酶活测定方法

酶活测定方法 、酶活测定方法 还原法 酶与底物在特定的条件下反应,酶可以促使底物释放出还原性的基团。在此反应体系中添加化学试剂 ,酶促反应的产物可与该化学试剂发生反应,生成有色物质。通过在特定的波长下 比色 ,即可求 出还原产物的含量 ,从而计算出酶活力的大小 。 色原底物法 通过底物与特定的可溶性生色基团物质结合,合成人工底物。该底物与酶发生反应后 ,生色基团可被释放出来 ,用分光光度法即可测定颜色的深浅,在与已知酶所做的曲线比较后 ,即可求出待测酶的活力。 粘度法 该法常用于测定纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶 的活力。木聚糖和β-葡聚糖溶液通常情况下可形成极高的粘度,当酶作用于粘性底物时木聚糖和β-葡聚糖会被切割成较小的分子使其粘度大 为降低。基 于Poiseuille定律我们知道 ,只要测定一定条件下溶剂和样品溶液的运动粘度,便可计算特性粘数,并以此来判断酶的活力。 高压液相色谱法 酶与其底物在特定的条件下充分反应后 ,在一定的色谱条件下从反应体系中提取溶液进行色谱分析,认真记录保留时间和色谱图,测量各个样的峰高和半峰高,计算出酶促反应生成物的含量 ,从而换算出酶活力的数值。 免疫学方法 常用 于酶活性分析的免疫学方法包括:免疫电泳法 、免疫凝胶扩散法。这两种方法都是根据酶与其抗体之间可发生特定的沉淀反应 ,通过待测酶和标准酶的比较,最终确定酶活力。免疫学方法检侧度非常灵敏,可检侧出经过极度稀释后样品中的酶蛋白,但其缺点是不同厂家生产的酶产品需要有不同特定的抗体发生反应。 琼脂凝胶扩散法 将酶作用的底物与琼脂混合熔融后 ,倒入培养皿中或载波片上制成琼脂平板。用打孔器在琼脂平面上打出一个约4-5mm半径 的小孔。在点加酶样并培养24h以后 ,用染色剂显色或用展开剂展开显出水解区,利用水解直径和酶活力关系测定酶活力。 蛋白酶活力测定法 本方法适用于酿造酱油时在制品菌种、成曲的蛋白酶活力测定。 1 福林法 1.1 试剂及溶液: 以下试剂都为分析纯 1.1.1 福林试剂(Folin试剂):于2000mL磨口回流装置内,加入钨酸钠(Na2WO4?2H2O) 100g,钼酸钠(Na2MoO4?2H2O)25g,蒸馏水700mL,85%磷酸50mL,浓盐酸100mL,文火回流10h。 取去冷凝器,加入硫酸锂(Li2SO4)50g,蒸馏水50mL,混匀,加入几滴液体溴,再煮沸15min, 以驱逐残溴及除去颜色,溶液应呈黄色而非绿色。若溶液仍有绿色,需要再加几滴溴液,再 煮沸除去之。冷却后,定容至1000mL,用细菌漏斗(No4,5)过滤,置于棕色瓶中保存。此溶 液使用时加2倍蒸馏水稀释。即成已稀释的福林试剂。 1.1.2 0.4mol碳酸钠溶液: 称取无水碳酸钠(Na2CO3)42.4g,定容至1000mL。 1.1.3 0.4mol三氯乙酸(T C A)溶液: 称取三氯乙酸(CCL3COOH)65.4g,定容至1000mL。 1.1.4 pH7.2磷酸盐缓冲液:称取磷酸二氢钠(NaH2PO4?2H2O)31.2g,定容至1000mL,即 成0.2mol溶液(A液)。称取磷酸氢二钠(Na2HPO4?12H2O)71.63g,定容至1000mL,即成 0.2mol溶液(B液)。 取A 液28mL 和B 液72mL,再用蒸馏水稀释1倍,即成0.1mol pH7.2的磷酸盐缓冲液。 1.1.5 2%酪蛋白溶液:准确称取干酪素2g,称准至0.002g,加入0.1N氢氧化钠10mL,在 水浴中加热使溶解(必要时用小火加热煮沸),然后用pH7.2磷酸盐缓冲液定容至100mL即 成。配制后应及时使用或放入冰箱内保存,否则极易繁殖细菌,引起变质。 1.1.6 100μg/mL酪氨酸溶液:精确称取在105?烘箱中烘至恒重的酪氨酸0.1000g,逐 步加入6mL 1N盐酸使溶解,用0.2N盐酸定容至100mL,其浓度为1000μg/mL,再吸取此液10 mL,以0.2N盐酸定容至100mL,即配成100μg/mL的酪氨酸溶液。此溶液配成后也应及时使 用或放入冰箱内保存,以免繁殖细菌而变质。 1.2 仪器 a. 分析天平: 感量0.1mg; b. 581-G型光电比色计或72型分光光度计; c. 水浴锅; d. 1、2、5、10mL移液管等。 1.3 操作 1.3.1 标准曲线的绘制 1.3.1.1 按下配制各种不同浓度的酪氨酸溶液(表1)。 表 1 配制各种不同浓度的酪氨酸溶液 ?????????????????????????????? ? 管 号 试 剂 ??????????????????? ? 1 ? 2 ? 3 ? 4 ? 5 ? 6 ?????????????????????????????? 蒸馏水,mL ?10 ? 8 ? 6 ? 4 ? 2 ? 0 100μg/mL酪氨酸,mL ? 0 ? 2 ? 4 ? 6 ? 8 ? 10 酪氨酸最终浓度,μg/ml ? 0 ? 20 ? 40 ? 60 ? 80 ? 100 ?????????????????????????????? 1.3.1.2 测定步骤:取6支试管编号按表1分别吸取不同浓度酪氨酸1mL,各加入0.4mol 碳酸钠5mL,再各加入已稀释的福林试剂1mL。摇匀置于水浴锅中。40?保温发色20min在 581-G型光电比色计上分别测定光密度(OD) (滤色片用65**#)或用72型分光光度计进行 测定(波长660nm)。一般测三次,取平均值。将1,6号管所测得的光密度(OD)减去1号管( 蒸馏水空白试验)所测得的光密度为净OD数。 为了清楚起见。再列出如下 (表2)。 表 2 ?????????????????????????????????? ? 管 号 试 剂 ??????????????????? ? 1 ? 2 ? 3 ? 4 ? 5 ? 6 ?????????????????????????????????? 按表1制备的不同浓度酪氨酸,mL? 1 ? 1 ? 1 ? 1 ? 1 ? 1 ?????????????????????????????????? 0.4mol/L Na2CO3,mL ? 5 ? 5 ? 5 ? 5 ? 5 ? 5 ?????????????????????????????????? 福林试剂,mL ? 1 ? 1 ? 1 ? 1 ? 1 ? 1 ?????????????????????????????????? ? 1 ? ? ? ? ? ? ???????????????????????? ? 2 ? ? ? ? ? ? O D值 ???????????????????????? ? 3 ? ? ? ? ? ? ???????????????????????? ? 平均 ? ? ? ? ? ? ?????????????????????????????????? 净O D值 ? 0 ? ? ? ? ? ?????????????????????????????????? 以净O D值为横坐标,酪氨酸的浓度为纵坐标,绘制成标准曲线(或可求出每度OD所相 当的酪氨酸量K)。 1.3.2 样品稀释液的制备。 1.3.2.1 测定酶制剂: 称取酶粉0.100g,加入pH7.2磷酸盐缓冲液定容至100mL,吸取此 液5mL,再用缓冲液稀释至25mL,即成5000倍的酶粉稀释液。 1.3.2.2 测定成曲酶: 称取充分研细的成曲5g,加水至100mL,在40?水浴内间断搅拌 1h,过滤,滤液用0.1mol pH 7.2磷酸盐缓冲液稀释到一定倍数(估计酶活力而定)。 1.3.3 样品测定: 取15×100mm试管3支,编号1、2、3(做2只也可),每管内加入样品 稀释液1mL,置于40?水浴中预热2min,再各加入经同样预热的酪蛋白1mL,精确保温10min, 时间到后,立即再各加入0.4mol三氯乙酸2mL,以终止反应,继续置于水浴中保温20min,使 残余蛋白质沉淀后离心或过滤,然后另取15×150mm试管3支,编号1、2、3,每管内加入滤 液1mL,再加0.4mol碳酸钠5mL,已稀释的福林试剂1mL,摇匀,40?保温发色20min后进行光 密度(OD)测定。 空白试验也取试管3支,编号(1)、(2)、(3),测定方法同上,唯在加酪蛋白之前先加 0.4mol三氯乙酸2mL,使酶失活,再加入酪蛋白。 为了清楚起见,分别列出表格于下 (见表3及表4)。 表 3 ???????????????????????????????????? ? 管 号 ? 试 剂 ? 管 号 试 剂 ??????? ????????? ?1 ?2 ?3 ? ?(1) ?(2) ?(3) ???????????????????????????????????? 预热酶液, mL ?1 ?1 ?1 ?预热酶液, mL ? 1 ? 1 ? 1 ???????????????????????????????????? 预热2%酪蛋白, mL ?1 ?1 ?1 ?0.4mol三氯乙酸, mL ? 2 ? 2 ? 2 ???????????????????????????????????? 作用10min (精确计时) ?作用10min (精确计时)? ? ???????????????????????????????????? 0.4mol三氯乙酸, mL ?2 ?2 ?2 ?预热2%酪蛋白, mL ? 1 ? 1 ? 1 ???????????????????????????????????? 表 4 ??????????????????????????? ? 管 号 试 剂 ????????????????? ?1 ? 2? 3 ?(1) ?(2) ? (3) ??????????????????????????? 滤 液, mL ?1 ? 1? 1 ? 1 ? 1 ? 1 ??????????????????????????? 0.4mol Na2CO3,mL ?5 ? 5? 5 ? 5 ? 5 ? 5 ??????????????????????????? 福林试剂, mL ?1 ? 1? 1 ? 1 ? 1 ? 1 ??????????????????????????? O D值 ? ? ? ? ? ? ??????????????????????????? 平均O D值 ? ? ??????????????????????????? 净O D值 ? ? 0 ??????????????????????????? 样品的平均光密度(O D)一空白的平均光密度(OD)=净OD值。 1.4 计算 在40?下每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸,定义为1个蛋白酶活力单位。 A 1 样品蛋白酶活力单位(干基)=??×4×N×??? ……………………… (1) 10 1 - W 式中:A——由样品测得OD值,查标准曲线得相当的酪氨酸微克数(或OD值×K); 4——4毫升反应液取出1 mL测定 (即4倍); N——酶液稀释的倍数; 10——反应10min; W——样品水分百分含量。 1.5 注意事项 以上介绍的方法用于测定中性蛋白酶(pH7.2)。若要测定酸性蛋白酶或碱性蛋白酶, 则把配制酪蛋白溶液和稀释酶液用的pH缓冲液换成相应pH缓冲液即可。现把几种常用pH 缓冲液配方提供如下: 1.5.1 pH7.5磷酸盐缓冲液 (0.02mol/L) 称取磷酸氢二钠(Na2HPO4?12H2O)6.02g和磷酸二氢钠 (NaH2PO4?2H2O)0.5g以蒸 馏水溶解定容至1000mL。 1.5.2 pH 2.5乳酸-乳酸钠缓冲液 (0.05mol) A 液: 称取80%,90%乳酸10.6g,加蒸馏水稀释定容至1000mL。 B 液: 称取70%乳酸钠16g,加水稀释定容至1000mL。 取A 液16mL与B 液1mL混合稀释一倍即成。 1.5.3 pH 3.0乳酸-乳酸钠缓冲液 (0.05mol) A 液: 称取80%,90%乳酸10.6g,以水定容至1000mL。 B 液: 称取70%乳酸钠16g,蒸馏水溶解定容至1000mL。 取A 液8mL与B 液1mL,混合稀释一倍即成。 1.5.4 pH 10硼砂-氢氧化钠缓冲液 A 液: 称取硼砂19.08g,用蒸馏水溶解定容至1000mL (0.05mol)。 B 液: 称取氢氧化钠8g,用蒸馏水溶解定容至1000mL (0.2N)。 取A 液250mL,B 液215mL混合,用蒸馏水稀释定容至1000mL即成。 1.5.5 pH 11.0硼砂-氢氧化钠缓冲液 A 液: 称取硼砂19.08g,用蒸馏水定容至1000mL 。 B 液: 称取氢氧化钠4g,用蒸馏水定容至1000mL 。 取A 液与B 液等量混合。 1.5.6 2%酪蛋白溶液配成酸性时,须先加数滴浓乳酸,使之湿润以加速其溶解。 2 甲醛法 成曲蛋白酶活力的测定,如用福林法测定确有困难时,可用甲醛法测定作过渡。 2.1 仪器 a. 分析天平:感量0.01g; b. 水浴锅; c. 电烘箱; d. 容量瓶、吸管、滴定管等。 2.2 试剂与溶液 a. 1%酚酞指示剂; b. 0.1%麝香草酚蓝; c. 0.1N氢氧化钠液、甲醛(试剂配制法同氨基态氮的测定,见ZB X 66038—87《氨 基态氮测定法》)。 2.3 操作 2.3.1 目测法 称取研细均匀的成曲样品10g,放入250mL锥形瓶中,加55?温水80mL,充分摇匀,置于 55?水浴锅中保温3h,取出后加热煮沸以破坏酶活力,冷却后定容至100mL,充分摇匀后以 脱脂棉过滤,吸取滤液10mL,移至150mL锥形瓶中,加水50mL, 1%酚酞指示剂0.2mL,以0.1N 氢氧化钠标准溶液滴定至刚显微红色(pH 8.2),记下滴定数作为总酸,继续加甲醛10mL,用 0.1N氢氧化钠液滴定至深红色(pH 8.5)为终点,若再加麝香草酚蓝1mL作指示剂,则滴至紫 红色为终点。记下滴定数,减去空白数后计算成氨基态氮。另称取曲10g做水分,再折算成 干基数。 2.3.2 酸度计法 所用仪器、药品、操作方法等与氨基态氮测定法同 (见 ZB X 66038-87)。 2.4 计算 蛋白酶活力 (克氨基态氮/100g)(干基) (V-***Vo)×N×0.014 100 =??????????×??? ……………………………… (2) 10 1 -W 10×??? 100 式中:V——加入甲醛后氢氧化钠标准液滴定数, mL; ***Vo——甲醛空白滴定数, mL; W——曲水分,%; N——氢氧化钠标准溶液的当量数,N; 0.014——氮的毫克当量数。 ????????? 附加说明: 本标准由商业部副食品局提出。 本标准由上海市酿造科学研究所起草。 本标准主要起草人须凤高。 ????????? *本法实质上是在一定温度下、一定时间内,成曲利用自身的蛋白酶把自身原料中的蛋 白质水解成氨基酸。以测定氨基态氮的量来衡量蛋白酶活力的数值。在培养和堆放过程, 环境温度和自身含有水分,故已有少量氨基酸生成。为了能和福林法的酶活力进行对照, 可用空白试验以扣除此误差,方法是另取一曲样于开始时即将成曲酶活杀灭,其余操作步 骤完全相同。杀酶的方法是把已煮沸的蒸馏水70mL倾入10g成曲中,并马上继续把成曲液 煮沸几分钟,其余操作与样品同,成曲和甲醛的空白一起算成Vo。 搜索更多相关主的帖子: 测定法 蛋白酶 活力 蛋白酶活力的测定 随着生物技术的发展及环保的提高，越来越多的酶制剂应用于制革生产中。比如浸水，脱毛，软化，脱脂等工序都用到大量的酶制剂，从酶的作用性质来看制革生产中用到的主要是蛋白酶和脂肪酶。酶的本质是蛋白质，所以酶在出厂后的长途运输及存放过程中，由于条件的变化、振荡、阳光等的作用，其活力要有所改变，故在使用之前必须测定其活力。作为计算酶制剂用量的依据，以达到预期的脱毛效果。即现测现用。 酶的活力是指酶催化底物进行反应的本领。即酶催化底物反应在一定时间内生成物越多或消耗的底物越大，则催化速度越快，活力越高。 酶活力的大小用酶活力单位(U，active unit)来表示。1961年国际酶学会议规定:1个酶活力单位是指在特定条件(25?，其它为最适条件)下，在1分钟内能转化1微摩尔底物的酶量，或是转化底物中1微摩尔的有关基团的酶量。1979年国际生物化学协会为了使酶活性单位与国际单位制(SI)的反应速率相一致，推荐用Katal单位(也称催量，Kat)。规定为:在最适条件下，1秒钟能使1摩尔底物转化的酶量。Kat和U的换算关系:1 Kat=6×107U， 1U=16.67nmol.s-1=16.67nKat。 把酶制剂的量和活力联系在一起，即为酶的比活力，它表示单位质量的蛋白质中所含的某种酶的活力单位的多少。是用来度量酶纯度的指标。在实际生产中所说的酶活力一般是指酶的比活力大小。 另外在实际的生产应用中，由于酶的性质不同，测定方法不同，很多酶的活力都有各自的惯用单位。 1、Folin法(第一法)测定蛋白酶活力 目前所用到的蛋白酶的种类比较多。根据每种酶作用的条件不同，主要是最适PH值不同而分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶。其中酸性蛋白酶可用于毛皮的软化。在制革上则主要选用中性和碱性蛋白酶来脱毛。 定义:lg 固体酶粉(或1mL液体酶)，在一定温度和pH值条件下，l min水解酪素产生lμg酪氨酸为一个酶活力单位，以U/g(U/mL) 表示。 具体测定方法见《QB/T 1803-1993 工业酶制剂通用试验方法》及《SB/T10317-1999 蛋白酶活力测定法》。 表1 几种酶促反应最佳条件 2、胰酶活力测定 胰酶系从各种动物胰脏制取的混合物，主要是蛋白酶，脂酶和淀粉酶。白色或淡黄色无定形粉末，有微弱的肉类物臭味。溶于水呈微浑溶液，不溶于醇和醚。遇酸、碱及热即丧失活力，pH,7.8~8.7活性强。水溶液遇酸、热、重金属或单宁酸时产生沉淀，经煮沸则迅速分解而变性。 胰酶用于原料皮脱灰后进行软化。胰酶中所含的弹性蛋白酶，可以分解弹性蛋白质，防止成革粒面出现碎玻璃花纹，提高产品质量。胰酶软化时，对皮内一些蛋白质进行不同程度的消解，可除去皮内残存的脏物、毛根分解产物、纤维间质等，有利于皮纤维进一步分散，促进躁剂与皮胶原的结合，以使成革具有柔软性、丰满性和良好的透气性。 酶软化是制造软革很重要的操作，但胰酶浓度过高，皮内胶原纤维损失大，致使成革松面。为了达到正常的软化目的，必须在软化之前，测定其活力，以便确定其含量。 [醋酸盐指示剂法] (1)测定原理 胰酶能催化酪蛋白水解，而且胰酶量越多，被水解的酪蛋白就越多。一定量的胰酶，催化的酪蛋白越多或生成的分解产物越多，其胰酶的活力越大。与福林法蛋白酶活力不同的表示是，胰酶活力是用在一定条件下底物的消耗量来表示。即在一定的pH值和时间内1g胰酶能使酪蛋白完全水解的质量(g)，即胰酶能使酪蛋白转化的能力，又称酪蛋白转化力，以倍数来计量。控制胰酶的最适条件pH,8~9、T,(40?1)?，用定量的酪蛋白和不同量的胰酶作用，水解一定的时间后，用醋酸盐(或醋酸)指示剂调节反应液pH值达到酪蛋白的等电点(pH,4.6)附近，末被水解的酪蛋白呈白色沉淀析出，而水解产物则不沉淀。据此，则可找到恰好使定量的酪蛋白完全水解的最小胰酶用量。根据胰酶的体积和浓度，即可计算出胰酶对酪蛋白 的转化倍数，即胰酶的活力。 (2)试剂 1.24:50硼酸水溶液;0.1mo1/L。NaOH水溶液;硼酸盐溶液，即1.24:50的H3BO4 20mL+2mL 0.1mo1/L NaOH;13.6,醋酸钠水溶液;60,醋酸溶液;醋酸盐缓冲液，即l 3.6, NaAc与60, HAc等体积混合。 (3)操作 ? 配制底物酪蛋白 称取(精确至0.0001g)0.2g细酪蛋白于小烧杯中，加20mL蒸馏水，移取5mL 0.1mo1/L NaOH，40?水浴上加热约30min，搅拌使之溶解，移人100mL容量瓶，加5mL H3BO4溶液，并定容到刻度(pH,8.5)。 ? 胰酶溶液的配制 在研钵中称取(精确至0.0001g)胰酶0.1g(先加3~5滴研磨，再补加15~17滴)，加1mL硼酸盐溶液，浸泡3~5min，研磨到无大块胰酶，转移定容到500mL容量瓶，用H2O定容。 ? 粗测 取5支带刻度的干燥试管，按表1-2所示进行。依次滴加醋酸盐缓冲液0.5mL(10滴)，边滴边观察刚加人时是否产生白色沉淀，若缓冲溶液到了试管底部还不出现沉淀，说明酪蛋白已水解完全，有沉淀产生，证明酪蛋白没有全部水解，找出刚不产生沉淀的胰酶体积(mL)。即是5mL酪蛋白完全水解的最少胰酶量。 表2 胰酶活力粗测步骤 ? 精确测定 在粗测刚不沉淀至刚沉淀之间移取酶液量，梯度为0.1mL。例如表1-2中2.0mL刚沉淀，则取2.5~2.0mL。按表1-3所示进行。操作同上，找出刚好不产生沉淀胰酶的量，记为V。 表3胰酶活力精确测定步骤 (4)计算 胰酶活力X按照下式计算。 式中 ml —— 酪蛋白的质量，g; m2 —— 胰酶的质量，g; V —— 终点时管中胰酶溶液的体积，mL。 (5)注意事项: ? 酪蛋白、胰酶、水按比例加入以后一定要使其混合均匀，否则将造成试管底部的酪蛋白没有水解，使测定结果不准确。 ? 水浴加热，使整个液面都进入到水中。 ? 试管的粗细程度。试管不可太粗或太细，既好摇匀又好观察，且粗细一致。 ? 配制好的胰酶和酪蛋白溶液在室温20?以下存放24h有效，室温高于20?时胰酶4h有效，酪蛋白8h有效。 ? 产生白色沉淀必须是现加现看，不能放置过久，否则酪氨酸也沉淀出来了。 3.l 还原糖法(Reducing sugar release) 这种方法是采用化学合成或从自然界提取的酶的底物来进行的。酶与底物在特定的条件(温度、PH值和底物浓度)下反应。反应产物是还原糖，通过比色确定还原糖的数量，同时制作标准曲线。酶的活性表示为每分钟产生lmmol的产物所需要的酶量(mg或ml)。 3.2 比色法(Colorimetric assays ?) 这种方法是对底物进行化学修饰，使其带有特定的可溶性生色基团物质，该生色基团能够产生特定颜色。在酶与底物发生反应后，生色基团就被释放出来，用分光光度计可以测定颜色的深度，并制作标准曲线。与已知标准酶的活性进行比较，计算出该酶的活性。这种方法并不能区分内切酶和外切酶，但是通常认为这种方法更适合于测定外切酶。目前采用这种方法测定所需的底物被工业上广泛采用。 3.3 比色法(Colorimetric assnys?) 这种方法是通过生色基团结合酶作用底物分子的中间产物(sub-unit)来确定酶的活性。如 PNPG(para nitro phenyl)，该种物质与半乳糖结合形成一种乳糖(或葡萄糖)类似物。在酶的作用下，释放出PNP，利用其它方法测定PNP的含量。上述的方法通常只在生物化学实验室采用，饲料酶作用的底物是高分子量的物质，不宜采用。 3.4 黏度法(Viscometric assays) 这种方法是根据酶能够降低一定浓度的标准底物(控制pH值、温度等条件)的黏度的能力来确定酶的活性。利用的底物主要有化学合成的底物(如 CMC用于纤维素酶的测定)和自然提取的底物(如小麦阿拉伯木聚糖用于木聚糖酶的测定)。测定的酶的活性值是通过与同时测定的标准酶活性的比较，来确定酶的活性。 这种方法的特点是通过降低底物的新度来反映酶的活性，这也正是酶在体内起作用的重要特征。化学合成的底物的效果要优于自然提取的底物，因为化学合成的底物不利于酶的接触。 3.5 免疫学法(Immunological methods) 用于酶活性分析的免疫学法包括ELISA法和免疫凝胶扩散法。这两种方法是根据酶与抗体之间发生反应，然后ELISA法通过第二步反应，凝胶扩散法则通过印染过程来确定酶的活性(与标准添加酶的水平对比)。 这些方法是非常灵敏的，能够检测到极低水平的酶蛋白。但它们的缺点是对于每个产品的酶需要特殊的抗体，另外作为抗体能够与非酶蛋白质发生反应。由于抗体本身所用的蛋白质是特定的，因此，由不同生产者生产的同种类型的酶之间是没有交叉性的。另外，采用实验动物的敏感性也值得探讨。 3.6 凝胶扩散法(Gel Diffusion methods) 这种方法是将酶作用的底物与某种凝胶混合后倒入培养皿中，凝固之后，在凝胶上切开一条凿，倒入标准酶液和测试酶液。培养一定时间后，在切开的凝胶周围能够看到水解区域，区域的大小与酶的含量成比例。在某些情况下，还可以再加入其它试剂来显示水解的区域。 这种方法虽然简单，但培养时间长，一般需要一个晚上。因为这种方法是根据区域的大小来确定酶的活性，所以其准确性要低于其它非扩散的方法。但它们的优点在于简单、易操作，不需要复杂的装置，这对于饲料厂来说是适用的。 4 饲料中酶分析存在的问题 综上所述，上述方法都可以用来检测饲料中酶的活性。但在对饲料酶活性的分析方法中，需要对以下几个方面进行深入的研究: 4.l 饲料酶是由各种微生物产生的，具有各自不同的特性(如底物的亲和性，最佳温度和pH值)。为了检测某种酶的活性，需要找到一种酶的分析方法，该方法能够测定不同来源的该种酶的活性，但需要对测定条件进行修改。 4.2 饲料中酶活性的检测方法没有被普遍接受的一个重要原因就是从饲料中提取酶的方法没有统一，即不能确定从饲料中提取的酶全部是活性酶蛋白质还是部分与饲料结合。研究表明，纤维素酶能够与饲料结合,而其它酶与饲料结合的可能性要低一些。 4.3 饲料酶和其它工业用酶制剂一样,并不是单一的酶。在分析饲料中某种酶的活性时，如何消除其它酶对测定结果的影响，尤其是测定方法比较接近的两种酶，(如同采用还原糖方法测定纤维酶和木聚糖酶)仍然需要进一步探讨。 4.4 酶活性的体外分析法并不能用来评价酶在体内的作用。酶活的分析方法主要是用于产品的质量的控制，说明目前的使用的产品质量情况。应该在酶的体外评定法和体内法之间建立某种联系，以便能够通过体外的方法来预测酶在体内发挥的作用。但到目前为止，酶产品中，还没有一个酶的生产和销售厂家能够提出一种预测酶在体内的功能的方法。 总黄酮 生物总黄酮是指黄酮类化合物，是一大类天然产物，广泛存在于植物界，是许多中草药的有效成分。在自然界中最常见的是黄酮和黄酮醇，其它包括双氢黄(醇)、异黄酮、双黄酮、黄烷醇、查尔酮、橙酮、花色苷及新黄酮类等。 简介 近年来，由于自由基生命科学的进展，使具有很强的抗氧化和消除自由基作用的类黄酮受到空前的重视。类黄酮参与了磷酸与花生四烯酸的代谢、蛋白质的磷酸化、钙离子的转移、自由基的清除、抗氧化活力的增强、氧化还原作用、螯合作用和基因的表达。它们对健康的好处有:( 1 ) 抗炎症 ( 2 ) 抗过敏 ( 3 ) 抑制细菌 ( 4 ) 抑制寄生虫 ( 5 ) 抑制病毒 ( 6 ) 防治肝病 ( 7 ) 防治血管疾病 ( 8 ) 防治血管栓塞 ( 9 ) 防治心与脑血管疾病 ( 10 ) 抗肿瘤 ( 11 ) 抗化学毒物 等。天然来源的生物黄酮分子量小，能被人体迅速吸收，能通过血脑屏障，能时入脂肪组织，进而体现出如下功能:消除疲劳、保护血管、防动脉硬化、扩张毛细血管、疏通微循环、活化大脑及其他脏器细胞的功能、抗脂肪氧化、抗衰老。 近年来国内外对茶多酚、银杏类黄酮等的药理和营养性的广泛深入的研究和临床试验，证实类黄酮既是药理因子，又是重要的营养因子为一种新发现的营养素，对人体具有重要的生理保健功效。目前，很多著名的抗氧化剂和自由基清除剂都是类黄酮。例如，茶叶提取物和银杏提取物。葛根总黄酮在国内外研究和应用也已有多年，其防治动脉硬化、治偏瘫、防止大脑萎缩、降血脂、降血压、防治糖尿病、突发性耳聋乃至醒酒等不乏数例较多的临床报告。从法国松树皮和葡萄籽中提取的总黄酮 " 碧萝藏 "-- (英文称 PYCNOGENOL )在欧洲以不同的商品名实际行销应用 25 年之久，并被美国 FDA 认可为食用黄酮类营养保健品，所报告的保健作用相当广泛，内用称之为 " 类维生素 " 或抗自由基营养素，外用称之为 " 皮肤维生素 " 。进一步的研究发现碧萝藏的抗氧化作用比 VE 强 50 倍，比 VC 强 20 倍，而且能通过血脑屏障到达脑部，防治中枢神经系统的疾病，尤其对皮肤的保健、年轻化及血管的健康抗炎作用特别显著。在欧洲碧萝藏已作为保健药物，在美国作为膳食补充品(相当于我国的保健食品)，风行一时。随着对生物总黄酮与人类营养关系研究的深入，不远的将来可能证明黄酮类化合物是人类必需的微营养素或者是必需的食物因子。性状:片剂。 功能主治与用法用量 功能主治:本品具有增加脑血流量及冠脉血流量的作用，可用于缓解高血压症状(颈项强痛)、治疗心绞痛及突发性耳聋，有一定疗效。 用法及用量:口服:每片含总黄酮,,,,，每次,片，,日,次。 不良反应与注意 不良反应和注意:目前,暂没有发现任何不良反应. 洛伐他丁 【中文名称】: 洛伐他丁 【英文名称】: Lovastatin 【化学名称】:(S)-2-甲基丁酸-(1S,3S,7S,8S,8aR)-1,2,3,7,8,8a-六氢-3,7-二甲基 -8-[2-(2R,4R)-4-羟基-6氧代-2-四氢吡喃基]-乙基]-1-萘酯 【化学结构式】: 洛伐他丁结构式 【作用与用途】洛伐他丁胃肠吸收后，很快水解成开环羟酸，为催化胆固醇合成的早期限速酶(HMG,coA还原酶)的竞争性抑制剂。可降低血浆总胆固醇、低密度脂蛋白和极低密度脂蛋白的胆固醇含量。亦可中度增加高密度脂蛋白胆固醇和降低血浆甘油三酯。可有效降低无并发症及良好控制的糖尿病人的高胆固醇血症，包括了胰岛素依赖性及非胰岛素依赖性糖尿病。 【 用法用量】口服:一般始服剂量为每日 20mg，晚餐时1次顿服，轻度至中度高胆固醇血症的病人，可以从10mg开始服用。最大量可至每日80mg。 【注意事项】?病人既往有肝脏病史者应慎用本药，活动性肝脏病者禁用。?副反应多为短暂性的:胃肠胀气、腹泻、便秘、恶心、消化不良、头痛、肌肉疼痛、皮疹、失眠等。?洛伐他丁与香豆素抗凝剂同时使用时，部分病人凝血酶原时间延长。使用抗凝剂的病人，洛伐他丁治疗前后均应检查凝血酶原时间，并按使用香豆素抗凝剂时推荐的间期监测。 他汀类药物 他汀类药物(statins)是羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂，此类药物通过竞争性抑制内源性胆固醇合成限速酶(HMG-CoA)还原酶，阻断细胞内羟甲戊酸代谢途径，使细胞内胆固醇合成减少，从而反馈性刺激细胞膜表面(主要为肝细胞)低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)受体数量和活性增加、使血清胆固醇清除增加、水平降低。他汀类药物还可抑制肝脏合成载脂蛋白B-100，从而减少富含甘油三酯AV、脂蛋白的合成和分泌。 他汀类药物分为天然化合物(如洛伐他丁、辛伐他汀、普伐他汀、美伐他汀)和完全人工合成化合物(如氟伐他汀、阿托伐他汀、西立伐他汀、罗伐他汀、pitavastatin)是最为经典和有效的降脂药物，广泛应用于高脂血症的治疗。 他汀类药物除具有调节血脂作用外，在急性冠状动脉综合征患者中早期应用能够抑制血管内皮的炎症反应，稳定粥样斑块，改善血管内皮功能。延缓动脉粥样硬化(AS)程度、抗炎、保护神经和抗血栓等作用。 结构比较 辛伐他汀(Simvastatin)是洛伐他汀(Lovastatin)的甲基化衍化物。 美伐他汀(Mevastatin，又称康百汀，Compactin)药效弱而不良反应多，未用于临床。目前主要用于制备它的羟基化衍化物普伐他汀(Pravastatin)。 体内过程 洛伐他汀和辛伐他汀口服后要在肝脏内将结构中的其内酯环打开才能转化成活性物质。 相对于洛伐他汀和辛伐他汀，普伐他汀本身为开环羟酸结构，在人体内无需转化即可直接发挥药理作用，且该结构具有亲水性，不易弥散至其他组织细胞，极少影响其他外周细胞内的胆固醇合成。 除氟伐他汀外，本类药物吸收不完全。 除普伐他汀外，大多与血浆蛋白结合率较高。 用药注意 大多数患者可能需要终身服用他汀类药物，关于长期使用该类药物的安全性及有效性的临床研究已经超过10年。他汀类药物的副作用并不多，主要是肝酶增高，其中部分为一过性，并不引起持续肝损伤和肌瘤。定期检查肝功能是必要的，尤其是在使用的前3个月，如果病人的肝脏酶血检查值高出正常上线的3倍以上，应该综合分析病人的情况，排除其他可能引起肝功能变化的可能，如果确实是他汀引起的，有必要考虑是否停药;如果出现肌痛，除了体格检查外，应该做血浆肌酸肌酸酶的检测，但是横纹肌溶解的副作用罕见。另外，它还可能引起消化道的不适，绝大多数病人可以忍受而能够继续用药。 红曲米 天然降压降脂食品——红曲米 红曲 红曲米又称红曲、红米，主要以籼稻、粳稻、糯米等稻米为原料，用红曲霉菌发酵而成，为 棕红色或紫红色米粒。 红曲米是中国独特的传统食品，其味甘性温，入肝、脾、大肠经。早在明代，药学家李时珍所著《本草纲目》中就记载了红曲的功效:营养丰富、无毒无害，具有健脾消食、活血化淤的功效。上世纪七十年代，日本远藤章教授从红曲霉菌的次生级代谢产物中 发 现 了 能 够 降 低 人 体 血 清 胆 固 醇 的 物 质 莫 纳 可 林 K( Monacolin-k ) 或 称 洛 伐 他 汀 ， (Lovastatin) ，引起医学界对红曲米的关注。1985 年，美国科学家 Goldstein 和 Brown 进一 步找出了 Monacolin-k 抑制胆固醇合成的作用机理，并因此获得诺贝尔奖，红曲也由此名声大噪。 红曲米的医疗保健功效如下: 1.降压降脂:研究表明，红曲米中所含的 Monacolin-K 能有效地抑制肝脏羟甲基戊二酰辅酶 还原酶的作用，降低人体胆固醇合成，减少细胞内胆固醇贮存;加强低密度脂蛋白胆固醇的 摄取与代谢，降低血中低密度脂蛋白胆固醇的浓度，从而有效地预防动脉粥样硬化;抑制肝 脏内脂肪酸及甘油三酯的合成，促进脂质的排泄，从而降低血中甘油三酯的水平;升高对人 体有益的高密度脂蛋白胆固醇的水平， 从而达到预防动脉粥样硬化， 甚至能逆转动脉粥样硬 化的作用。 2.降血糖:远藤章教授等人曾直接以红曲菌的培养物做饲料进行动物试验，除确定含有红曲 物的饲料可以有效地使兔子的血清胆固醇降低 18%~25%以上外，又发现所有试验兔子在食 入饲料之后的 0.5 小时内血糖降低 23%~33%，而在 1 小时之后的血糖量比对照组下降了 19%~29%。说明红曲降糖功能显著。 3.防癌功效:红曲橙色素具有活泼的羟基，很容易与氨基起作用，因此不但可以治疗胺血症 且是优良的防癌物质。 4.保护肝脏的作用:红曲中的天然抗氧化剂黄酮酚等具有保护肝脏的作用。 压乐胶囊 压乐胶囊成分 压乐胶囊”唯一成分“红曲酵素”大纪事 1970:红曲米提取6种他汀，制成降脂药世界第一红曲，是寄生在红曲米上，发酵提取 压乐胶囊 的活性生物菌。70年代日本科学家远藤根据《本草纲目》上记载红曲的“活血”功效的启示，从红曲营养液中分离出优良的6种含胆固醇抑制剂和甘油三酯分解剂的红曲菌，被命名为“莫纳可林”即“他汀类”，此后30多年来，红曲米提取的“他汀”被世界医学界公认为最好的降脂药，在临床上大量使用。 2002: 降压史上历史性突破----6种他丁+2种红曲降压素=“红曲酵素” 2002年，震惊世界的生物领域重大发明，红曲中的降糖、降压、抗癌成分(GABA-GLUCOSAMINE)通过发酵提取，在原来6种他丁的基础上合成“红曲酵素(Monacolin-R)，经大量的临床试验，这种复合酵素不仅保留了生物他丁的降脂功效，而且它的降血压效果堪比任何药物，《药日新闻》撰文品论，红曲酵素的出现，将开辟降压药新时代。 2008: 6年临床证实“红曲酵素”降血压、治心脑、防猝死、能停药 随后的6年，5万名高血压患者临床运用证实:“红曲酵素”对调理器官微血循环、帮助血液进行重新分配，迅速降压，修复受损心脑肝肾作用显著。而且“红曲酵素”降压同时、养心、护脑、清肝、活肾的功效，达到了降压药的顶峰～“红曲酵素”也被世界医学界誉为“可以媲美青霉素的旷世发现～” “红曲酵素”摘取美国医学界最高荣誉“拉斯克奖” “红曲酵素”的发现者日本Biopharm研究所所长远藤章(74岁)，因此项发明被授予美国医学界最高荣誉“拉斯克奖”，纽约市长布隆博格将颁奖理由归结于“数千万人因此得以延长生命～” 通 知 各地消费者: 为了打击假冒伪劣产品，保护消费者利益，公司从2011年4月起， 正式委托国家GMP认证企业 吉林市隆泰参茸制品有限责任公司 生产我公司产品《压乐牌鑫康延平胶囊》(以下简称压乐)。 按照国家规定，《压乐》产品盒子和说明书做以下相应调整: 1.委托生产企业由原来的“山西天特鑫保健食品有限公司”， 改为“吉林市隆泰参茸制品有限责任公司”。 2.生产地址由原来的“山西省大同县马连庄”，改为“吉林 省桦甸市经济开发区”。 3. 产品企业标准由“Q140200TTX009-2010”改为“Q/HDLTS. 09-2011”. 4.卫生许可证由“晋卫食证字(2007)140000-110039号”， 改为吉卫食证字(2008)第220282-SC4348号。 5.增加了食品流通许可证号SP1101051010090481(1-1)。 6.盒子上增加了“数码钞票花纹防伪”技术，包装上的花纹 清晰，仔细观看，花纹中间有“压乐”字样。 北京鑫康胜生物技术开发有限公司 2011年4月6日 本店郑重声明:不卖假货! 每天解释防伪码的问题真的很累～请顾客买之前先看完。厂家因为不让在网上出售，所以我们的防伪码都要刮掉，那个防伪码对于顾客来讲是查询真伪用的，但是对于代理来讲是厂家用来查串货用的，所以我们网上出售一定要撕掉，希望您理解～如果您不能接受的话，请不要拍，免得没有必要的麻烦～以后凡是因为防伪码被撕申请退货的顾客，本店一律不支持～请您考虑好了再拍～~ 我们盒子上的防伪挖掉了一部分，是查不了的，因为厂家严查网上低价串货，厂家可以从防伪数字查出货源，不能接受的请不要拍～绝对正品，收到可以试用几天满意在确认，不满意可以全额退款! 谁能详细给我介绍一下药品串货。谢谢～ 浏览次数:697次悬赏分:0 | 解决时间:2010-9-12 16:15 | 提问者:yanyecc 最佳答案 药品串货是一种违规操作。一般来说药品的经营，在地方都是有代理商，代理商是负责独家供货，而药品的生产厂家也会给予市场保护，每个地区不能出现同样品种的经营代理商。串货是指通过厂家发货到其他的地方，再把药品流通到有生产厂家代理商的地方市场去销售，形成了市场冲撞～ 分享给你的朋友吧: 新浪微博 回答时间:2010-9-2 22:29 药品串货对药厂有什么害处 浏览次数:607次悬赏分:0 | 解决时间:2010-10-22 11:52 | 提问者:匿名 最佳答案 首先明确什么是串货。 串货的种类有以下3种: 1.良性串货:厂商在市场开发的初期，有意或者无意地选中了市场中流通性强的经销商，使其产品迅速流向市场空白区域和非重要区域。 2.恶性串货 :经销商为了获得非正常利润，蓄意向自己辖区外的市场倾销商品。 恶意串货形成的5个大的原因: 1.市场饱和; 2.厂商给予的优惠政策不同; 3.通路发展的不平衡; 4.品牌拉力过大而通路建设没跟上; 5.运输成本不同导致经销商投机取巧。 对厂家来说:——害处 可追溯性差，出了事搞不清状况。 价格体系混乱长远看影响品牌发展。 消费者得不到应有保证，经销商受到打击，不利于渠道建设。 当然也有好处。所以窜货屡禁不止 这里学问不小，可以慢慢交流。 新浪微博 回答时间:2010-10-22 10:20 | 我来评论 压乐胶囊”唯一成分“红曲酵素”大纪事 1970:红曲米提取6种他汀，制成降脂药世界第一 红曲，是寄生在红曲米上，发酵提取的活性生物菌。70年代日本科学家远藤根据《本草纲目》上记载红曲的“活血”功效的启示，从红曲营养液中分离出优良的6种含胆固醇抑制剂和甘油三酯分解剂的红曲菌，被命名为“莫纳可林”即“他汀类”，此后30多年来，红曲米提取的“他汀”被世界医学界公认为最好的降脂药，在临床上大量使用。 2002:降压史上历史性突破----6种他丁+2种红曲降压素=“红曲酵素” 2002年，震惊世界的生物领域重大发明，红曲中的降糖、降压、抗癌成分(GABA-GLUCOSAMINE)通过发酵提取，在原来6种他丁的基础上合成“红曲酵素(Monacolin-R)，经大量的临床试验，这种复合酵素不仅保留了生物他丁的降脂功效，而且它的降血压效果堪比任何药物，《药日新闻》撰文品论，红曲酵素的出现，将开辟降压药新时代。 2008:6年临床证实“红曲酵素”降血压、治心脑、防猝死、能停药 随后的6年，5万名高血压患者临床运用证实:“红曲酵素”对调理器官微血循环、帮助血液进行重新分配，迅速降压，修复受损心脑肝肾作用显著。而且“红曲酵素”降压同时、养心、护脑、清肝、活肾的功效，达到了降压药的顶峰～“红曲酵素”也被世界医学界誉为“可以媲美青霉素的旷世发现～” •“红曲酵素”摘取美国医学界最高荣誉“拉斯克奖” 74岁)，因此项发明被授予美国医学界最高荣誉“拉“红曲酵素”的发现者日本Biopharm研究所所长远藤章( 斯克奖”，纽约市长布隆博格将颁奖理由归结于“数千万人因此得以延长生命～” “压乐胶囊”1粒见效，当天停服所有西药 6个月血压彻底稳定，并发症消失，实现终身停药。 “压乐胶囊”是目前世界上第一个纯生物制剂降压新品，独含的“红曲酵素”成分能调理心脑肝肾器官微循环，帮助血液进行重新分配，减少心脏压力，清除血液垃圾，软化血管，达到不让血压升起来的目的，修复受损心脑肝肾，达到源头治疗高血压的目的。 1粒见效，当天可停服降压西药，3—7天平稳血压 头痛，头晕，耳鸣，胸闷，乏力等症状逐渐改善，7天后，睡的香了，眩晕症状消失，脑供血不足，心肌缺血等症状明显好转，可减少服用量。 1个月内，逐渐减少“压乐胶囊”的服用量， 3天服一粒 血液流动越来越通畅，血压平稳，血脂，血粘度降低。高血压各项指标逐渐恢复正常，腿脚有力，精神好，脑中风、冠心病、心肌梗塞等危险解除。 6个月内，60%高血压患者可停掉“压乐胶囊” 随着患者心、脑、肝、肾器官得到全面修复，心脑肝肾功能恢复年轻态，血液分布完全正常，血液干净，血管有弹性，血压持续平稳，6个月内1期高血压患者达到临床治愈，即可停药。2期高血压患者只需5-10天服用1粒，即可保持血压持续平稳，冠心病、心绞痛等临床症状消失。3期高血压患者冠心病、心梗、中风后遗症得到良好治疗，2-3天服用1粒，不再担心血压高、心梗、中风反复发作，并发症恶化。 根源阻击高血压，不让血压升起来 全面逆转并发症，拯救心脑肝肾