离体脊髓运动神经元—颈上神经节神经元突触形

离体脊髓运动神经元—颈上神经节神经元突触形 离体脊髓运动神经元—颈上神经节神经元突触形 离体脊髓运动神经元—颈上神经节神经元突触形 截瘫病人可通过手术建立体神经-内脏神经反射弧,重构膀胱的神经支配,达到功能重建的目的。在此过程中,出现了一种全新类型的突触――躯体运动神经与内脏神经的吻合建立了有功能的突触联系,但迄今缺乏对该类突触的认识。近年,经过对躯体运动神经――内脏神经吻合后形成的突触进行了在体研究,发现其主要的神经递质仍为乙酰胆碱(acetylcholine , ACh),其可塑性独具特征。但囿于吻合术导致的组织粘连、炎性反应及组织成分的复杂性,无法去除“干扰”而对该类神经元突触的基本特征作系统、全面的研究,迄今为止,仅为躯体运动神经元与副交感节后神经元形成的突触,业已知道,生理状态下脊髓前角运动神经元和副交感节前神经元释放的主要神经递质均为ACh,且吻合术后的在体研究亦证实其主要递质仍为ACh,那么,该突触的形成是因为其具有相同的神经递质和相应的受体吗?是否只要能合成、释放相同神经递质及具有相应受体的神经元,不论是同类神经元(都是躯体运动)还是异类神经元(躯体运动与内脏)都能建立功能性的突触联系?交感神经的节前纤维释放的递质也主要为ACh,也与运动神经元释放的递质相同,那么,运动神经元与交感神经的节后神经元能建立有功能的突触联系吗?本研究中,首先,分离培养脊髓运动神经元(spinal motoneuron, SMN)和颈上神经节神经元(superior cervical ganglion neuron, SCGN)。培养液中添加促运动神经元最强的细胞因子――胶质细胞源性神经营养因子(glial cell derived neurotrophic factor, GDNF)和交感神经元生长不可缺少的神经生长因子(nerve growth factor, NGF),将二者添加在条件培养基Neurobasal medium A、B27复合添加剂中,制成全培养液,以此全培养液分别原代培养SMN和SCGN,其间采用差速贴壁法对SMN进行纯化,观察了它们生长情况,并用神经元的标志物NF200抗体分别与SMN的标记物ChAT抗体和星形胶质细胞的标记物GFAP抗体作免疫荧光双标,辅以Hoechst核染荧光显示细胞核,计数培养细胞中SMN量和SCGN量;其次,建立离体培养的SMN-SCGN突触模型。用琼脂糖和PDL对培养盖片进行“微岛化”处理,在其上低密度培养SCGN,随后用荧光染料 DiI予以标记,再将经差速贴壁的E16 d胎鼠脊髓腹侧组织制成的细胞悬液接种于其上,即作SMN和SCGN的共培养,用突触形成的标记物p38抗体和ChAT作免疫荧光双标,显示以SMN为突触前神经元的突触形成情况,并用突触计数、Western blot和RT-PCR揭示突触形成的情况,结合电镜观察佐证SMN-SCGN突触的形成,再在SCGN上记录微小自发突触后电流(miniature spontaneous current, mSPC),证明功能性突触的形成;再次,借助烟碱型受体的特异性阻断剂(HEX)和乙酰胆碱脂酶抑制剂(THA),辅以谷氨酸非NMDA受体阻断剂(CNQX),对SMN-SCGN突触的神经递质和受体作初步研究;最后,外源性加入星形胶质细胞条件培养基(ACM),观察其对SMN-SCGN突触形成的影响。主要结果: 1.按此方法原代培养的SMN和SCGN生长状态好,SMN在培养14 d后,生长晕消失,胞质内出现小的黑色颗粒和空泡状结构,突起断裂,大部分细胞变圆、变暗,可见少许散在的细胞碎片,逐渐开始衰老;而SCGN培养16 d时,仍生长晕清晰,细胞状态好。经NF200、ChAT和GFAP免疫荧光及Hoechst核染显示:神经元纯度达8 7.8%,SMN纯度达70.9%,而SCGN纯度更高达95%; 2. SCGN培养1 d后,可用DiI进行标记,经标记的神经元发红色荧光,荧光长期存在,且不会影响其存活状态; 3. SMN和SCGN能在经“微岛化”处理的盖片上作共培养,共培养组的突触计数要显著高于SCGN组和SMN组; 4. Western blot提示:在SCGN组未能检测出p38,而共培养组p38含量要显著高于SMN组; 5. RT-PCR提示:共培养组p38mRNA表达要显著高于SCGN组和SMN组之总和; 6.共培养组经筛选、定位,电镜观察到突触样结构; 7.培养4 d时,仅在共培养组的SCGN上能记录到微小自发突触后电流,而SCGN组的SCGN上不能记录到微小自发突触后电流; 8.六烃季铵能阻断共培养组SCGN上记录到的微小自发突触后电流,THA能增强其微小自发突触后电流,而CNQX对该录微小自发突触后电流无作用;9. ACM能增强共培养的SCGN上记录到的微小自发突 触后电流,频率增加、电流幅度增大。主要结论: 1. SMN和SCGN能用相同的无血清全培养液进行原代培养,培养纯度高,SMN存活14 d以后,可能会老化,而SCGN则能存活更长时间; 2.在经“微岛化”处理的盖片上作共培养,SMN与SCGN之间能建立功能性的异类神经元突触联系,形成SMN-SCGN突触模型; 3. SMN-SCGN突触的神经递质为乙酰胆碱,受体为烟碱型N1受体; 4. ACM能促进SMN-SCGN突触的的形成; 5.在体外培养条件下,分泌相同神经递质和具有相应受体的不同类型神经元(躯体运动神经元和内脏神经元)间能形成功能性的突触联系,其主要神经递质和受体不发生改变,且同样受胶质细胞的调控。总之,本研究通过分离培养SMN和SCGN,以微岛共培养的方法建立SMN-SCGN突触模型,并采用免疫荧光双标、Western blot、RT-PCR、透射电镜和膜片钳方法,确认其功能性突触的形成,确认其神经递质为ACh,受体为烟碱型N1受体,且ACM能促进其突触形成。本研究能为解除因脊髓或内脏神经系统损伤造成的脏器或组织功能障碍、实现内脏神经的功能重建提供理论参考,有助于全面认识突触的形成机制,为深入研究突触形成的调控机制提供新思路、新视角。 常用英文缩写一览表5-8英文摘要8-12中文摘要12-15正文 离体脊髓运动神经元-颈上神经节神经元突触形成及特征的初步研究15-70第一部分 脊髓运动神经元和颈上神经节神经元的分离培养与鉴定15-30材料与方法16-21实验结果21-25讨论25-27小结27-30第二部分 离体脊髓运动神经元-颈上神经节神经元突触模型的建立30-53材料与方法31-43实验结果43-48讨论48-50小结50-53第三部分 脊髓运动神经元-颈上神经节神经元突触神经递质及受体的初步研究53-59材料与方法53-55实验结果55-56讨论56-58小结58-59第四部分 ACM 对脊髓运动神经元-颈上神经节神经元突触形成的影响59-67材料与方法59-61实验结果61-64讨论64-65小结65-67全文67-69致谢69-70文献综述?70-80文献综述?80-89在读期间发表的文章89