 安全生产,造成畜产品中药物残留,导致畜产品品 质降低,危害人体健康甚至危及生命[21.20世纪80 年代以来,许多国家和组织通过立法限制或禁止在 食用性动物饲料中添加性激素类药物.目前,关于 性激素残留检测方法的报道较多,涉及的主要是动 物源性食品,化妆品等样本,关于饲料中性激素残 留的报道较少[3-9].开展饲料中性激素类药物的检测 方法研究,能为打击在饲料中性激素类药物的违法 使用提供强有力的技术支持,是从源头进行控制的 有效手段. 液相色谱法具有较高的灵敏度和准确度,可实 现对多种物质的检测分析,普及率高且易于推广, 是应用最广泛的测定性激素的方法.雌二醇,甲基 睾丸酮是畜禽饲料中违法添加使用较多的两种性 激素类药物.由于饲料样品基质复杂,蛋白质和脂 收稿日期:2011-3—28 资助项目:福建省公益类科研院所基本科研专项(2010R1007—1) 作者简介:曾文灿(1983一),男,助理师,从事色谱分析工 作;E—mail:zwc021@21en.eom 12福建分析测试研究报告 肪含量较高,文献报道的关于这两种性激素药物的 检测方法中,饲料样品的前处理方法均采用固相萃 取法,受到上样体积的限制,检出限往往较高 (1,2mg/kg),且均只涉及其中单个组分的方法研 究.目前,有关这两种性激素类药物在饲料中的同 时检测分析还未见报道.对于禁用药物而言,实现 两种或多种组分同时检测,提高样品通量及降低检 出限,是开发新的检测方法的主要目标.本文通过 对样品前处理条件及色谱测定参数的优化,建立了 适用于不同畜禽饲料品种(配合饲料,浓缩饲料,预 混料)中雌二醇,甲基睾丸酮同时检测的高效液相 色谱法,采用二极管阵列检测器检测,结合保留规 律及光谱特征吸收曲线进行综合定性分析,可排除 普通紫外检测器的假阳性结果,同时进一步降低了 样品检出限,对现有的动物饲料中性激素类药物检 测方法做了补充. 1实验部分 1.1主要仪器与试剂 Waters2695高效液相色谱仪,配有Waters 2996二极管阵列检测器;ZFQ—B3A旋转蒸发仪(上 海医械专机厂);MILLIPORESimplieity185超纯水 机;KQ3200E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有 限公司);TDL一40B台式离心机(上海安亭科学仪器 厂). 标准溶液:雌二醇,甲基睾丸酮,纯度不小于 98%,中国药品生物制品鉴定所.储备液用甲醇配 制,中间液根据需要用储备液稀释制得,置于0cC 冰箱备用.甲醇,乙腈为色谱纯,德国Merck公司; 实验所用其他试剂均为分析纯,水为超纯水. 1.2样品的提取和净化 准确称取粉碎的饲料样品5.0g于50mL离心 管中,加入20mL乙酸乙酯,超声振荡20min,离心, 上清液45?旋转蒸发至干,残渣中加入5mL甲醇 溶液(甲醇:水=4:1)溶解.用4mL石油醚振荡萃取, 离心,弃去石油醚层.甲醇溶液在45~(2下旋转蒸发 至约0.5ml.加入约2mL水清洗瓶壁,用4mL的乙 酸乙酯反萃,离心,乙酸乙酯层旋转蒸发至干,用流 动相定容至lmL,滤膜过滤后供液相色谱分析. 1.3色谱条件 色谱柱:WatersSymmetryC18,150mm×3.9mm, 5m;流动相:乙腈一水(体积比60:40);流速: 1.0mL/min;进样量:lOp.1;柱温:3OcI=;检测波长:雌 二醇,225nm;甲基睾丸酮,245nm. 2结果与讨论 2.1样品前处理 大多性激素类药物在弱极性和中等极性有机 溶剂中有较高的溶解性,常用的萃取溶剂包括乙 醚,叔丁基甲醚,乙酸乙酯,乙腈,甲醇等.饲料中含 有较多蛋白质与脂肪类化合物,采用弱极性试剂易 溶解样品中的脂类干扰物,不利于净化和仪器分 析.本实验中我们以大猪配合饲料为研究对象,分 别考察了甲醇,乙腈对两种激素药物的提取效率. 结果发现,由于甲醇,乙腈极性较强,提取物中极性 杂质较多,不易净化,干扰测定.因此,实验改用中 等极性的乙酸乙酯作为提取剂,考虑利用雌二醇和 甲基睾丸酮在不同溶剂中溶解性差异,进行液液萃 取除去杂质以净化样品. 2.1.1净化条件选择 样品经乙酸乙酯提取后,旋转蒸发至干,选择 甲醇一石油醚萃取液分配来脱去类脂等杂质.石油 醚极性小,能除去类脂和其他低极性杂质,但与甲 醇有一定的互溶性,会产生轻微乳化,实验采用在 残渣溶解液中加入少量水分以增加甲醇液密度和 低温高速离心的方法来消减乳化现象,选择以5mL 甲醇水溶液(4:1,v/v)来溶解残渣,再加入石油醚进 行液液分配,除脂净化. 经上述净化后,溶液中仍含有其他极性溶解 物,易影响较早出峰的雌二醇的测定,并容易污染 色谱柱.实验采用以乙酸乙酯为萃取剂,从甲醇水 溶液中反萃目标物的方法,除去极性干扰物.将上 述甲醇水旋转蒸发至干后,分别用80%甲醇,60%甲 醇,40%甲醇,30%甲醇,20%甲醇,10%甲醇和水溶 液溶解残渣,考察乙酸乙酯对目标化合物的萃取效 率和净化效果.结果明,当溶液中甲醇含量小于 30%时,两种激素回收率较高,净化效果也好.因此, 考虑到甲醇水不易挥干,上述甲醇水溶液挥干至 0.5mL后直接加人2mL水混匀,再用乙酸乙酯萃 取,增加了操作的便利性. 曾文灿:高效液相色谱法同时测定饲料中的雌二醇和甲基睾丸酮l3 2.2液相色谱条件 查阅了相关文献,对于雌二醇及甲基睾丸酮的 测定,高效液相法的流动相大多为甲醇或乙腈与水 的混合液.经过反复试验,以乙腈一水(6:4,v/v)作 为流动相,这个条件下目标化合物与杂质能很好分 离且保留时间较为合适.雌二醇紫外特征吸收峰为 225nm和281nm,实验时选用干扰物质较少且灵敏 度较高的225nm.甲基睾丸酮的特征吸收峰为 245nm.本实验采用二极管阵列检测器,结合保留规 律及光谱特征吸收曲线进行综合定性分析,提高了 定性的准确性. 2.3方法的线性关系及检出限 将雌二醇及甲基睾丸酮储备液稀释成含雌二 醇和甲基睾丸酮分别为0.5,1.O,2.0,5.0,10.0mg/L 的混合标准溶液.以测得的峰面积为纵坐标Y,质量 浓度为横坐标X,绘制标准工作曲线,雌二醇,甲基 睾丸酮在考察浓度范围0.5—10.0mg/L有良好的线 性关系,相关系数均大于0.9997,回归方程分别为Y =9886.9x+84.167,Y=15608x+426.87. 以不含待测组分的大猪配合饲料为空白样品, 采用空白样品添加目标化合物的方法,按1.2节和 1.3节的方法处理,以信噪比(s/N)为3计,雌二醇, 甲基睾丸酮的检出限均为0.03mg/kg;以S/N=10 计,雌二醇,甲基睾丸酮的定量限均为0.1mg/kg. 2.4方法的回收率及精密度 分别向空白大猪配合饲料样品中添加0.1,0.5, 2.0ms/ks三个浓度水平的混合标准溶液,每个水平 取5个平行样,按照前述方法测定,计算各个添加 水平的回收率和精密度.由表1可以看出,在上述 三个添加水平下,雌二醇的平均回收率为71%, 86%,甲基睾丸酮的平均回收率为76%,91%,相 对标准偏差(RSD)均小于9.6%,表明该方法具有较 好的准确度和精密度,能够满足日常检测分析的要 求.另外,为了验证方法的通用性,分别对猪禽用配 合饲料,浓缩饲料,预混料等13个样品进行检测并 进行上述三个浓度水平的添加回收试验,平行测定 3次,回收率均大于70%,RSD均小于9.6%.结果表 明该方法适用于多种饲料样品中雌二醇和甲基睾 丸酮的同时检测.图1为空白大猪配合饲料样品和 添加标准品样品的色谱图. 表1空白大猪配合饲料中雌二醇和甲基睾丸酮的回收率和精密度 Table1Recoveriesandprecisionsofestradiolandmethyhestosteronespikedi nblankformulafeedforswine(n=5) O24681O1214161820 f — ormula…e O24681O1214161820 m?n 图1配合饲料空白样品及其加标样品色谱图 Fig.1Chromatogramsofblankformulafeedsampleforswineandthespikeds ample 1.estradiol;2.methyltestosterone 14福建分析测试研究报告2011,20(6) 3结论 本文首次采用高效液相色谱法同时检测饲料 中雌二醇和甲基睾丸酮残留量,结果表明,本法可 操作性强,重复性好,具有较高的灵敏度和准确度, 适用于浓缩饲料,配合饲料和预混料中雌二醇和甲 基睾丸酮的同时检测,对现有的动物饲料中性激素 类药物检测方法做了补充. 参考文献 …许泓,林安清,古珑,等.动物组织中8种同化性激素及代 谢物残留量的检测方法研究[J].分析测试,2008,27 (12):1278—1282. 【2】湛嘉,俞雪钧,李佐卿,等.猪尿中26种性激素与l3种 132一激动剂的同时测定[J】.分析测试,2009,28 (10):1133—1137. 【3】石放雄.饲料样品中类固醇激素类物质的检测【J】.中国饲 料,1995,22:29—30. 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