磷脂酰肌醇-3激酶信号转导通路在缺氧诱导的人视网膜色素上皮细胞增生中的作用_8419

磷脂酰肌醇-3激酶信号转导通路在缺氧诱导的人视网膜色素上皮细胞增生中的作用_8419 磷脂酰肌醇-3激酶信号转导通路在缺氧诱导的人视网膜色素上皮细胞 增生中的作用 作者：兰兰，王雨生，王耀春，张鹏 【摘要】 探讨磷脂酰肌醇-3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K）在缺氧诱导的人视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium, RPE）细胞增生中的作用。方法：利用CoCl2法建立培养细胞缺氧模型。在缺氧条件下培养人RPE细胞1，4，8，12和24h，流式细胞仪检测RPE细胞的增生活性，RT-PCR和Western blot检测磷酸化PI3K mRNA和蛋白的表达水平。用30μmol/L PI3K特异性阻断剂LY294002处理RPE细胞，作为阻断实验组。结果：随缺氧时间延长， RPE细胞增生活性逐渐增高，磷酸化PI3K mRNA和蛋白表达水平逐渐增 高。LY294002处理组较对照组RPE细胞增生活性显著降低（P ＜0.05）。论：缺氧诱导的RPE细胞增生部分是通过PI3K信号转导通路实现的。 【关键词】 磷脂酰肌醇3-激酶 0引言 在年龄相关性黄斑变性（age-related macular degeneration, AMD）眼内，由于脉络膜新生血管（choroidal neovascularization, CNV）生成，继发一系列渗出、出血和瘢痕形成等改变，导致患者视力 明显下降，甚至丧失。实验及临床研究表明，CNV的发生与脉络膜局部缺氧有关[1]。在CNV的发生过程中，人视网膜色素上皮（retinal pigment epithe- lium, RPE）细胞起着重要的调控作用。在缺氧条件 下，RPE细胞通过诱导各种细胞因子的释放，引起包括血管基底膜的降 解、血管内皮细胞(endothelial cells, EC)的增生、趋化和移行以及 新基底膜的沉积等一系列反应，最终导致新生血管管腔的形成[2]。由于CNV的形成是多种分子共同作用的结果[3]，而分子间的相互作用又 错综复杂。因此，寻找一个能够调控RPE细胞生长的关键信号通路可能 对于防治CNV具要重要意义。近十几年研究发现，磷脂酰肌醇-3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K）是一种与细胞信号转导有 关的酯类第二信使，广泛参与细胞信息传递、分泌、离子通道调节、细胞增生、分化，抑制细胞凋亡等一系列与生命现象密切相关的过程，从 而提示PI3K在细胞增生过程中起到十分重要的调节作用[4]。但是该信号转导机制在RPE细胞增生中的作用尚不十分清楚，我们对此进行了初 步的探讨。 1材料和方法 1.1材料 人RPE细胞取自角膜移植术后供体眼球，分离、培养及 鉴定方法同前[5,6]，第4～7代细胞用于实验。将RPE细胞以1×106个细胞接种于10cm的培养皿中，培养72h后更换为无血清培养基 （serum-free medium, SFM）培养。实验分阻断剂处理组和对照组。处 理组加入阻断剂LY294002 30μmol/L（美国Cell Signal公司），作用1h后，处理组和对照组分别加入CoCl2 200μmol/L以建立RPE细胞化学缺氧模型。继续培养1，4，8，12和24h分别用于以下检测。 1.2方法 1.2.1细胞增生指数的检测 消化、收集RPE细胞，PBS洗涤3次，700mL/L冰乙醇室温固定20min。再行PBS洗涤3次，加入1mL PIsoulution（由1g/L Triton, 2mg DNase-free RnaseA，1g/L PI200μL组成），室温放置15min，混匀，过滤，4?，避光放置30min，用流式细胞仪FACStar检测细胞增生指数，每组3例。计算出S+G2/M期细胞所占细胞总数（G0/G1+S+ G2/M）的百分比，即细胞增生程度。 1.2.2 RT-PCR检测 收集RPE细胞，并将细胞数调至1×106/L，加入1mL Trizol，室温作用5min充分裂解，12 000r/min，10min离心后，2～8?弃沉淀，加入（含200μL氯仿）1mL Trizol振荡混匀，室温静置15min，12 000r/min，15min，4?离心，吸取水相层至另一离 心管，加入（含0.5mL异丙醇）1mL Trizol振荡混匀，室温静置 10min，12 000r/min，10min，4?离心，弃上清，RNA沉于瓶底，Trizol 1mL中加入750mL/L乙醇，振荡摇匀，8 000r/min，5min，4?离心，弃上清，室温晾干5～10min，50μL去离子水（DEPC处理）， 溶解样品，55～60?，5～10min，测A值定量。按照Invitrogen RT-PCR试剂盒步骤进行RT-PCR。PI3K引物：上游：5'-ACT TTGTGACCTTCGGCTTT-3'，下游： 5'-TACATTCCTGATCTTCCTCG-3'；β-actin:上游：5'-GTTTGAGACCTTCAACACC-3'，下游：5'-GT GGCCATCT CCTGCTCGAAGTC-3'，引物扩增片段400bp。 1.2.3 Western-blot检测 收集细胞，PBS洗涤2次，裂解细胞收集蛋白上清液，加入2×加样缓冲液，煮沸5min。每个样品取40μg蛋白，进行120g/L SDS-PAGE电泳后，于180 mA 稳压状态下PVDF膜转印5h，以20g/L脱脂奶粉4?封闭1h后，行Western-blot印迹，一抗为兔抗人PI3Kp110α单抗（1?1 000）4?过夜。含有1g/L Tween的PBS洗涤3次，每次5min。二抗为羊抗兔的辣根过氧化物标记的生物素 化抗体（1?5 000）室温作用1h，同上洗涤后，加入增强化学发光试 剂，暗室中用高敏感X光胶片曝光显影。β-actin作为内参照（1?500）重复上述步骤。 统计学处理：实验重复3次。利用SPSS 11.5统计分析软件，采 用配对t检验比较各组之间细胞增生程度的差别。 2结果 2.1细胞增生指数 CoCl2建立RPE细胞缺氧后8，12和24h，处于S期的RPE细胞随着缺氧时间延长而增多，各时间点RPE细胞的增生指数均较基础状态（0h）明显升高（P＜0.05）。LY294002阻断剂处理组较对照组RPE细胞增生指数明显降低（P＜0.05，表1）。 2.2 PI3K mRNA表达 半定量RT-PCR检测结果表明，CoCl2缺氧前后培养的RPE细胞均有400bp目的条带PI3K mRNA的表达。而随缺氧时 间的延长，目的基因表达强度逐渐增强（图1）。 2.3 PI3K蛋白表达 CoCl2建立RPE细胞缺氧即刻（0h），可见RPE细胞有少量磷酸化PI3K蛋白表达，说明人RPE细胞在基础情况下 即有内源性的磷酸化PI3K蛋白的表达。加入200μmol/L CoCl2缺氧刺 激后，磷酸化PI3K蛋白表达逐渐增强（图2）。 1：对照组；2：缺氧1h；3：缺氧4h；4：缺氧8h；5：缺氧12h；6：缺氧24h。a:PI3K；b：引物二聚体 图1 缺氧不同时间内RPE细胞磷酸化PI3K mRNA表达 1：对照组；2：缺氧1h；3：缺氧8h； 4：缺氧12h；5：缺氧24h 图2 缺氧后RPE细胞磷酸化PI3K蛋白表达 3讨论 临床上许多视网膜脉络膜疾病的发生都与缺血缺氧密切相关。脉 络膜局部长期缺血缺氧是AMD眼内CNV发生的主要原因之一[7,8]。CNV生成的机制尚未完全阐明，但RPE细胞和Bruch膜的损伤是诱发CNV的重要原因，Bruch膜及其周围基质的变化，改变了RPE细胞的基因表达，导致CNV发展[9]。在缺氧状态下，RPE细胞的多种氧反应基因上 调表达，主要包括血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子 (FGF)和转化生长因子(TGF)。实验性CNV中，RPE也可以产生VEGF、血管生成素(angiopoietin, Ang)和血管内皮受体Tie 1和Tie2[10]，通过自分泌和旁分泌作用于RPE使其增生[11,12]，进一步促进CNV的发展。由此可见，在CNV的过程中RPE细胞起着重要的调控作用，生长调 节失衡是其中心环节，调节细胞生长平衡的改变，是一系列酶促反应的 过程，又是调节以上各因子平衡的最后通路。 PI3K是一种重要的细胞内蛋白激酶,当细胞受生长因子等刺激因 子刺激后,细胞内PI3K活化，使其转化为3，4，5—三磷酸磷脂酰肌醇 （PIP3）[13]，并与其下游分子Akt结合，活化的PI3K/Akt可能通过TSC1/2复合物进一步激活其中下游分子Mtor[14]、eIF-4E结合蛋白1（4E-BP1）和核糖体蛋白P70S6K[15]，启动蛋白质的翻译[16,17]，因此磷酸化的PI3K被认为是蛋白质合成的主要信号调节通路，参与细胞 增生、分化、移行等的调节[18]。PI3K可通过Akt、mTOR将有丝分裂信号传递给P70S6K，使细胞周期主要蛋白，如细胞周期素（cyclin）的翻译上调，促进G1期进展，使细胞周期加速[19]。在卵巢癌及前列 腺癌中均发现，抑制PI3K活性可以降低cyclinD1、细胞周期依赖性蛋 白激酶4（CDK4）的表达及Rb的磷酸化，导致细胞G1期阻滞，抑制细胞周期进展[19,20]。进一步证实PI3K信号通路在细胞增生与分化中发 挥重要作用。 我们研究发现，利用CoCl2建立RPE细胞缺氧模型8，12和24h后，RPE细胞进入S和G2/M比例随缺氧时间延长而增加（P＜0.01），说明CoCl2模拟的缺氧环境可以使RPE细胞周期加速，促进增生。RT-PCR和Western-blot结果提示，磷酸化PI3K在正常的RPE细胞中仅有微弱的表达，随着RPE细胞缺氧时间的延长，其表达水平逐渐升高。表 明磷酸化PI3K表达与RPE细胞增生同步。这一结果与Zhou等[21]研究发现一致，即PI3K的磷酸化水平从正常乳腺上皮组织、不典型增生到 肿瘤浸润渐次增加，PI3K的表达与增生呈正相关相，提示PI3K可能参与了RPE细胞增生的调节。 LY294002因其具有较强的稳定性[22]，已经作为PI3K特异性抑制剂广泛应用于细胞生物学。LY294002处理RPE细胞后，FCS分析发现细胞增生受到了明显的抑制。进一步的细胞周期分析发现，抑制PI3K的状态下，S期细胞数量和增生指数在各时间点较对照组明显降低，进 一步表明PI3K可能在缺氧诱导的RPE细胞增生中发挥着重要作用。 致谢：本研究得到德国洪堡基金会（Alexander von Humboldt Foudation）仪器设备捐赠基金（V-8151/02085）资助，特此致谢！ 【参考文献】 1 Catherine S, Charles Y, Richard M, Antonia M. 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