缺血脑组织tPA与LRP1相互作用诱导的Akt磷酸化导致神经血管单元通透性增加机制（可编辑）

缺血脑组织tPA与LRP1相互作用诱导的Akt磷酸化导致神经血管单元通透性增加机制（可编辑） 山东大学 博士学位论文 缺血脑组织tPA与LRP1相互作用诱导的Akt磷酸化导致神经血 管 单元通透性增加的机制 姓名:安杰 申请学位级别:博士 专业:药理学 指导教师:张岫美;Manuel Yepes 20081118山东大学博士学位论文 中文摘要 缺血脑组织与相互作用诱导的磷酸化 导致神经血管单元通透性增加的机制 博士研究生安杰 导师 张岫美教授 组织型纤维蛋白溶酶原激活剂是近十年来美国食品与药品管理 局唯一 批准的用于急性缺血性脑中风后进行溶栓治疗的药物 , 。然而,应用后只有的急性中风病人可以完全或近完全恢复,而脑 出血并发症的发生率却增加了倍。 越来越多的研究表明,在缺血 后脑组织中 内源性活性增加,具有一些神经血管毒性作用,这与它的溶栓作用无关, 而 可能是作为细胞因子在发挥作用。更重要的是,虽然在血管内是有益的 溶栓,并且是纤维蛋白溶酶原介导的,但是大部分存在于缺血脑组织的 是有害的,并且不是通过纤溶酶原介导的。 低密度脂蛋白受体相关蛋白是一个内吞受体,被发现存在中枢神经 系统的神经元和血管周围星形胶质细胞。与多个配体包括发 生作用。在中枢神经系统的大部分功能是介导的。 神经血管单元是随着研究的深入而提出的一个更为合理的概念。大脑 是一个整体的功能单位,在缺血性卒中发生时,神经元、神经胶质细胞及微血管 均受到损害,通过单一的分子机制进行调控,结果往往不理想。在过去的多年 中,绝大部分神经保护剂往往动物实验有效而临床试验无效,正了这一点。 神经血管单元包括血管内皮细胞、基底膜、管周细胞、胶质细胞和神经元。的 主要功能是调节物质从血管内进入脑组织的通透性。其发挥作用的一个重要结构 是星形胶质细胞终足与与管周基膜所形成的屏障结构。脑缺血后, 通透性增 加,导致了脑水肿和脑出血的形成,这是急性脑中风病人的两大重要死因。越来山东大学博士学位论文 越多的研究表明,对通透性有直接的影响。 蛋白激酶,又叫蛋白是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,有研究表 明它在脑缺血后神经细胞存活方面发挥了重要的作用。我们的研究发现, 脑缺血 不仅引起神经元内磷酸化增加与神经元存活有关,在管周星形胶质细胞中 也有增加可导致通透性增加。更重要的是,我们的研究表明,与 在星型角质细胞及基底膜表面的相互作用导致表达增加,并引起通透性 增加。 这里我们利用免疫印迹和免疫荧光分析,发现在脑缺血早期,与基因敲除 小鼠相比,野生型小鼠表达明显增加。我们进一步的研究表明,向基因 敲除小鼠脑内注射,可以诱导的磷酸化水平达到野生型小鼠脑缺血后 的磷酸化水平,表明介导了脑缺血早期表达水平的增高。这些结果表明 内源性与脑缺血早期磷酸化的表达增加有关。 我们发现,在缺血脑组织的表达具有细胞及时间选择性。在野生型小鼠, 主要在缺血早期星形胶质细胞中表达。在基因敲除小鼠,在神经元 持续表达’小时。在以往的研究中,在脑缺血后缺血组织磷酸化水平升 高, 被认为具有神经保护作用。为了明确是否在神经元中的表达增加对细 胞凋亡有影响,我们利用免疫印迹法比较了野生型及基因敲除小鼠?的 表达的差异, 以及利用法比较调往细胞的多少。 我们的结果显示神经元 表达的具有神经保护作用。 关于在星形胶质细胞中的作用研究较少。以往的研究表明, /信号转导通路介导了脑缺血后血管内皮生长因子引起的神 经元保护作用和血脑屏障通透性增加的作用。另外也有研究表明星形胶质细胞在 调节血脑屏障通透性方面有重要作用。因此我们推测介导的星形胶质细胞 表达增加与脑缺血后通透性增加有关。我们给大脑中动脉阻断的野生型小鼠 脑室内注射, 一种特异性磷脂酰肌醇一激酶一的抑制剂,可 以阻断/信号转导通路。小时后检查伊文斯蓝外渗率,这是检测血 脑屏障通透性的常用指标。我们发现,与对照组相比,处理组小鼠伊 文斯蓝渗透率降低了/%。 纤维蛋白溶酶原是最常见的底物,所以我们进行免疫印迹试验,来观察山东大学博士学位论文 对的作用是否具有纤溶酶原依赖性。我们的研究结果表明, 表达水平在纤溶酶原基因敲除小鼠和野生型小鼠并无区别,这表明对 的影响并不是通过纤溶酶原机制来发挥的。 我们对大脑中动脉阻塞小时后野生型小鼠和基因敲除小鼠的脑组织提取 物进行了免疫共沉淀的研究。结果表明,与野生型小鼠相比,基因敲除小鼠及 注射了受体相关蛋白,一种对具有阻断作用的蛋白质的野生型小鼠, 脑缺血引起的与相互作用明显减少。我们的电子显微镜共定位研究显 示胞内段?和共同存在于的每一个兴趣区域的周围星形胶 质细胞中。总之,这些结果表明,在脑缺血的早期阶段,在血管周围的星形胶质 细胞中与的相互作用诱导蛋白磷酸化。 ? 是的下游蛋白之一,所以我们进一步研究了在星形胶质细胞中 蛋白磷酸化是否介导对? 的活化。将培养的野生型星形胶质细胞分两组, 均暴露于氧糖缺失状态,一组培养液中之加入,另一组加入及 通路阻断剂,然后通过免疫印迹分析的磷酸化水平,这是显示 活化水平的常用指标。我们的研究结果表明,在星形胶质细胞中诱导 了的磷酸化水平,而在星形胶质细胞中同时加入和,这一作 活化。 用被明显抑制。总之,结果支持我们的假设,即介导了对? 由于一是? 的调节基因,所以我们进一步研究了?一通 路引起血脑屏障通透性增加与咖一的关系。我们利用明胶酶谱法测定 处理组及非处理组野生型小鼠缺血脑组织提取物中删一活性。结果表明 抑制表达后,缺血脑组织中删一的活性明显降低。 总之,这些结果表明,在脑缺血早期和在的星形胶质细胞中的 相互作用诱导激活介导的细胞信号通路,引起星形胶质细胞终足 与管周基膜 分离,最终导致血脑屏障通透性的增加。 关键词:神经血管单元:脑水肿:组织型纤溶酶原激活剂:低密度 脂蛋白受 体相关蛋白:蛋白激酶:基质金属蛋白酶 山东大学博士学位论文 英文摘要 唧 位 ?佃 . 【卜 ?心江 ?? 【 、厂 ???’ .? . % 一, ., .. 、析 . .. 山东大学博士学位论文 , 。, .’ ,. ,,, ... . , ../.晰 、, . , ./、?. / . .山东大学博士学位论文 ., ., , . . / , 一 ?. 一一.. ,/ . ., . , . , . 砸 , . / %.,.? 一 , . ?慢心一? .’、, ./ ? ........??. . 一 ???一一一??????山东大学博士学位论文 ?.。. 地 一.,.?. , . . . 一一 ?一 ,. 、析.、玑一 .. : ; ; ;?;; 山东大学博士学位论文 符号说明 英文缩略 英文全称 中文全称 组织型纤维蛋白溶酶原激 ? 活剂 低密度脂蛋白受体相关蛋白 . 低密度脂蛋白受体相关蛋 白.胞内段 受体相关蛋白中枢神经系统 蛋白激酶 磷酸化 兴趣区域 氧糖缺失 ?大脑中动脉阻断神经血管单元 . 血脑屏障 . 聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶 脱氧核糖核苷酸末端转移 ? 酶介导的缺口末端标记法分钟 . 核因子: ? 磷酸盐缓冲液 转/分钟 山东大学博士学位论文异硫氰酸荧光素 聚丙烯酰胺凝胶电泳 逆转录聚合酶链反应 颈总动脉, 颈外动脉 颈内动脉 大脑中动脉 .. 核因子抑制物 胎牛血清秒 十二烷基磺酸钠,,.三苯基绿化四 氮唑 ,一乳酸脱氢酶 原创性声明 本人郑重声明:所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下,独立 进 行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外,本论文不 包含任何 其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作 出重要贡 献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人 承担。 一? 论文作者签名:囊 日 期: 巡旺丫 关于学位论文使用授权的声明 本人同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的印刷件和电子 版,允许论文被查阅和借阅;本人授权山东大学可以将本学位论文的全部 或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或其他复制手 段保存论文和汇编本学位论文。 保密论文在解密后应遵守此规定 论文作者签名:盔查:导师签名:刍丝猢乙日期:兰堕二\二哆 论文作者签名:丑釜:导师签名:公丛剑乙日期:兰堕二二乡山东大学博士学位论文 前 言 第一章 神经血管单元是由血管内皮细胞,星形胶质细胞,神经细胞,以及具 有收缩功能的细胞如:平滑肌细胞或者管周细胞组成。的一个重要功能是调 节物质从血管进入脑组织的通透性, 从而保持一个精确调节的微环境以保持适当 ,是由内皮细胞间的紧 的神经元活动。这个功能屏障也被称为血脑屏障 密连接,细胞外基底膜以及星形胶质细胞与基底膜间的接触组成。对通透性 的调节是正常生理功能的一个必要组成部分的。然而,在病理情况下,如急性脑 缺血,通透性的过度增加导致过多液体从血管内进入脑组织,伴随血管源性脑 水肿的产生’。了解调节的功能和完整性的分子机制对鉴定防治血脑屏障功 能障碍所致的神经系统疾病如中风的药物是非常必要的。 中风是世界范围第三大主要的死亡原因,仅次于冠心病和癌症,也是成人致残 的重要原因“。脑缺血是中风主要的类型约%,定义为由于供血血管堵塞 造成全部或部分大脑血液供应减少所导致的综合症。血管性水肿是常见的并发症, 由于中风后的通透性增加引起,可增加颅内压,并破坏细胞,被认 为是引起 严重中风病人脑损伤及死亡的主要原因。 溶栓治疗是急性缺血性中风治疗的一个重要部分。年美国国立神经疾病 研究院的一项研究发现急性缺血性中风小时内给病人静脉注射组织型纤溶酶原 激活剂产生临床及统计学的益处“。因此年,美国食品药品管理局批 准用于缺血性中风症状出现的小时内。仍然是近年被美国食品药品 管理局批准的用于此用途的唯一药物。 是一种高度特异性的丝氨酸蛋白激酶,在体内激活纤溶酶原成为纤溶酶, 后者可以溶解血栓中的纤维蛋白,从而使闭塞的血管再通。这就是作为溶栓 药物用于急性脑缺血治疗的基础。然而,在最近的一次回顾性分析中,已被证 明具有一些神经毒性作用,包括导致血脑屏障破坏“,其机制有待于进一步研究。 的作用不仅仅是溶栓,现在越来越多的数据表明,可以作为细胞因 子‘’将信号从细胞膜转导进入细胞核,控制特定基因在多种组 织包括中枢神经 系统中的表达‘而发挥关键作用。 在中枢神经系统,主要在血管内空间和血管外空间表达。在血管山东大学博士学位论文 内空间,主要是由微血管内皮细胞释放,其作用是溶栓,纤溶酶原激活物抑制 剂是其相应的拮抗剂。而在血管外空间,它可以在神经元和小胶 质细胞表达,并介导神经元死亡和小胶质细胞活化‘?,在这一部分 是其相应的抑制剂。但是,对于是否位于星形胶质细胞以及其相应的作用和 机制如何还需作进一步研究。 现在有令人信服的实验数据表明,经过大脑中动脉栓塞后缺血脑组织 有内源性活性的增加’?,并在中枢神经系统过量的促进神经元死亡 五。一些动物模型实验已经证明,无论短暂性或永久性大脑中动脉阻塞, 基因缺陷’’或用的天然抑制剂抑制其作用均明显增加神 经元存活率,减少梗死体积,表明中风引起的病理生理过程中内源性发挥了 有害的作用。 研究发现的非溶栓作用大部分是通过作用于跨膜受体低密度脂蛋白相关 蛋白低密度脂蛋白受体相关蛋白而实现的??。 属于低密度脂蛋白受体基因家族,后者包括个结构密切相关 的跨膜蛋白‘。这些蛋白质参与了广泛的生理过程,包括调节血脂代谢,防止动 脉粥样硬化,神经发展,运输养分,其中包括在内的大多数受体有另外的调 节细胞信号转导的功能。在整个受体家族中,作用于迄今数目最多的蛋白质 例如, 一巨球蛋白,,凝血因子,脂肪酶, 钉,并进行多种功能。 是由一个的细胞外重链和的跨膜轻链组成,后者包含跨 膜部分和细胞内部分吼剐。的胞浆部分包含两个保守序列片断和众多 的酪氨酸残基。其中序的保守序列片断是一个调节内吞作用的区域,也 与调节信号通路的其它信号分子发生作用乜?。 以前的研究表明,在中枢神经系统的可以在神经元阳和周围的星形 胶质细胞表达乜钉。在神经细胞已被发现介导长时程除极‘们以及通过受 体介导钙离子内流“。而在神经元被证实在细胞信号转导通路中 发挥作用‘盯。 ’氟 在周围的星形胶质细胞与之间的相互作用被证明增加的通透性 在以前的研究中,我们发现,早期后,诱导星形胶质细胞的胞 外段脱落进入基底膜, 伴随着星形胶质细胞肿胀以及星形胶质细胞终足与基底膜山东大学博士学位论文 分离并形成血管周围水肿嘞’。进一步研究表明,在胞外段脱落后,跨膜区 经过一分泌酶裂解,释放其胞内段。此过程称为调节性的蛋白膜内水解 ,这是一个高度保守的细胞信号机制“阳。关于是如何参与或调节 该信号途径的引起星形胶质细胞足突与基膜分离并最终导致血脑屏障通透性 增加的细节我们并不完全理解,但它似乎涉及其与相互作用。和调 节血脑屏障的完整性的机制尚不得而知。我们有兴趣在细胞内的蛋白通路从互动 型纤溶酶原激活剂,以增加通透性的。 蛋白激酶,也被称为,是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,具有调节 神经褪变和血脑屏障功能的作用。一般来说,局灶性脑缺血后在丝氨酸 磷酸化的水平磷酸化瞬时增加。 等人伽首次报道全球脑缺血后在丝氨酸蛋白磷酸化水平显著 增加,促进细胞色素释放,并激活海马区。经过蛋白磷酸化短暂 下降,在接下来的小时蛋白磷酸化大大增加,小时下降到基础水平。同 样,这种在丝氨酸一磷酸化的双向变化在鼠前脑缺血是非常显而易见的们。 有人在大鼠血管闭塞的全脑缺血模型‘’列以及小鼠模型‘’也观察到 蛋白磷酸化的短暂上调。等发现大鼠大脑中动脉闭塞小时后在 缺血半影区的免疫反应性增加。 脑缺血数小时后观察到的的活性增加还参于了血脑屏障通透性增加。 有研究表明,在某一在体模型,的信号对血管通透性的增加是必要的而且 是充分的嘲。 等人发现,用抑制的活性可以扭转血管 内皮生长因子的神经保护性能,降低脑肿胀,并恢复由血管内皮细胞生长因子诱 导血管通透性改变。 等表明,激活一/通路中在缺氧/血管内皮 细胞生长因子诱导的通透性增高中发挥核心作用汹。 等证明活性 氧选择性激活,激酶和蛋白激酶蛋白激酶/信号通路,导 致肌动蛋白细胞骨架的重排和空间的重新分配以及和一的消 失,诱导血脑屏障完整性的改变汹。 等发现,缺氧和血管内皮生长因 子通过和/通路的激活来活化蛋白激酶而导致血管内皮细胞的连 接蛋白的重排,从而引起血管通透性改变‘柏。一项研究表明,联合应用阿托伐他 汀和显著增加蛋白磷酸化,而用完全抑制/通路,山东大学博士学位论文 可明显减少损伤体积。 既然和均对脑缺血发生反应,并对血脑屏障通透性产生作用。二者 之间是否有一定的联系呢 .等表明, 其他一些细胞内分子也被证明是参与通路‘黯一?。 在依赖性兴奋性损伤小鼠,一氧化氮介导神经退行性变和血脑屏障破坏。 等表明,后的和的相互作用引起星形胶质细胞? 活 化,诱导缺血性组织诱导型一氧化氮合酶表达的,表明在脑缺血中具有与纤 溶酶原无关的细胞因子样的作用 等发现介导引起的一 激活。 要弄清血脑屏障通透性增加的确切分子机制,还有大量的工作要 做。 我们的目的是探讨从与结合开始,至最终引起星形胶质细胞性水 肿的细 胞信号转导通路。我们的研究将对血脑屏障调节的分子机制提出 新的见解,这可 能对中风的治疗提供新的思路。山东大学博士学位论文 第二章材料与方法 .材料 ..实验动物 .健康雄性/野生型小鼠,年龄’周 体重’ 一/一小鼠 .健康雄性/ /一小鼠 .健康雄性/ 出生后第天 .健康雄性/小鼠 怀孕第天 .健康雌性?大鼠 ..药品与试剂 .?蛋白分析试剂盒?,,, ., .多克隆抗体以及抗体,姒,: .重组鼠源 ,, .受体相关蛋白由马里兰大学的博士提供 . 抗体由马里兰大学的博士提供 .抗体由马里兰大学的博士提供 .蛋白酶抑制剂 :, .磷酸化酶抑制剂:,, .封闭液 .,,, .山羊抗小鼠? ,.,, .山羊抗兔? ,.,, .抗?抗体,.,, .蛋白/琼脂糖珠 ,.,, .蛋白印迹膜再生液 .,, .免疫印迹化学发光试剂 .,, 山东大学博士学位论文.抗体 .,, .抗体 ,.,, .山羊抗小鼠,, .山羊抗兔,,.试剂盒 .,, .抗体 ; ,, .,.,, .抗体 , ,, .磷酸化 ,, .比色分析仪 ,, . ., ..仪器 激光多普勒脑血流仪 ., , .,, .奥林巴斯解剖显微镜 ,, .恒温控制电热毯 , .透射电子显微镜 ,.,, . , 低温切片机,.,, .匀浆器 ., ,,.立体定位仪 , ,, ,,, .微量调节注射器控制泵 .微量调节注射器支架 ,,, .连续波长酶标仪,.,,, . 微升离心机 ,, ,, .微波炉 .,., .旋涡混合器 ,,,坚垒山东大学博士学位论文 .水浴箱 .,, .二氧化碳培养箱 ,,, ,, .厌氧培养室、电子氧浓度分析仪?,. .超低温冰箱, ,, .奥林巴斯荧光显微镜 .,, .,, .奥林巴斯数字显微镜照相机 .灌流仪? .,, .方法 ..局灶性脑缺血模型的制备 /型野生型、基因敲除以及纤溶酶原基因敲除的雄性小鼠用氯胺 酮毫克/毫升及甲苯噻嗪毫克/毫升混合液进行麻醉。用一恒温电 热 毯将其肛温控制在。。利用大脑中动脉栓线阻断法制备短暂性局 灶性 脑缺血模型。手术步骤根据最初的方法进行了改进即:颈部正中切 口后,分离并结扎左侧颈总动脉以及颈外动脉。将一根尖端涂了硅胶的一号尼 龙线从颈总动脉切口处插入,并轻轻地向前推进到达大脑中动脉起始处,轻轻将 丝线固定。分钟后,将线轻轻拔出以实现再灌。整个过程中,用一个激光多普 勒仪监测脑血流。只有脑血流值降低%以上并实现完全再灌的动物才能被用于实 验中。 为了研究及对表达的影响,将基因敲除小鼠分三组,、后被放置在一个三维立体定位仪上,分别向缺血侧脑组织内注射 或 与受体相关蛋白, ,终浓度约为. 的混合液。 为受体的阻断剂,由马里兰大学的博士提供。为了研究对血管通透性的影响,将小鼠分两组,后向第三脑室注入 . ,一抑制剂,溶于中,对照组注入等量的。 扩散进入脑组织的终浓度约为 。随后静脉注射%的伊文斯蓝溶液. /山东大学博士学位论文 。脑皮质注射及第三脑室注射均用一个与微量注射器控制仪 相连的微量注射器进行操作。注射完毕后,针头留置在原位分钟 以防止反流。各项对动物的处理均经大学实验动物管理与使用委 员会 同意。 ..细胞培养 星形胶质细胞和神经元分别培养自出生一天的野生型/小鼠和第 天的胎鼠。星形胶质细胞的培养:分离小鼠大脑皮质,加入到无血清培养基。然 后用巴斯德吸量器反复吹打使其形成单细胞混悬液。细胞重新悬浮在含有葡 萄糖、%热灭活的马血清、%热灭活的胎牛血清、 谷氨酰胺、 /青 霉素和 /链霉素的培养基中,然后种植在包被了. / 多聚赖氨酸的姗盖玻片或者的培养皿。神经元细胞培养的培养:分离皮层组织,转移到含有%青霉素/链霉素和 的’平衡盐溶液 ,然后在含有.%酶的胰蛋白酶溶液中孵育分钟。反复吹 打组织,将上清转移到另一个管中,然后 离心分钟。细胞悬浮 在包含 一谷氨酰胺、%和%胎牛血清的培养基,种植在 包被了多聚赖氨酸的盖玻片或者 培养皿中。细胞在无血清培养基中小 时,用洗次,然后在氧糖缺失的环境下培养小时。为制造氧糖缺 失状态,培养基用无葡萄糖的’平衡盐溶液取代,’平衡盐溶液预 先在。用%/%进行处理,达到饱和。然后把培养物放到装置有进 . 气和排气阀的厌氧培养器? ,,用连续的 %/%气流平衡分钟。用这个装置,培养基里的氧浓度降到%以下。 然后密封小室,放到保温箱中。在开始实验以前用电氧分析仪确认一下氧浓 度小于%。在先前的研究中,我们使用一个比色测定方法对星形胶质细胞和神经 元培养基中乳酸脱氢酶的释放进行定量 , ,。我们发现星形胶质细胞及神经元暴露在环境下小时,与厂家 提供的细胞裂解试剂处理的培养基相比,释放到培养基中的分别小于%星 山东大学博士学位论文 形胶质细胞和?%神经元数据没有显示。作为对照,相似的另一组 细胞被放在正常含氧量的环境下。为了研究和相互作用对磷酸化的影响,几组星形胶质细胞和神经元细胞分别用 、鼠源 :终 浓度. 或鼠源和 :终浓度. 混合物中孵育。 ..小鼠脑组织总蛋白的抽提和蛋白浓度的测定 在再灌后的每个时间点,麻醉小鼠,用心脏灌流。取出大脑,分成缺血 侧和对照侧,用干冰快冻,用前一直保存在。。为提取蛋白,将每个 缺血侧: ; 脑组织放入 裂解缓冲液 , .: .%:% 一:%,% : ,然后用细胞破碎仪 .,,,进行匀浆化。将匀浆液在。以, 离心 分钟,收集上清,吸出 用于测定蛋白浓度。 我们使用蛋白分析试剂盒检测蛋白浓度。预先配制蛋白的个试剂加入 试剂。 稀释浓度,.,.,, /和反应液每 在一个干净、干燥的微量滴定板上,每个孔加入 标准蛋白溶液或样本。随 后在每个孔加入 反应液和 试剂。分钟以后,在处测光 密度。计算蛋白浓度。 。.免疫印迹分析法 将缺血脑半球以及培养的星形胶质细胞和神经元匀浆后,收集上清,同上。 取 样本与上样缓冲液混合,加在%?凝胶上,进行聚丙烯酰 分钟。。 胺凝胶电泳,,,, 分钟,然后 电泳缓冲液:.%甘氨酸,.%碱,以及.%十二烷基磺酸钠。随后 进行转膜膜,:,转移缓冲液:%甲醇,.%甘氨 酸,.%碱。然后膜用封闭缓冲液用超纯封闭缓冲液稀释, 和 .,,,封闭,用 .%小时,再在。一抗中孵育过夜。用多克隆山东大学博士学位论文 抗体:,:,检测磷酸化丝 氨酸和总。用?单克隆抗体?, :稀释. ,,探测后和小时野生型和一/一 小鼠脑提取物中的含量。在洗膜后,将膜在羊抗鼠?一:或者羊抗兔?一: 中孵育。然后用 检测信号。为了比较上样量是否一致,在一抗二抗去除液 .,,, 中洗膜,再检测含量。每个观察重复次。用 检验进行统定量测定条带的平均密度,用’ 计学分析。 ..免疫共沉淀法 进行免疫沉淀作用的研究,我们遵循以前的实验。简言之,将脑组织放 入含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂:,的裂解缓 冲液 ., , , ,% , ,%脱氧胆酸钠,.%进行匀浆化。随后, 离心,测定上 清液蛋白浓度。样本中 的抗体检测’胞 的总蛋白与 .博士提供。孵育 内区域最后个氨基酸:马里兰 分钟,再与蛋白/琼脂糖微球 : ,, ., 。过夜。离心收集琼脂糖微球,用预冷缓冲液钒酸钠, ,. 焦磷酸钠, 氟化钠, , . 还原样品缓冲液煮沸 抑肽酶/ 亮肽素/洗次,用. 分钟,用%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,用免疫印迹法分析和 含量。 ..制备..大脑冰冻切片 在再灌后的每一个时间点,麻醉小鼠,用心脏灌流。取出脑,放到 包含 ,,,的小容器中。预先把盛有山东大学博士学位论文 ,,的烧杯放在干冰上分钟。把包含 的小容器放到烧杯中速冻。冰冻后取出...包埋的脑组织,切片前 应保存 在一。冰箱中。用恒冷切片机从前囟点前. 开始进行冠状切片, 每片厚度。每个脑收集 间隔的个连续的切片。 ..免疫荧光法 在冷甲醇在。保存中固定 后,将切片放在热柠檬酸液在 微波炉内预热中孵育,然后在配制的%山羊血清中孵育, 再在。一抗中孵育过夜,在二抗中孵育分钟,单个步骤之间用洗。 再 ,:进行复染,用 用’一一一 包埋,迅速用免疫荧光显微镜分析。 脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法 用一个包含末端脱氧核糖核苷酸末端转移酶和一个与荧光素分子 偶联的脱氧核糖核苷酸衍生物地高辛一 抗体的试剂盒来原位检测断裂 片段的’一。简言之,切片用%固定,随后在室温条件下用乙醇和 乙酸混合物:固定。应用平衡缓冲液秒钟,切片与酶溶液反应缓 以 冲液中加入%酶。孵育 。室温下与终止缓冲液孵育 结束反应。将切片与二抗地高辛 抗体封闭溶液含%抗异羟洋地黄 毒苷配基结合物避光室温孵育 。切片用染色。 ..伊文斯蓝渗出法 用伊文斯蓝染色法确定小鼠脑动脉闭塞后血脑屏障通透性。以磷酸缓冲 , 液..配制的%伊文斯蓝溶液,每 体重. 后立刻注射入眼静脉。再灌后个小时,以/的速度向左心室注射彻 底清洗血液循环系统中的伊文斯蓝,闭塞血管中伊文斯蓝则保留 在血管中。处死 动物,取出大脑,分缺血侧及对照侧,贮存在。。待所有的样本收集全后, 称重每个半球,加入 ,一二甲基酰胺进行匀浆化, 然后室温下以,离心半小时。将上清转移到孔板,检查光密度。 山东大学博士学位论文 以波长 处的光密度减去背景光密度和 基本光密度,除以每 个半球的净重确定伊文斯蓝的量。 .。免疫胶体金电镜检测技术 野生型和//、鼠脑缺血再灌小时后,用水合氯醛 /麻醉动 物,用 含有%新鲜的多聚甲醛和.%戊二醛. 的磷酸盐缓冲液 .?.以 /的流速经心脏灌注。取出大脑,用同样的固定液。再固 定小时,使用振动切片机 ; , 以 厚度进行冠状切片。收集切片,用磷酸缓冲液彻底冲洗。为了提高试剂 穿透性,切片用磷酸缓冲液处理,缓冲液包含.% ,然后用含有 %标准羊血清、%牛血清白蛋白和.%鱼皮明胶的封闭液孵育小时,然后用可 以检测在位丝氨酸磷酸化的抗体孵育。切片用饱和乙酸双氧铀和枸橼酸 铅复染,用一个 透射电子显微镜检测。 .. 明胶酶谱法 再灌后小时,麻醉小鼠,用经心脏完全灌注。快速取出大脑,分成缺 血侧和对照侧,加入到含蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液%?, ., ,%, 中在冰上匀浆化。匀浆组织在。以, 离心 。用 ,,,测定上清的蛋 白浓度。每个样品取同量的蛋白与此明胶琼脂糖凝胶 , ,。孵育小时。收集珠子,用裂解液洗两遍,在上样缓冲液 中孵育分钟。离心后,收集上清,加入到%明胶凝胶孔,,。 恒压电泳.,缓冲液是甘氨酸电泳缓冲液.%甘氨酸,.% 碱, .%十二烷基磺酸钠。取下凝胶,室温下在还原缓冲液.%:,,中孵育小时。然后放入显像缓冲液 ?, , , , :, .% ,。孵育过夜。用.%考马斯亮蓝一?,,含% 甲醇以及%乙酸染色小时。用脱色液%甲醇 %乙酸脱色遍。山东大学博士学位论文 在适当的分子量处出现清晰的区间或条带,以此比较明胶酶活性。小鼠删一 ,,用做标准。 .统计分析 资料用方差分析和检验进行统计学分析。统计学有效度定为.。 山东大学博士学位论文 以波长 处的光密度减去背景光密度和 基本光密度,除以每 个半球的净重确定伊文斯蓝的量。 .。免疫胶体金电镜检测技术 野生型和//、鼠脑缺血再灌小时后,用水合氯醛 /麻醉动 物,用 含有%新鲜的多聚甲醛和.%戊二醛. 的磷酸盐缓冲液 .?.以 /的流速经心脏灌注。取出大脑,用同样的固定液。再固 定小时,使用振动切片机 ; , 以 厚度进行冠状切片。收集切片,用磷酸缓冲液彻底冲洗。为了提高试剂 穿透性,切片用磷酸缓冲液处理,缓冲液包含.% ,然后用含有 %标准羊血清、%牛血清白蛋白和.%鱼皮明胶的封闭液孵育小时,然后用可 以检测在位丝氨酸磷酸化的抗体孵育。切片用饱和乙酸双氧铀和枸橼酸 铅复染,用一个 透射电子显微镜检测。 .. 明胶酶谱法 再灌后小时,麻醉小鼠,用经心脏完全灌注。快速取出大脑,分成缺 血侧和对照侧,加入到含蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液%?, ., ,%, 中在冰上匀浆化。匀浆组织在。以, 离心 。用 ,,,测定上清的蛋 白浓度。每个样品取同量的蛋白与此明胶琼脂糖凝胶 , ,。孵育小时。收集珠子,用裂解液洗两遍,在上样缓冲液 中孵育分钟。离心后,收集上清,加入到%明胶凝胶孔,,。 恒压电泳.,缓冲液是甘氨酸电泳缓冲液.%甘氨酸,.% 碱, .%十二烷基磺酸钠。取下凝胶,室温下在还原缓冲液.%:,,中孵育小时。然后放入显像缓冲液 ?, , , , :, .% ,。孵育过夜。用.%考马斯亮蓝一?,,含% 甲醇以及%乙酸染色小时。用脱色液%甲醇 %乙酸脱色遍。山东大学博士学位论文 第三章结果与分析 .兴趣区域的确定 伴随着脑缺血的发生一个严重的缺血区域快速形成,那里的神经元受到不可 逆的损伤坏死核心区。这一区域周围被称为“缺血半影区”。那里的脑血流 有效的减少,使动作电位消失,但仍能足够维持膜电位和细胞离子的内环境的稳定 。随着时间推移,这种潜在的可救援的区域也就是“缺血半影区,可能演变 成梗死和不可逆的损伤。越来越多的证据显示半影区的生化反应不同于那些核心 区坏死。事实上,神经放射学的研究已经证明脑缺血后反应神经血管单元 通透性的脑水肿区的边缘位于半影区。因此定义兴趣区域是至关重要的, 这样在每一只动物上的所有观察都能准确地定位在大脑的相同区域。为此,野生 型小鼠被放在脑功能区定位的头套中,并固定标记脑血流量的内置表面线 圈。弥散加权影像和灌注加权影像在后、、、和分钟获得。 通过分别沿着、、轴应用不同弥散敏感梯度作图获得的三张表观弥散系数 图叠加后得到平均表观弥散系数。的定量测量使用单次激发、梯度 回波序列持续动脉自旋标记技术。参数和的测量除了不同 外,其它方面非常相似。使用快速自旋回波脉冲序列获得解剖序列加 权影像。在图上脑容积的变化的区域脑组织不可逆的损伤、图的黑区和 图的红区和脑血流下降大于%的区域图的黑区不重叠的部分被认为 是不匹配的区域“缺血半影区,在图的黄色区域。然后我们把每个冠状 切面成个正方形区域每个,包括坏死核心区和“半影”区域图。 兴趣区域和一和选择在缺血半影区和坏死核心之间的边缘,而兴趣 区域和和分别位于缺血皮层和坏死核心区图。然后我们进 行免疫荧光化学分析,用兔抗一多克隆抗体:稀释;,, 从相同脑中切段用于研究测定微管相关蛋白一的表达。我们 发现正如其他人描述的诱发了在坏死核心区的凇一免疫反应性快速 减少图。因此,在免疫荧光化学研究中我们使用一免疫反应作为工具 山东大学博士学位论文 定义切片中脑缺血半影区和核心坏死之间的边界。这将会使我们更准确的确定每 ~个动物的脑的相同区域。 . 在神经血管单元中的表达 已经有证据表明,在缺血半影区的血管周围引起的活性快速增 加然而,对于具有这种上调活性的细胞类型还没有确定。因为在,%的 血管表面是被星形胶质细胞包围‘蚰。因此,我们决定研究是否 在这些细胞里 表达。我们对培养的野生型小鼠星形胶质细胞的进行免疫荧光化学分析。所 ,和核标 使用的抗体是抗单克隆抗体:; 记物’,二脒基苯吲哚盐酸。我们的结果显示在星形胶质细胞中 表达图。 . 后与的磷酸化 开始后的早期,局部缺血组织中的表达短暂性增高被认为是神经 保护反应?。有趣的是,一些最近的研究显示,在中风动物模型注射重组 后,在缺血脑组织中的表达减少相反,另有研究发现,在培养的神经 元中诱导的快速增加“?。总之,这有分歧的研究结果显示在缺血脑组 织中和存在一种联系,而对这种联系,目前所知的还比较少。因此,我 们决定进一步研究在脑缺血诱导的磷酸化中的作用。首先,我们通过免 疫印迹法分析了和/一小鼠再灌后小时在位丝氨酸的磷酸化 的表达水平。我们的结果显示型小鼠诱导一个快速而短暂的增 加, 峰值在小时,继而消失。相反,在一/一小鼠中,再灌后小时我们没有观察 到表达水平的明显增加。事实上,在一/一小鼠中的表达有明显的增 加只是在再灌后小时。但是,与型小鼠不同,小时后一/小鼠脑中 水平仍然较高图。 为了进一步证实在磷酸化中的作用,我们在一/一小鼠再灌后立即 ,,再灌小时 向缺血脑组织内注射重组埘: 后处死, 然后提取脑组织进行免疫印迹法分析的表达。我们的结果显示相山东大学博士学位论文 对于型小鼠,一/型小鼠缺血脑组织内注入后,磷酸化的水平恢复 至型小鼠中的水平图。 为了研究在哪型细胞诱导的表达,我们进行免疫荧光化学分析 在和一/一小鼠中再灌后到小时的表达。我们的结果证明在小鼠中 诱导的快速而短暂的增加多集中在血管周围星形胶质细胞和一些神经 元。相反,在一/一型小鼠中,我们观察到的表达持续增加是在神经元而不 是血管周围星形胶质细胞。如上所述,在一/鼠的神经元中的表达持续 高达小时图。为了进一步确定这些结果,我们利用电子显微镜分析 作用小时后在和一/一小鼠脑切片每一个中的表达。结果证明, 作用小时后,在小鼠,血管周围星形胶质细胞的明显表达增加, 这一区域与脑水肿的形成密切相关。在一/鼠并未观察到图。 .缺血脑组织中磷酸化的表达 为了进一步研究在缺血脑组织中的表达,我们对和/、鼠 小时/再灌注小时的脑切片进行免疫荧光化学分析。我们观察到和/一 小鼠脑切片的神经元中的表达并无显著的增加数据没有显示。然而, 我们检测到在型小鼠血管周围星形胶质细胞中的表达显著增加图 而在一/一型小鼠中没有观察到图。 . 对诱导的表达的作用在神经元中的意义 我们的结果显示,与型小鼠不同,的缺乏与后神经元的持 续表达有关。因为磷酸化已经被认为是缺血损伤的神经保护反应。所以我们 决定研究缺乏在细胞死亡中的作用。已知脑缺血诱导聚腺苷酸二 磷酸核糖转 移酶一?的裂解激活,这被认为是细胞死亡的“。因此,我们研究了 后和小时和一/一小鼠一的裂解。我们的结果显示,在型 小鼠脑缺血导致一的裂解,这种作用在/、鼠中明显减少图。为 了进一步确定这些观察,我们研究是否的缺乏对细胞凋亡有作用。为达到这 一目标,我们在和一/一小鼠作用小时后进行末端脱氧核苷山东大学博士学位论文 酸转移酶生物素末端标记染色。我们的结果证明在每一个的阳 性神经元的数目从小鼠的.%减少到一/一小鼠的.?.%图 :木.。 . 在血管周围星形胶质细胞中的作用 我们的研究表明,缺血损伤会引起野生型小鼠而非,鼠中表达 的急剧增加。中大约%的脑微血管基底膜被血管周围星形胶质细胞包围, 因此它们在调节血脑屏障的通透性中起决定性作用。因此,我们决定研究抑 制对后的渗透率的抑制作用。野生型小鼠前脑室内注射 的抑制剂;.;,.,,小时后测定伊文斯蓝渗透 率,这是一种代表渗透率的常用标记。我们发现,和对照组相比, 注射了 的小鼠伊文斯蓝渗透率降低了?%图。 . 通过一种不依赖纤溶酶原的机制诱导磷酸化 正如我们上面所讨论的,在的血管内和血管周围都有表达。在血管 内腔,的主要底物是纤溶酶原。然而,越来越多的迹象表明在脑组织的作 用不是通过纤溶酶原介导的。为了研究在局部缺血的早期,纤溶酶原是否介导 对磷酸化的作用,我们对小时/再灌小时一/一小鼠的进行免 疫印迹分析。结果表明在/鼠中对表达的效果与野生型小鼠没 有什么分别,这就表明对的作用是通过一种不依赖纤溶酶原的机制来实 现的图。 . 在神经血管单元中的表达 已经有证明是在中枢神经系统的受体之一。因此,我们决定研 究是否调节在脑缺血后对的作用。神经元在细胞信号传导中 的作用已经有一些相关的研究阳。无论是鼠脑还是人脑,在体内的内皮细 胞中不表达。然而,至于是否在星形胶质细胞中表达仍然没有研 究。为此, 山东大学博士学位论文 我们对培养的野生型的小鼠星形胶质细胞进行免疫荧光化学染色。结果证明 也在星形胶质细胞中表达图。 .大脑中动脉闭塞使血管周围星形胶质细胞中表达增加 探讨大脑动脉闭塞对血管周围星形胶质细胞的影响,我们用电镜分析法分析 ,在野生型小鼠大脑动脉闭塞后小时,在其大脑任一兴趣区域,我们用抗 体 来检测的细胞内域,同时也用抗体检测的细胞外域。结 果显示,局部缺血的神经血管单元的基底膜上细胞外域的星形胶质细胞有所 增加;但是在对侧的非缺血半球就没有观察到这种现象。图 ,,。高放大 倍率图像所呈现的结果显示, 免疫反应阳性区域与星形胶质细胞足突与基 底膜分离的区域以及最终形成血管周围水肿的区域密切相关。 .在缺血脑组织介导了诱发的的磷酸化作用 为了测定在局部缺血的脑组织中,、和磷酸化的之间是否有一 定联系性,我们将一/一小鼠分两组,一组脑内注射 重组,另一组注射 等量与混合液。缺血再灌小时后,处死动物,提取脑组织蛋白进行免 疫印迹分析的表达。一/鼠注射重组后,的表达水平提高到与 小鼠相当的水平。相反,在联合注射了与混合液的一/一小鼠, 的表达并无明显增加图。 . 与相互作用对磷酸化的影响具有细胞特异性 我们早期研究结果表明,在磷酸化过程中所起的作用具有细胞型特 异性作用。例如,增加血管周围星形胶质细胞中的磷酸化,减少神经元中 的磷酸化。因此,我们决定要研究抑制剂在神经细胞和星形胶质细胞中对 诱发的的磷酸化的作用。我们将培养的野生型小鼠星形胶质细胞和神经细 胞各分三组,均暴露在环境中小时,培养液中加入重组或与 的混合液。然后提取免疫印迹法测其表达。我们发现可以引发大量的的山东大学博士学位论文 磷酸化,但是一旦加入了受体相关蛋白,此效果就会消失。相反,会减少神经 细胞中的的磷酸化作用,而加入了受体相关蛋白的则会增加的磷酸化作 用图。这些结果共同印证了我们最初的假设:在缺血脑组织中对的 磷酸化作用具有细胞特异性。 .在缺血脑组织中,诱导了的胞内段与磷酸 化的的相互作用 研究结果显示,在与之间存在着直接的相互作用。为了进一步验证 这个假说,我们对大脑中动脉闭塞小时后的野生型小鼠和一/一的小鼠的脑组 织提取物中进行免疫共沉淀实验。先使用识别细胞内域的抗体 进行免 疫共沉淀反应实验,接着使用抗磷酸化的的抗体进行蛋白印迹分析。另一组 野生型小鼠,在大脑动脉闭塞之后给予脑内注射。同样的,另一亚组的一/一 小鼠,在大脑中动脉闭塞后给予脑内注射重组。研究结果表明,大脑中动脉闭 塞引发了细胞内域与磷酸化的的相互结合,并且这种相互作用在一/一 小鼠组和加入了受体相关蛋白的野生型小鼠组中会有所减弱图。为了更加清 晰的明确这些特征,我们使用电子显微镜的共同定位作用来观察 在大脑中动脉闭 塞小时后的野生型小鼠细胞内域和磷酸化的的共存。我们发现,在大 脑中动脉闭塞后,磷酸化的和细胞内域在血管周围星形胶质细胞中的每 一个兴趣区域发生共同存在图。 . 抑制减弱星形胶质细胞中由脑缺血诱发的】 的激活 我们以前的研究揭示了和间的相互作用可以引发血管周围星形胶质 细胞中 的激活并伴随着神经血管单元的渗透性的增加为了研究星形胶 质细胞中的磷酸化是否调节对 活化的作用,我们将培养的野生型 小鼠的星形胶质细胞暴露在氧糖剥夺的状态下,加入或者是和 的混合剂,接着用蛋白印迹分析法分析在丝氨酸位的磷酸化的情况,这 是 活化作用的指示剂。我们得到的结果显示,星形胶质细胞中的引起 山东大学博士学位论文 了的磷酸化反应,但是如果星形胶质细胞培养液中同时加入和 ,那么这个作用则会消失图。总之,这些数据支持了我们之前的 活化中的作用。 假说,即的磷酸化介导了在? . ;取消了由脑缺血诱发的基质金属蛋白酶一的激活 早先的研究表明,大脑中动脉闭塞后,和问的相互作用可以诱导? 的激活以及增强基质金属蛋白酶一的活性‘’’?。此外,在对动物阳和人 类玎的研究中均发现,在大脑中动脉闭塞的早期阶段,基质金属蛋白酶一可以增 加神经血管单元的渗透性。由于基质金属蛋白酶一是? 的下游基因之一, 我们决定研究观察到的结果,看与以及磷酸化之间的相互作用对血 脑屏障通透性方面的影响是否由基质金属蛋白酶一实现。为了完成这个目标,我 们利用明胶酶谱法分析在大脑中动脉闭塞后,加入了磷酸缓冲液或者 的野生型小鼠的脑组织提取物中活性。结果显示,用抑制 的磷酸化作用减弱了脑缺血组织中,大脑中动脉闭塞诱发的,基质金属蛋白酶一 活性的增强图 我们研究的数据表明,在血管周围星形胶质细胞中,和之间的相互 的活化作用。这 作用启动细胞信号通路,诱导的磷酸化,并由此引发? 就引起 控制已知可以用来增加神经血管单元的渗透性的基因例如,基质 金属蛋白酶一的激活。在我们观察的基础上可以指出,脑缺血后脑水肿的发生, 不是血脑屏障紊乱的结果。而是精确调节的细胞内信号过程,由和的相 互作用引发,并且最终导致了神经血管单元通透性的增加。而且,我们的研究数 据表明,与目前报道的相反,的磷酸化作用在局部缺血的大脑中起到了双重的 作用。确实,血管周围星形胶质细胞中的的磷酸化作用对神经血管单元的通 透性有着不利的影响,而在神经细胞中的的磷酸化则具有保护作用。山东大学博士学位论文 第四章讨论 神经血管单元是一个由内皮细胞、基底膜、管周细胞、星形胶质细胞和神经 细胞组成的功能结构。这些细胞动态的相互作用,并且互相沟通, 共通调节一些 功能活动,例如,血脑屏障通透性、脑血流量以及突触活动。血管周围星形胶质 细胞的终足覆盖%的微血管基底膜‘舶,并且起到重要的血脑屏障的功能。正常 神经血管单元功能的破坏常与机体机能失调现象相联系,包括中风。前面的研究 显示在中风后,血管周围星形胶质细胞的终足与基底膜发生分离,伴随着早期血 管周围水肿的出现‘。因此,对于神经血管单元功能的研究对于中风的治疗起 到非常重要的作用。 是一种丝氨酸蛋白激酶,最初被描述为一种可以将血浆中无活性的纤溶 酶原转化为具有广泛底物的纤溶酶。纤溶酶又分成血纤维蛋白以及血块中其 他的重要成分,会导致纤维蛋白溶解和血栓溶解。最终结果是堵塞的血管得以 再通,同时也维持了未堵塞血管保持畅通,这也是在脑缺血中作为血栓溶解 剂的基本原理。 然而,就血脑屏障的破坏这个方面来看,可以扩散进入脑实质,并 且它 的有害作用可以抵消其在血栓溶解中所起到的有益作用’&飘 等人发 现,用伊文斯蓝渗透率作为一个渗透性指标来评定血脑屏障的破坏,应用活性 的实验组中此值比生理盐水组的高很多们。在一个大鼠的栓子模型中,缺血后使 用可以使得在缺血中心区的血脑屏障的通透性显著增加,这可以与应用盐溶 液的大鼠组作为对照。,等人证明,在神经血管单元内血管周围的 增加是实验性脑缺血的一种结果。这样会导致血脑屏障的开放和脑水肿的发生, 同时这种渗透性的增加是由来调节的“钉。在兴奋性毒素伤害中, 在中枢神经系统的所属细胞中介导了神经毒性,促成毒害神经的作用同时也改 变血脑屏障的通透性,从而更进一步的促使神经元降解。 正如我们所知,通常在静脉、毛细血管、动脉的内皮细胞中发现血管 内空间,在血管受到伤害后会分泌,使无活性的纤溶酶原转化成活性纤溶酶以分 山东大学博士学位论文 解血块。在中枢神经系统,还存在于血管外空间脑实质。 发现, 既可以在神经细胞中释放也可以在小神经胶质细胞中释放。它可以促成神经细 胞的死亡,以及小神经胶质的活化作用。这里我们发现也可以被星形胶质 细胞所分泌,而且涉及了对于血脑屏障通透性的调节作用。 在血管内空间,的主要底物是纤溶酶原。然而,大量的证据表明, 在中枢神经系统血管外空间的作用与血纤溶酶原无关。研究显示,的有害作用, 如:在大脑中动脉闭塞后引起神经血管单元的损害,瑚,’们,是通过与它的 相应受体相互作用来实现的。 属于低密度脂蛋白受体相关蛋白受体超家族,由胞外的的链 和跨膜的一的链组成,后者包括一个跨膜部分和充满酪氨酸残基的胞质尾 区。 不仅与多种配体的内吞作用钉有关,而且还涉及细胞信号传导通路‘朋, 以及神经传递们。在中枢神经系统,在神经细胞化和血管周围星形胶质细 胞中发挥其作用阴。我们发现在大脑中动脉闭塞发生后的早期,血管周围星形胶 质细胞中的表达有所增加。虽然已知在神经细胞中,则与细胞信 号传导 通路相关联‘’,但是在血管周围星形胶质细胞终足所起到的作用更是并不 为人们所了解。 等人发现在一个小鼠永久性缺血模型中,通过与相互作用, 介导了脑缺血早期大脑中动脉阻塞后到小时血脑屏障功能的破坏钉。 完全探讨在缺血性中风情况下,与相互作用与血脑屏障破坏之间的关系 还需要进一步的研究。 众所周知,在与相互作用之后,细胞外域脱落汹。脱落的包 含链和链上的片段。而跨膜的部分要经过受 调节的膜内蛋白质裂解 ,过程释放 胞内段。这种被释放的细胞内域大约有千道尔顿,其中包含了许多能够与细胞 浆信号衔接蛋白发生相互作用的序列,以此来发挥作用。但和中枢引起 神经血管单元通透性增加的基本的信号转导机制还不太为人所了解。 少数的研究者曾经探索过在大脑缺血状态下的磷酸化水平的变化。 等人发现磷酸化的丝氨酸的