维生素和矿物质对整肠生菌芽孢形成的影响

维生素和矿物质对整肠生菌芽孢形成的影响 ()第 18 卷 第 2 期 年 6 月 2001 重庆师范学院学报 自然科学版 ( )J un. 2001 Vol . 18 No . 2 Journal of Cho ngqing Normal U niversity Nat ural Science Editio n Ξ 维生素和矿物质对整肠生菌芽孢形成的影响 胡 尚 勤 ,唐 安 科 () 重庆师范学院 生物系 ,重庆 , 400047 摘 要 :采用不同种 类 和 不 同 质 量 浓 度 的 维 生 素 与 矿 物 质 培 养 整 肠 生 菌 。结 果 明 , 当 维 生 素 H 在 质 量 浓 度 # # # 50mg/ L 时 ,1 菌芽孢形成率为 98 . 5 % ,11 菌芽孢形成率为 87 . 5 % ,12 菌芽孢形成率为 88 . 4 % ;当矿物质 Mn 和 # # # P 在质量浓度 5mg/ L 时 ,1 菌芽孢形成率为 92 . 1 %和 93 . 0 % ,11 菌芽孢形成率为 83 . 1 %和 81 . 0 % ,12 菌芽孢 # 形成率为 87 . 0 %和 86 . 0 % ,都是对照的 2 倍以上 。1 菌在 5 号培养基中芽孢形成率为 94 % ,是对照的 1 . 24 倍 ; # # 11 菌在 4 号培养基中芽孢形成率为 90 % ,是对照的 1 . 96 倍 ,12 菌在 3 号培养基中芽孢形成为 95 . 0 % ,是对照的 1 . 9 倍 。 关键词 :芽孢 ;整肠生菌 ;维生素 ;矿物质 () 中图分类号 : Q932335 文献标识码 :A 文章编号 :100128905 20010220015204 The Effect of Vitamins and Minerals o n t he Spo rulatio n of Bacillus Lichenifo r mis HU S ha n g - qi n ; T A N G A n2ke )(Dep t . of Biology ,Cho ngqing No r mal U niversit y ,Cho ngqing ,400047 ,China Abstract :The vitamins and minerals of variety and quantit y are used for t he cultivatio n of Bacillus Licheniformis. The re2 # # # sult shows t hat 1 Bacterium sporulatio n rate was 98 . 5 % , 11 Bacterium sporulatio n rate was 87 . 5 % , 12 Bacterium # sporulatio n rate was 88 . 4 % ,when t he vitamins V H was 50mg/ L . Sporulatio n rate of 1 was 92 . 1 % and 93 . 0 % ,sporu2 # # latio n rate of 11 was 83 . 1 % and 81 . 0 % ,sporulatio n rate of 12 was 87 . 0 % and 86 . 0 % ,bot h are 2 times as many as - 6 # t hat of t he co mpariso n ,when t he guantit y of minerals Mn and P was 5 ×10 ,t he sorulatio n rate of 1 was 94 % in t he # medium ,t hat is 1 . 24 times as many as t hat of t he co mpariso n ,sporulatio n rate of 11 was 90 % in t he 4 medium ,t hat is # 1 . 96 times as many as t hat of t he co mpariso n. sporulatio n rateof 12 was 95 % in 3 medium ,t hat is 1 . 9 times as many as t hat of t he co mpariso n. Key word :spore ;Bacillus Licheniformis ; vitamin ; mineral 长期以来 ,人们一直在寻找以菌制菌的有效药物 。从 20 世纪 50 年代以来 ,有许多国家相继研制出了多 种活菌制剂 ,这些制剂大都是应用生理性菌群的成员菌种制成 ,这就是所谓的生理性细菌治疗 ,如用双歧杆 菌等生产的制剂 。到 90 年代后问世的整肠生菌制剂是我国首次从待产妇阴道拭子分离出来的一株无毒菌 () 株 Bacillus Lichenifo r mis生产的微生态制剂 。它与以前的制剂均有不同 。如何延长微生态制剂保存期 ,就 成了厂家急待解决的问题 。而目前所检索到的中外文献资料中尚无此研究 。若将芽孢与营养体细胞相比 , 1 它的抗热性是营养体细胞的 1 万倍 ,存活能力长达几年到几十年之久。本研究旨在采用不同维生素和矿 物质培养整肠生菌以探讨维生素和矿物质对芽孢形成的影响 。达到延长该菌剂保存期之目的 。 1 材料和方法 1 . 1 菌种和培养基 # # # () () 1菌种 。整肠生菌 Bacillus Lichenifo r mis1 、11 和 12 菌种均由重师应用微生物研究室和制药一 厂提供 。 () 2培养基及药品 。 ?牛肉膏 ,蛋白胨 、NaCl 、琼脂质量分数分别为 : 0 . 3 % 、1 . 0 % 、0 . 5 % 、2 % 、水 100 % , Ξ 收稿日期 :2000210230 ( ) 基金项目 :四川省教委课题 ,川教科 199536 号 ( ) 作者简介 :胡尚勤 19502,男 ,重庆人 ,重庆师范学院生物系教授 ,主要从事应用微生物学的研究 。 p H7 . 2 ,121 ?灭菌 30 min 。 ?蛋白胨 、牛肉膏 、NaCl 质量分数分别为 : 0 . 8 % 、0 . 3 % 、0 . 4 % ,p H7 . 0 ,121 ?灭 菌 30 min 。 ?蛋白胨 、牛肉膏 、NaCl 质量分数分别为 : 0 . 8 % 、0 . 2 % 、0 . 4 % ,p H7 . 0 ,121 ?灭菌 30 min 。 ?蛋 白胨 、牛肉膏 、NaCl 质量分数分别为 :0 . 8 % 、0 . 35 % 、0 . 5 % ,V H 质量浓度为 50 mg/ L 培养基 ,水 100 % ,p H7 . 2 ,121 ?灭菌 30 min 。 ?牛肉膏 、蛋白胨 、NaCl 质量分数分别为 :0 . 3 % 、1 . 0 % 、0 . 5 % ,V H 质量浓度为 50 mg/ L 培养基 , KHPO质量分数为 0 . 2 % ,水 100 % ,121 ?灭菌 30 min 。 ?葡萄糖 、蔗糖 、谷甘氨酸 ,甘氨酸 ,赖氨 2 4 酸 ,缬氨酸 , 亮氨酸 , 胱氨酸 , 丝氨酸 , 天门冬酰氨 , 苯 丙 氨 酸 , NaO H , HC I , V H , VB, VB, VB, VB, VB, 1 2 3 5 6 VB, KHPO, KHPO,MgSO, M nSO,CaCO以及各种染色剂等 。 11 2 4 2 4 4 4 3 () 3设备 。可调速恒温振荡培养器 ,恒温培养箱 ,1/ 万电光天平 ,菌落计数器 ,超净工作台 ,显微镜 及照相机 ,以及各种所需设备等 。 1 . 2 方法 # # # () 1菌种活化培养 。将 1 、11 、12 三株菌种分别接种到 1 号培养基上 ,37 ?培养 18 h 。 # # # ( () 2把活化好的 1 、11 、12 菌种制成菌悬液 ,分别接种到 2 、3 、4 、5 号培养基上 ,37 ?培养 24 h 固体 : 8 ) 静置培养 ,液体 :115r/ min 振荡培养,接种量 7 . 0 × 10/ L 培养基 。定时取样用 10 倍稀释法稀释后 ,取样培 2 ,3 () 养计数活菌数 。取稀释样 定量进行芽孢染色和煮沸 5 min 后取样培养 ,计数芽孢数。 () () ( ) ( ) 3用葡萄糖为碳源 ,以上述氨基酸等量混合 精确计算准确称量后为氮源 ,其碳氮比 w C: w N =5 :1 ,并分别加入 V H 、VB、VB、VB、VB、VB、VB和 M n 、Ca 、K、Mg 各 5 、10 、15 、20 、25 mg 于 1L C 、N 混 1 2 3 5 6 11 8 合溶液中 。配成固体和液体培养基 ,每种 6 个重复 ,共 396 组 。115 ?灭菌 15 min ,分别接种 7 . 0 × 10/ L 培 # # # ) ( 养基的 1 、11 、12 菌种悬液 。37 ?培养 24 h 固体培养基静置培养 ,液体培养基 115r/ min 振荡培养,取样用 10 倍稀释法稀释成 1000 个/ mL 后 ,用显微镜计数总菌数和用菌落计数器法计数活菌数 ,定量取样计数 2 () () 芽孢数 ,并定量取样 0 . 01 mL 涂片 1cm进行芽孢染色后计算芽孢数 。以找出芽孢形成率最高时最佳维生 素质量浓度和种类以及矿物质需要量 。 () 4根据对该菌的维生素和矿物质的研究结果设计出 2 、3 、4 、5 号芽孢高产培养基配方进行培养后 ,计 数芽孢数 。 2 结果与讨论 2 . 1 不同维生素对整肠生菌芽孢形成率的影响 在不同维生素种类和量的培养基中整肠生菌芽孢形成率不同 ,结果见表 1 。 从表 1 可见 ,维 生 素 对 整 肠 生 菌 芽 孢 形 成 率 有 一 定 影 响 。VB、VB、VB、VB、VB、VB维 生 素 在1 2 3 5 6 11 # # # 5 mg/ L 时 ,有利于形成芽孢 ,这时芽孢形成率为 : 1 菌 55 %以上 ,11 菌 52 %以上 ,12 菌 54 %以上 ,均高于 同种维 表 1 维生素与芽孢形成率的关系 310 - 1 10 - 1 维生素 ) ) 芽孢形成率/ % ((用量/ mg 活菌数/ 10L? 芽孢数/ 10L? # ### ### ## 种 类1 11 12 1 11 12 1 11 12 10 12 . 5 6 . 0 8 . 0 9 . 5 2 . 7 3 . 7 76 . 2 46 . 2 47 . 1 20 13 . 4 7 . 9 9 . 3 10 . 8 4 . 2 5 . 2 81 . 1 53 . 3 55 . 6 V H 10 . 3 30 15 . 2 8 . 8 14 . 3 7 . 0 8 . 3 93 . 8 79 . 7 81 . 3 40 16 . 5 9 . 7 11 . 5 15 . 9 8 . 3 9 . 9 96 . 7 85 . 6 86 . 2 10 . 3 11 . 1 50 17 . 9 12 . 6 17 . 6 9 . 0 98 . 5 87 . 5 88 . 4 5 2 . 3 1 . 8 1 . 9 1 . 5 0 . 9 1 . 0 66 . 7 51 . 3 52 . 7 10 2 . 0 1 . 5 1 . 7 1 . 3 0 . 7 0 . 8 60 . 3 50 . 1 51 . 2 VB 15 1 . 8 1 . 3 1 . 5 1 . 1 0 . 6 0 . 7 60 . 1 49 . 2 50 . 0 120 1 . 2 1 . 1 1 . 3 0 . 7 0 . 5 0 . 6 60 . 0 48 . 3 49 . 5 25 1 . 1 1 . 1 1 . 2 0 . 6 0 . 5 0 . 5 60 . 0 48 . 0 49 . 1 5 2 . 2 1 . 9 2 . 1 1 . 3 1 . 0 1 . 2 58 . 5 53 . 8 55 . 9 10 2 . 1 1 . 7 1 . 9 1 . 2 0 . 8 1 . 0 56 . 7 52 . 9 54 . 8 VB 15 2 . 0 1 . 5 1 . 7 1 . 1 0 . 7 0 . 9 55 . 8 50 . 5 53 . 2 220 1 . 8 1 . 3 1 . 5 0 . 9 0 . 6 0 . 7 53 . 2 50 . 1 51 . 9 25 1 . 5 1 . 2 1 . 4 0 . 8 0 . 5 0 . 6 51 . 7 49 . 1 49 . 8 第 2 期 胡尚勤 等 :维生素和矿物质对整肠生菌芽孢形成的影响 17 续表 1 310 - 1 10 - 1 维生素 芽孢形成率/ % 用量/ mg ) ) ((活菌数/ 10L? 芽孢数/ 10L? # ### ### ## 种 类1 11 12 1 11 12 1 11 12 5 2 . 3 2 . 0 2 . 3 1 . 3 1 . 0 1 . 3 60 . 1 54 . 1 57 . 8 10 2 . 1 1 . 9 2 . 1 1 . 2 1 . 0 1 . 1 59 . 3 53 . 3 56 . 5 VB 15 2 . 0 1 . 7 1 . 9 1 . 1 0 . 8 1 . 0 57 . 1 52 . 4 55 . 1 320 1 . 9 1 . 5 1 . 7 1 . 1 0 . 7 0 . 9 55 . 7 50 . 5 53 . 3 25 1 . 7 1 . 4 1 . 5 0 . 9 0 . 6 0 . 7 53 . 0 49 . 7 52 . 5 5 2 . 8 2 . 2 2 . 5 1 . 7 1 . 3 1 . 5 61 . 2 58 . 3 59 . 7 10 2 . 6 2 . 0 2 . 3 1 . 6 1 . 1 1 . 3 60 . 7 57 . 1 58 . 6 VB 15 2 . 5 2 . 0 2 . 1 1 . 5 1 . 1 1 . 2 58 . 2 55 . 2 57 . 3 520 2 . 5 1 . 8 1 . 9 1 . 4 0 . 9 1 . 0 56 . 5 53 . 7 55 . 4 25 2 . 6 1 . 6 1 . 7 1 . 3 0 . 8 0 . 9 53 . 2 52 . 1 54 . 3 5 2 . 2 1 . 9 2 . 3 1 . 2 1 . 0 1 . 3 57 . 8 56 . 1 58 . 2 10 2 . 1 1 . 8 2 . 1 1 . 1 1 . 0 1 . 2 55 . 2 54 . 3 56 . 7 VB 15 2 . 0 1 . 6 2 . 0 1 . 0 0 . 8 1 . 0 53 . 1 51 . 5 53 . 5 620 1 . 9 1 . 5 1 . 7 1 . 0 0 . 7 0 . 9 51 . 5 50 . 5 52 . 3 25 1 . 8 1 . 5 1 . 6 0 . 9 0 . 7 0 . 8 50 . 1 50 . 0 51 . 0 5 1 . 4 1 . 3 1 . 3 0 . 7 0 . 6 0 . 7 55 . 3 52 . 1 54 . 1 10 1 . 3 1 . 2 1 . 3 0 . 7 0 . 6 0 . 7 54 . 1 51 . 3 53 . 3 VB 15 1 . 2 1 . 2 1 . 2 0 . 6 0 . 6 0 . 6 52 . 2 50 . 2 52 . 0 1120 1 . 0 1 . 0 1 . 1 0 . 5 0 . 5 0 . 5 50 . 0 49 . 7 49 . 9 25 0 . 9 0 . 9 1 . 0 0 . 4 0 . 4 0 . 5 49 . 1 48 . 1 48 . 7 对照 0 . 9 0 . 8 0 . 8 0 . 4 0 . 3 0 . 3 47 . 0 41 . 2 43 . 5 3 指 1L 溶液中的 mg 数 生素的其他质量浓度时芽孢形成率 。其中 VB、VB、VB比 VB、VB为好 ,芽孢形成率比 VB、VB时高 。 1 3 5 2 11 2 11 # # # # 而且 1 菌的芽孢形成率高于 11 和 12 菌的芽孢形成率 。特别是 V H 对 1 菌芽形成率有明显作用 。芽孢 # # 形成率为 98 . 5 % ,11 菌为 87 . 5 % ,12 菌为 88 . 4 % ,分别是对照的 2 . 1 倍和 2 倍 。 表 2 整肠生菌芽孢形成率与矿质元素关系 310 - 1 10 - 1 矿质元素 ) ) 芽孢形成率/ % ((用量/ mg 活菌数/ 10L? 芽孢数/ 10L? # ### ### ## 1 11 12 1 11 12 1 11 12 5 1 . 5 1 . 2 1 . 3 1 . 3 1 . 0 1 . 1 92 . 1 83 . 1 87 . 0 10 1 . 4 1 . 1 1 . 3 1 . 2 0 . 9 1 . 0 85 . 2 80 . 2 82 . 0 Mn 15 1 . 4 1 . 1 1 . 2 1 . 1 0 . 8 1 . 0 82 . 2 79 . 1 80 . 1 20 1 . 4 1 . 0 1 . 2 1 . 1 0 . 7 0 . 9 80 . 1 76 . 1 78 . 0 25 1 . 4 1 . 0 1 . 1 1 . 0 0 . 7 0 . 8 76 . 2 73 . 1 75 . 0 5 1 . 2 1 . 1 1 . 2 1 . 0 0 . 6 0 . 8 79 . 0 61 . 0 66 . 0 10 1 . 2 1 . 0 1 . 1 0 . 9 0 . 5 0 . 7 75 . 0 58 . 0 61 . 0 Mg 15 1 . 2 1 . 0 1 . 0 0 . 8 0 . 5 0 . 5 71 . 0 55 . 0 58 . 0 20 1 . 1 0 . 9 1 . 0 0 . 7 0 . 4 0 . 5 68 . 0 50 . 0 55 . 0 25 1 . 1 0 . 9 1 . 0 0 . 7 0 . 4 0 . 5 62 . 0 48 . 0 50 . 0 5 1 . 3 1 . 1 1 . 2 0 . 9 0 . 6 0 . 7 69 . 0 59 . 0 61 . 0 10 1 . 2 1 . 0 1 . 1 0 . 8 0 . 5 0 . 6 65 . 0 55 . 0 59 . 0 K 15 1 . 2 0 . 9 1 . 0 0 . 7 0 . 5 0 . 5 62 . 0 51 . 0 57 . 0 20 1 . 1 0 . 9 1 . 0 0 . 6 0 . 4 0 . 5 58 . 0 50 . 0 53 . 0 25 1 . 1 0 . 9 1 . 0 0 . 6 0 . 4 0 . 5 57 . 0 50 . 0 50 . 0 5 1 . 2 1 . 1 1 . 1 0 . 8 0 . 6 0 . 6 69 . 0 57 . 0 59 . 0 10 1 . 1 1 . 1 1 . 1 0 . 7 0 . 5 0 . 6 64 . 0 52 . 0 53 . 0 Ca 15 1 . 1 1 . 0 1 . 1 0 . 6 0 . 5 0 . 5 61 . 0 51 . 0 53 . 0 20 1 . 0 1 . 0 1 . 0 0 . 6 0 . 4 0 . 5 60 . 0 45 . 0 50 . 0 25 1 . 0 1 . 0 1 . 0 0 . 5 0 . 4 0 . 4 53 . 0 43 . 0 48 . 0 5 1 . 5 1 . 2 1 . 2 1 . 4 0 . 9 1 . 1 93 . 0 81 . 0 86 . 0 10 1 . 5 1 . 2 1 . 2 1 . 3 0 . 9 1 . 0 85 . 0 75 . 0 81 . 0 P 15 1 . 5 1 . 1 1 . 2 1 . 2 0 . 8 0 . 9 83 . 0 73 . 0 75 . 0 20 1 . 4 1 . 1 1 . 1 1 . 1 0 . 7 0 . 8 81 . 0 69 . 0 71 . 0 25 1 . 4 1 . 0 1 . 1 1 . 1 0 . 6 0 . 7 78 . 0 60 . 0 68 . 0 对照 0 . 9 0 . 7 0 . 8 0 . 4 0 . 3 0 . 3 46 . 0 35 . 0 39 . 0 3 指 1L 溶液中的 mg 数 2 . 2 矿质元素对整肠生菌芽孢形成的影响 在一定条件下 ,整肠生菌在不同种类和不同质量浓度矿质元素培养基培养时 ,芽孢形成率结果见表 2 。 从表 2 可见 ,矿质元素种类和质量浓度对整肠生菌芽孢形成有一定影响 。M n , K ,Mg ,Ca , P 质量浓度在 5,10 mg/ L 时 ,芽孢形成率较高 ,在质量浓度 5 mg/ L 时 ,则更有利于芽孢形成 ,芽孢形成率是对照的 2 倍 。 质量浓度过高或过低都不利于芽孢形成 。特别是 M n 和 P 对芽孢形成有明显促进作用 ,当 M n 和 P 在质量 # # 浓度 5 mg/ L 时 ,明显比 Ca ,Mg , K 为好 ,1 菌芽孢形成率是对照的 2 倍 ,11 菌芽孢形成率是对照的 2 . 3 倍 , # # 12 菌芽孢形成率是对照的 2 . 2 倍 。1 菌芽孢形成率最高 。这可能是除整肠生菌本身遗传因素外 ,由于 M n 4 是多种酶的激活剂 ,能促进孢子形成速度 ,同时 ,各元素之间有协同作用 ,也有抵抗作用。因此 ,如何满足 各元素的需要又不能互相抵抗 ,使芽孢形成率达到最高峰 ,这是生产上和研究中应注意的问题 。 2 . 3 新设制培养基对整肠生菌芽孢形成的影响 根据上述维生素和矿物质对芽孢形成的作用 ,设制出 2 、3 、4 、5 号培养基培养整肠生菌时的结果见表 3 。 表 3 几种新培养基对不同整肠生菌株芽孢形成的影响 10 - 1 10 - 1 培养基 芽孢形成率/ % ) ) ((活菌数/ 10L? 芽孢数/ 10L? # ### ### ## 序号1 11 12 1 11 12 1 11 12 2 2 . 80 2 . 50 2 . 60 2 . 56 2 . 00 2 . 40 91 . 0 80 . 0 92 . 0 3 2 . 70 2 . 50 2 . 60 2 . 43 2 . 15 2 . 48 90 . 0 85 . 0 95 . 0 4 2 . 80 2 . 60 2 . 60 2 . 60 2 . 34 2 . 34 93 . 0 90 . 0 90 . 0 5 2 . 80 2 . 50 2 . 80 2 . 64 2 . 20 2 . 52 94 . 0 88 . 0 91 . 0 对照 2 . 40 2 . 20 2 . 20 1 . 86 1 . 01 1 . 10 76 . 0 46 . 0 50 . 0 # 从表 3 可见 ,新设制出的几种培养基均较有利于芽孢形成 ,芽孢形成率都比对照高 。其中 1 菌在 5 号 # # 培养基中芽孢形成率是对照的 1 . 24 倍 ,11 菌在 4 号培养基中芽孢形成率是对照的 1 . 96 倍 ,12 菌在 3 号 培养基中芽孢形成率是对照的 1 . 9 倍 。生产上应根据不同菌株采用不同的培养基 ,以利于芽孢形成 。 参 考 文 献 : 1 李季伦 . 微生物生理学 M . 北京 :北京农业大学出版社 ,1993 . 507 . 2 M ICHA EL J , P EL CAR ,J r . L aborator y Exercises in MicrobiologyM . New Yor k : Printed in U SA ,1977 . 63 . 3 周德庆 . 微生物学实验手册 M . 上海 :上海科学技术出版社 ,1986 . 96 . 4 王国旬 . 微生物生理 M . 西安 :西北大学出版社 ,1989 . 12213 . () 责任编辑 许文昌