总大肠菌群

总大肠菌群 总大肠菌群(滤膜法) 1、 适用范围 生活饮用水、水源水 2、 仪器 高温蒸汽灭菌器、滤器、口径0.45μm滤膜、培养箱、冰箱、天平、无齿镊子、直径9cm平皿、灭菌试管、灭菌吸管、酒精灯、烧杯、量筒、1000ml容量瓶。 3、 步骤 (1) 储备培养基的制备 品红亚硫酸钠培养基: 加入蛋白胨10g、酵母浸膏5 g、牛肉膏5 g、乳糖10 g、琼脂20 g、磷酸氢二钾3.5 g、无水亚硫酸钠5 g、碱性品红乙醇溶液(50g/L)20mL、蒸馏水1000mL。 配制方法: 先将琼脂加到500ml蒸馏水中，煮沸溶解(用大烧杯)，于另500ml蒸馏水中加入磷酸氢二钾、蛋白胨、酵母浸膏和牛肉膏，加热溶解，倒入已溶解的琼脂，补足蒸馏水至1000ml，混匀后调pH值为7.2,7.4，再加入乳糖，分装，68.95kPa(115?，10lb)高压灭菌20min，储备于冷暗处备用。(建议培养基用多少配多少) 乳糖蛋白胨培养基 蛋白胨10g，牛肉膏3g，乳糖5g，氯化钠5g，1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1ml，蒸馏水 1000ml。 配制方法: 将蛋白胨、牛肉膏、乳糖、氯化钠加热溶解于1000ml蒸馏水中，调节pH为7.2- 7.4，再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1ml，充分混匀，分装于含有倒置的小玻璃管的 试管中，于高压蒸汽灭菌锅中，在115?灭菌20min，贮存于暗处备用。 (2) 平皿培养基的制备 将上面制备好的备用的培养基加热融化，用灭菌吸管按比例吸取一定量的 50g/L的碱性品红乙醇溶液置于灭菌空试管中，再按比例称取所需的无水亚硫酸钠 置于另一灭菌试管中，加灭菌水少许，使其溶解后，置沸水浴中煮沸10min以灭 菌。 用灭菌吸管吸取已灭菌的亚硫酸钠溶液，滴加于碱性品红乙醇溶液至深红色褪 成淡粉色为止，将此亚硫酸钠与碱性品红的混合液全部加到已融化的储备培养基内，并充分混匀(防止产生气泡)立即将此种培养基15ml倾入已灭菌的空平皿内。待冷却凝固后置冰箱内备用。此种已制成的培养基于冰箱内 保存不宜超过两周。如培养基已由淡粉色变成深红色，则不能再用。 (3) 滤膜灭菌 将滤膜放入烧杯中，加入蒸馏水，置于沸水浴中煮沸灭菌3次，每次 15min。前两次煮沸后需要换水洗涤2,3次，以除去残留溶剂。滤器用蒸汽灭菌 器103.43kPa(121?，15lb)高压灭菌20min。 (4) 水样过滤 用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分，将粗糙面向上，贴放在已灭菌的滤床 上，固定好滤器，将100ml水样(如水样含菌数多，可减少样量，或加水样稀 释)注入滤器中，打开滤器阀门抽滤。 (5) 培养 水样抽滤完后，再抽气5s，关上滤器阀门，取下滤器，用灭菌镊子夹取滤膜 边缘部分，移放在品红亚硫酸钠培养基上，滤膜截留细菌面向上，滤膜应与培养 基完全贴紧，两者间不得留有气泡，然后将平皿倒置，放入37?恒温箱内培养 24h。 (6) 结果观察 A. 挑取符合特征的菌落进行革兰氏染色、镜检: 紫红色、具有金属光泽的菌落; 深红色、不带或略带金属光泽的菌落; 淡红色、中心色较深的菌落。 B. 凡革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌，再接种乳糖蛋白胨培养基，于37?培养 24h，有产酸产气者则判定为总大肠菌群阳性。 C. 补充知识-革兰氏染色:细菌先经碱性染料结晶染色，而经碘液媒染后，用酒精 脱色，在一定条件下有的细菌此色不被脱去，有的可被脱去，因此可把细菌分为 两大类，前者叫做革兰氏阳性菌(G+)，后者为革兰氏阴性菌(G-)。为观察方 便，脱色后再用一种红色染料如碱性蕃红等进行复染。阳性菌仍带紫色，阴性菌 则被染上红色。有芽胞的杆菌和绝大多数和球菌，以及所有的放线菌和真菌都呈 革兰氏正反应;弧菌，螺旋体和大多数致病性的无芽胞杆菌都呈现负反应。 (7) 样品测定步骤 按下式计算滤膜上的总大肠菌群数，即: m*100 总大肠菌群数(CFU/100mL)= V 式中: m——数出的总大肠菌群数; V——过滤的水样体积(mL)