植物蛋白质提取方法总汇

植物蛋白质提取方法总汇 一、植物组织蛋白质提取方法 1、根据样品重量(1g样品加入3.5ml提取液，可根据材料不同适当加入)，准备提取液放在冰上。 2、把样品放在研钵中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上静置(3-4小时)。 3、用离心机离心8000rpm40min4?或11100rpm20min4?4、提取上清液，样品制备完成。 蛋白质提取液:300ml 1、1Mtris-HCl(PH8) 45ml 2、甘油(Glycerol)75ml 3、聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpolypyrrordone)6g这种方法针对SDS-PAGE，垂直板电泳～ 二、植物组织蛋白质提取方法 氯醋酸—丙酮沉淀法 1、在液氮中研磨叶片 、加入样品体积3倍的提取液在-20?的条件下过夜，然后离心(4?8000rpm以上1小时)2 弃上清。 3、加入等体积的冰浴丙酮(含0.07%的β-巯基乙醇)，摇匀后离心(4?8000rpm以上1小时)，然后真空干燥沉淀，备用。 4、上样前加入裂解液，室温放置30分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心(15?8000rpm以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准)，可临时保存在4?待用。 5、用Brandford法定量蛋白，然后可分装放入-80?备用。 药品:提取液:含10%TCA和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮。裂解液:2.7g尿素0.2gCHAPS溶于3ml灭菌的去离子水中(终体积为5ml)，使用前再加入1M的DTT65ul/ml。 这种方法针对双向电泳，杂质少，离子浓度小的特点～当然单向电泳也同样适用，只是电泳的条带会减少～ 三、组织:肠黏膜 目的:WESTERN BLOT检测凋亡相关蛋白的表达 应用TRIPURE提取蛋白质步骤: 含蛋白质上清液中加入异丙醇:(1.5ml每1mlTRIPURE用量) 倒转混匀，置室温10min 离心:12000 g，10min，4度，弃上清 加入0.3M盐酸胍/95,乙醇:(2ml每1mlTRIPURE用量) 振荡，置室温20min 离心: 7500g，5 min，4度，弃上清 ,乙醇步2次 重复0.3M盐酸胍/95 沉淀中加入100,乙醇 2ml 充分振荡混匀，置室温20 min 离心: 7500g，5min，4度，弃上清吹干沉淀 1,SDS溶解沉淀 离心:10000g，10min，4度 取上清-20度保存(或可直接用于WESTERN BLOT) 存在的问题:加入1,SDS后沉淀不溶解，还是很大的一块，4度离心后又多了白色沉定，SDS结晶,测浓度，含量才1mg/ml左右。 ,10分钟，解决:提蛋白试剂盒，另外组织大小适中，要碎，立即加2X BUFFER，然后煮5效果很好的。 四、植物材料:水稻苗，叶鞘，根 1、200毫克样品置于冰上磨碎 2、加lysis buffer，离心，10000rpm，4度，5min取上清 3、重复离心5min lysis buffer:urea np-40 ampholine 2-me pvp-40 五、蛋白质样品制备 秧苗蛋白质样品的提取按Davermal等(1986)的方法进行。 100mg材料剪碎后加入10mgPVP-40(聚乙烯吡咯烷酮)及少量石英砂，用液氮研磨成粉，加入1.5 ml 10% 三氯乙酸(丙酮配制，含10mM即0.07%β-巯基乙醇)，混匀，-20?沉淀1小时，4?，15000 r/min离心15 min，弃上清，沉淀复溶于1.5ml冷丙酮(含10 mMβ-巯基乙醇)，再于-20?沉淀1小时，同上离心弃上清，(有必要再用80,丙酮(含10 mMβ-巯基乙醇所得沉淀低温冷冻真空抽干。 按每mg干粉加入20μl(可调) UKS液[9.5 M尿素，5mM碳酸钾，1.25%SDS，0.5%DTT(二硫苏糖醇)，2% Ampholine (Amersham Pharmacia Biotech Inc，pH3.5-10)，6% Triton X-100]，37?温育30min，期间搅动几次，28度 (温度低，高浓度的尿素会让溶液结冰)16000 r/min 离心15 min，离心力越大时间长一点越好～上清即可上样电泳。或者-70度保存。 六、植物根中蛋白质的抽取 (1) sample, 液氮研磨 (2) 装1.5 ml centrifuge 用tube 1M KH2PO4 K2HPO4 700 ul (3) 加 (4) 12000 rpm, 4度, 10-15minite (5) 取上层液，蛋白质就在里面